Yöntem makalesi

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

DOI:

10.3791/53120

⸱

23 Kasım 2015

 ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Technology, Naval Research Laboratory, 2Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler arası iletişim, temel hücresel aktivitelerin sürdürülmesine yardımcı olan karmaşık bir sistemin ayrılmaz bir parçasıdır. Sonuç olarak, bu tür sinyallerin arızalanması birçok rahatsızlığa yol açabilir. Hücreden hücreye sinyalleşmeyi anlamak için, yerel ortamı rahatsız etmeden hücreden salgılanan moleküllerin uzamsal ve zamansal doğasını incelemek önemlidir. Protein sekresyonunu incelemek için çeşitli tahliller geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler tipik olarak ilgili sinyal yollarını bozan floresan problara dayanmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için etiketsiz bir teknik gereklidir.

Bu yazıda, tek bir hücreden protein salgılarını tespit edebilen etiketsiz bir lokalize yüzey plazmon rezonans görüntüleme (LSPRi) teknolojisinin üretimini ve uygulamasını açıklıyoruz. Plazmonik nanoyapılar, standart bir cam lamel üzerine litografik olarak desenlendirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilen ışık mikroskoplarında görünür ışık kullanılarak uyarılabilir. Lamelin sadece küçük bir kısmı nanoyapılar tarafından kaplanır ve bu nedenle bu teknik, floresan ve parlak alan görüntüleme gibi yaygın teknikleri birleştirmek için çok uygundur.

Bu protokolde, sensör nanofabrikasyonu ve müteakip biyoişlevselleştirme, ligand ve analitin bağlanma kinetiği karakterizasyonu, çip ve canlı hücrelerin entegrasyonu ve ölçülen sinyalin analizini içeren multidisipliner bir yaklaşım kullanılmaktadır. Bir bütün olarak, bu teknoloji, hücresel salgıları haritalamak ve bunları yakındaki hücrelerin tepkileriyle ilişkilendirmek için genel bir etiketsiz yaklaşım sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inter-hücresel iletişim içinde ve hücre dışında hem birçok fizyolojik faaliyetlerin düzenlenmesi için çok önemlidir. Proteinlerin ve veziküller çeşitli daha sonra, farklılaşma, yara iyileşmesi, bağışıklık tepkisi, göç ve proliferasyon gibi kompleks hücresel süreçleri tetikler salgılanabilir. Hücre içi sinyal yollarının 1-5 arızaları kanseri, ateroskleroz da dahil olmak üzere pek çok bozukluklarda implike edilmiştir ve diyabet, birkaç isim.

Optimum hücre salgılama tahlili mekansal ve zamansal olarak ilgili sinyalizasyon yolları bozmadan ilgi salgılanan proteini eşleme kapasitesine sahip olmalıdır. Bu şekilde, konsantrasyon profilinin ve alıcı hücrelerin tepki arasındaki nedensel ilişki anlaşılabilir. Ne yazık ki, en yaygın olarak kullanılan floresan bazlı tekniklerin birçoğu bu kriterlere uymayan. Floresan füzyon proteinleri w analiti etiketlemek için kullanılabilirhücreyi ithin ancak salgı yolu bozabilir veya salgılanan eğer, ölçmek zordur hücrenin dışında yaygın kızdırma sonuçları. Floresan immunosandwich bazlı deneyler, hücresel salgıları tespit etmek için en sık kullanılan teknikler, ancak, tipik olarak, tek tek hücrelerin izolasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, algılama antikoru verme tipik olarak durur veya deney ve antikor etiket büyüklüğü sona 6-11, 150 kDa IgG, aşağı sinyalizasyon bir engeldir.

Bu bariyerlerin bir etiket içermeyen bir teknik, görüntü proteini salgıları ve mevcut etiket içermeyen teknolojiler arasından kullanılan plazmon rezonans (SPR) yüzey lokalize yüzey plasmon rezonans (LSPR) sensörler iyi adaylardır tercih edilir çünkü. 12-17 Bu sensörleri yaygın proteinler, eksozom ve diğer biyo-analit bağlama çalışmaları için kullanılmıştır. 18-24 LSPR, plasmonik nanostr halindeuctures cam kapak slipleri lithographically desenli ve standart geniş alan mikroskopisi konfigürasyonlar yoluyla da görülebilir ışık kullanılarak heyecan edilebilir. Nedeniyle nano ayak izi, cam taban çoğunluğu 25-28. Böyle canlı hücre mikroskopi ile entegrasyon için uygun parlak alan ve iyi bu sondalar yapma floresan mikroskobu gibi yaygın görüntüleme teknikleri kullanılabilir Biz gerçek zamanlı ölçüm göstermiştir sırasıyla 225 msn ve 10 um, mekansal ve zamansal çözünürlükte Fonksiyonlu altın plasmonik nano kullanarak hibridoma hücrelerinden antikor sekresyonların. Temel çip konfigürasyonu Şekil 1 'de gösterilmiştir. 28 mikroskop çıkışı, ışık yolu görüntü için kullanılan bir CCD kamera ve nano belirli bir dizinin fraksiyonel doluluk (Şekil 2 nicel olarak belirlenmesi için bir fiber-optik açıdan bağlanmış spektrometre arasında bölünür ).

ProtocAynı anda standart aydınlık alan mikroskobu kullanarak hücrelerin tepkisini izlerken bu yazıda sunulan ol tek hücre salgılarının gerçek zamanlı ölçümü için deneysel tasarım açıklanır. Multidisipliner yaklaşım hücre çizgilerinin nano üretim, analitlerin yüksek afıniteli bağlanma için nano-fonksiyonalizasyonu, hem de non-spesifik bağlanma en aza indirilmesi ve ticari bir Yüzey Plazmon Rezonansı kullanarak hız sabitleri karakterize (SPR) enstrüman için bir yüzey optimizasyonu, entegrasyonu içerir substrat ve görüntü ve spektral verilerin analizi üzerine. Biz cep salgıları ve alıcı hücrelerle onların nedensel ilişkilerin uzay-zamansal haritalama için elverişli teknoloji olmak için bu tekniği tahmin ediyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nanoyapı Fabrikasyon

  1. Nano fabrikasyon için alt-tabakalar olarak 170 um (No. 1.5) yaklaşık bir kalınlığa sahip 25 mm çapında bir cam lamelleri seçin.
  2. En az 6 saat boyunca (bir sülfürik asit ve hidrojen peroksit 1 oranında 3) pirana çözeltisi içinde lamelleri bırakın. Ultra saf M 18.2 deiyonize saf su (DDW) bol miktarda piranha batırılmış lamel yıkayın.
    DİKKAT: Piranha asit, organik maddelerle reaksiyona girerek şiddetle ve son derece dikkatli ele alınmalıdır.
  3. E-ışın buharlaştırma yoluyla lamelleri Mevduat 10 nm krom ince film nanoyapıların örneklenmesinden ve görüntüleme sırasında şarj etkilerini önlemek için.
  4. Çift-katlı bir birinci tabaka 45 saniye boyunca 2000 rpm'de etil laktat, metil metakrilat (MMA_EL6) kopolimerden oluşan karşı Spin ve daha sonra 150 ° C'de pişirilir. Daha sonra 180 ° C'de fırında 45 saniye boyunca 3000 rpm'de poli-metil metakrilat (950PMMA_A2) ikinci katı dönerler.
  5. Pıtırtın iki tabakalı 300 uc / cm 2 'lik bir alan dozu ile 25 kV elektron demeti litografi (EBL) kullanarak direnmek. Izopropil alkol içinde geliştirir (IPA) / metil izobütil keton (MIBK): 01/02 ve IPA içinde durulayın.
  6. Mevduat Ti (5 nm) bir e-ışın buharlaştırıcı kullanılarak madde üzerinde / Au (80 nm) film.
  7. Altın birikimi ardından, kopolimer iki katmanlı 4 saat aseton substrat ıslatarak karşı kaldırın.
  8. Nanoyapı şekil ve boyutunu onaylamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile substrat inceleyin, oda sıcaklığında 60 saniye için CR-7 pürüzlendirici kullanarak ıslak etch yoluyla yüzeye kalan krom kaldırın ve sonra DDW içinde durulayın.
  9. Dizileri arasında hücre görüntüleme için odayı terk 33 mikron merkezden merkeze dizi aralığı tasarlayın. Desen bir e-ışın yazıcı kullanarak 300 nm sahada her dizi için 20 x 20 desen nanoyapılar. Her çip 80 ± 2.5 nm yüksekliğinde tipik bir nanoyapı boyutunda 300 diziler ve 70 ± 2.5 nm Diame içeriyorter.
  10. Boyut ve bütünlükte doğrulanması için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak dizilerin bir alt kümesini kontrol edin.
  11. UV kürleme epoksi kullanılarak lamel arkasına bir destek halkası, tipik olarak silikon takın.

2. Chip Temizlik ve Öz-montajlı Monolayer Uygulaması

  1. % 5 hidrojen, aynı koşullar altında 5 dakika boyunca temizleme odası sonra 45 saniye için% 95 bir argon 300 mTorr karışımı içinde 40 W bir güçte, temizlik ve fiş rejenere plazma kül için.
  2. 3 aşağıdakilerden oluşan iki bileşenli bir etanolik çözelti içinde tiol çip daldırarak hemen plazma külleme sonra, altın nano işlerlik: (CH2) SH- 1 oranında 8 -örn 3-OH (DPT) ve ya bir amin ile, bir bileşen, veya karboksil fonksiyonel grup, yani, SH- (CH2) 11 -örn 3-NH2 (spn) ya da SH- (CH2) 11 -örn 3-COOH (SPC).
  3. Chip i bırakınn tiol Çözelti O / N kendinden monte tek tabaka (SAM) oluşturulması için.
  4. Azot gazı ile etanol ve kuru ile çip durulayın.
  5. Gerekirse, 4 ° C 'de en fazla 2 hafta içinde işlevselleştirilmiş çip saklayın.
  6. Kullanıma hazır tercih ligand bağlı olarak kimyası kullanılarak bir ligant ile SPN'sini ya SPC bileşenini reaksiyona girerek (bakınız aşağıda).
    Not: cips yeniden ve zaman yeniden Fonksiyonlu onlarca olabilir. Belirli bir çip 6 ay bir yıl boyunca değişir dönemler için de kullanılabilir. Belirli bir dizide ölçülen spektrumları güvenilir biofunctionalization ardından plazma külleme tarafından tekrarlanan Rejenerasyonlarda, sonra yeniden üretilir. 29

3. Yüzey Fonksiyonlandırma ve Kinetik Karakterizasyonu

Not: ligand ve analit arasındaki kinetik hız sabitlerini karakterize ticari SPR enstrüman fonksiyonlandırılmış çip kullanın, hem de non-spesifik b SAM direncini incelemek içinINDING. Verimli yüzey işlevsellik izin akış oranları ve mikroakışkan tasarımları geniş bir yelpazesi var. Biz piyasada mevcut SPR beri biz onun tavsiye debileri etrafında standardize. Biz, bu akış hızı, tüm SPR araçlarının tipiktir ve bu nedenle sınırlayıcı değildir olduğuna dikkat edilmelidir. Tüm fonksiyonlandırmalar LSPR yonga üzerinde doğrudan yapılabilir, ancak bir mültipleksli araçtır çünkü bizim LSPR mikroakışkan kurulum değil oysa bizim iş yükünü azaltmak yoktu çünkü SPR enstrüman bir zorunluluk değildir.

  1. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi SAM ticari bir çıplak altın çip işlevselleştirilmesi.
  2. 133 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid mM (EDC) ve 33 DDW içinde N-hidroksisukinimid mM (NHS) için 10: 1 karışımı SPC göre SAM kullanılıyorsa, bir 1 karboksil grubunu aktive Min.
  3. 30 ul / dk'lık bir akış oranı kullanılarak 300 sn için ilgili antikor / ligand ile aktive edilmiş karboksil grubunu eşleniği. Ligantlar hazırlayınpH 6 fosfat tamponu, tipik olarak, ancak bu molekülün bağlı olarak değişebilir.
  4. Ligand konjüge edilmesinden sonra, 30 ul / dk'lık bir hızda 300 saniye süreyle bir deaktivatör adım olarak, fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde 0.1 M etanolamin akar. Etanolamin spesifik olmayan bağlanma minimize yardımcı olur.
  5. Konsantrasyon aralığı kullanılarak 100 ul / dakikalık bir akış hızında ilgi analiti tanıtılması ve kinetik analiz yazılımı kullanılarak kinetik hız sabitleri hesaplar.
  6. Spesifik olmayan bağlanma, sorunlu ise, SPC veya SPN'sine DPT oranını arttırır.

4. LSPR Genel Ayarlar

  1. Mikroskop ayarları:
    1. Numuneyi aydınlatmak Koehler bir 100 W Halojen lamba kullanın. Rezonans kayması (Şekil 2) katkıda yok dalga boylarını ortadan kaldırmak için ışık yolu uzun bir pas filtresi (genellikle 593 nm kesme) kullanın.
    2. LSPRi veri toplama için, 40X yağ immersio bir ters mikroskop kullanmakn hedefi (1.4 NA) ve bir thermoelectrically 16 bit CCD kamera soğutmalı.
    3. Aynı anda Görüntülerini ve spektrumları elde etmek için mikroskop çıkış portuna bir ışın ayırıcı yerleştirin.
    4. 37 sıcaklık kontrollü mikroskop sahne C ° ve 4 saat için dengelenmeye.
    5. Sırasıyla% 5 ve% 95 CO 2 konsantrasyonu ve nem düzenleyen mikroskop ek kuluçka düzeneğini birleştirin.
  2. Chip hazırlanması ve montajı:
    1. SPR deneylerden belirlenen en uygun iki bileşenli SAM oranları, Bölüm 2 de tarif edildiği gibi LSPR çip işlevselleştirilmesi.
    2. Aşağıdaki gibi bir ısmarlama mikroakışkan tutucu içinde çip yükleyin. Bir alüminyum alt parçası üzerinde çipi yerleştirin. Bu alt parçası ve silikon conta ve şeffaf plastik üst parça arasındaki çip Sandwich. Derleme kelepçe 4 vidayı kullanın.
    3. 1 karışımı: Tipik bir SPC-tabanlı tiyol uygulaması için, bir 1 ul kat 300 damlaEDC 133 mM ve DDW NHS 33 mM Ture SPC tiyol bileşeninin karboksil grupları etkinleştirmek için.
    4. 10 dakika bekleyin ve elle 10 mM PBS ile yüzey durulama.
    5. Ligand çözeltisi 300 ul kaplama damla ilgi ligandı (tipik haliyle bir antikor ya da antikor fragmanı) ile aktive karboksil grubuna bağı içerir.
    6. 30 dakika bekleyin ve elle 10 mM PBS ile durulayın.
    7. Spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bir çip üzerinde kat PBS içinde 0.1 M etanolamin 300 ul bırakın. 10 dakika boyunca bekleyin.
    8. PBS% 0.005 Tween 20 (PBS-T20) içeren etanolamin yıkayın.
    9. Değişen menisküs ilgili verilerin dalgalanmaları azaltmak için çip üzerinde bir kuvars parçası yerleştirin.
    10. Mikroskop monte ederken PBS-T20 tamponu ile ıslak çip tutun.
    11. Isıtmalı sahne numune tutucu içine sıkıca LSPR yonga takımını yerleştirin ve mikroakışkan tüp takın.
    12. Montaj ve akış met Mikroakiskan boru takınffer (veya hücre çalışmaları için serum özgür medya) kararlı bir duruma gelene kadar ulaşılır.
    13. Montaj ve mikroskop, en az 2 saat boyunca dengelenmeye bırakın.
    14. Merkez dizi spektroskopisi için fiber optik ile aynı hizada olacak şekilde joystick'i kullanarak çip hizalayın. Spektroskopik veri bir spektrometre ve spektral analiz yazılımı kullanılarak alınır.
    15. Yazılım otofokus, Zeiss Kesin Odaklama veya eşdeğer otofokus aygıtı kullanarak deney boyunca odak dizileri tutun.

9E10 hibridoma hücrelerinden anti-c-myc Salgıları 5. LSPR Görüntüleme

Not: Bu çalışma için kullanılan hibridoma hücre çizgisi, bir kimyasal tetikleyici gerektirmeyen yapısal olarak ve bu nedenle anti-c-myc antikoru eksprese

  1. C-myc peptidi ile nano işlerlik. Bu klon 9E10 hibridoma hücreleri tarafından salgılanan bir anti-c-myc antikorları için 1.77 nM'lik bir KD değerine sahiptir.
  2. Kültür tamamlandıktan hibridoma hücreleri% 5 CO2 altında 37 ° C 'de T75 şişesi içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik e büyüme ortamı. / Ml 4 x 10 5 hücre bir hücre yoğunluğuna koruyun.
  3. Hücre salgılama çalışmaları için, santrifüj ile T75 şişesi pelet hücreleri, salgılanan antikorların çıkarın ve 4 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğunu ayarlamak için RPMI-1640 serumsuz vasat (SFM) ile iki kez yıkanır.
  4. LSPR cips onları tanıtan önce canlılığı hücreleri ve testi Hasat.
  5. Elle mikropipet ile LSPR cips üzerine hücre solüsyonu 50 ul tanıtın. Birkaç dakika sonra 25 ila 50 hücre LSPR fiş yüzeyine yapışır.
  6. Mikroakışkan perfüzyon sistemi kullanılarak taze SFM ile çözelti içinde kalan hücrelerin silsin.
  7. 10 mikron içinde yakın görüntüleme için LSPR diziler, seçin, ancak hücreleri ile örtüşmeyen.
  8. Sinyal salgılanan bir anti-c-myc antib özgü sağlamakOdies ve mevcut antikorlar olmayan ve antikorlar ile, ancak çözelti içinde, c-myc peptid ile doyurucu bir konsantrasyonu varlığı ile bloke bağlanma siteleri ile hücre kültür ortamı getirmektedir.
  9. Anti-c-myc antikorları (250 nM) ile doyurucu bir çözeltisi, her çalışma sonunda sensörler kalibre edin. Bu her çalışma biofunctionalization profiline göre fraksiyonel doluluk sensörleri yanıtını normale yardımcı olur ve belirler.
  10. Görüntü hizalama yazılımı kullanarak X ve Y yönünde sürüklenme düzeltin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tipik bir canlı hücre salgı çalışmasında yer alan veri toplama birden modları vardır. 3 kare diziler vurgular bir LSPRi görüntü bir bindirme göstermektedir, ve alt sol tarafındaki hücreyi vurgular iletilen ışık aydınlatılmış görüntü. Veriler, tipik olarak aşağıda tarif edilen normalleştirme hesaplanması için analit ile doyurucu bir çözüm getirilmesi ve ardından 3 saatlik bir süre boyunca toplanır. Floresan görüntüleri de bir filtre küp otomatik geçiş yoluyla veri toplama rutin entegre edilebilir. Şekil 4 floresan membran boya rodamin DHPE ile boyanmış bir hücre içinde lamellipodia benzeri uzantıları (oklar) sergiler. Böyle uzantıları dizileri ile üst üste olsaydı onlar protein salgılaması için yanlış pozitif verecekti. Görüntülerinin birden fazla modları olması gibi olaylar belirlemenize yardımcı olabilir.

Şekil 5 spektrometresi önce verileri ve kıç gösterirer satüre solüsyonunun koyulmasını ticari olarak c-myc fonksiyonalize diziler anti-c-myc antikorları satın alınan (400 nM). Resim hücreleri bu deneyde yer aldı. Spektrum kırmızı shift ve yoğunluğunda bir artış, hem görüntüler. İki eğri altındaki alanlar arasındaki fark CCD kamerada LSPRi modunda dizi görüntü yoğunluğunda bir artışa neden olur. Bir doğrusal olmayan en küçük kareler analizi yaklaşımı spektrumdan yüzeye bağlı ligandların fraksiyonel doluluk sonucuna geliştirilmiştir. 30,31

Deneyin sonunda, doymuş yoğunluk değerlerinin (fraksiyonel doluluk ≈ 1 örneğin) aşağıdaki formülü kullanarak her bir dizi için normalleştirilmiş bir yanıt hesaplamak için kullanılmıştır:

Zaman noktası t zaman noktasında t normalize şiddeti, deney, nihai doymuş yoğunluğu başında ilk şiddeti ve dizinin ölçülen yoğunluğu nerede

Iki dizi ile ilgili normalize değerleri Şekil 6'da gösterilmiştir. Bir dizi, bir kontrol olarak kullanılmıştır, diğer ise araştırılmaktadır hücrenin 10 um içinde olduğu hücreden 130 um'lik bir mesafe vardı. Kontrol dizisi düz yanıt hücre nisbetle en yakın dizinin normalize cevap ani artış, salgılanan antikorların lokalize bir patlamasının bir göstergesidir.

figure-results-1
1. Sensör Tasarımı Şekil. Tipik bir canlı hücre salgılanması deneyi geometrisini tasvir. Hücre (mavi sfero) bir çizim biofunctionalized altın nano dizileri içerir LSPR çip üzerine yatırılır. Yüzeye bağlanan Y-şekilli moleküller olarak gösterilen bu durumda antikorlar yakınlaştırılmış görünümü, ilgi hücre salgılanması olarak ölçülürfonksiyonlandırılmış nanoyapıların. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Optik Kur. Bir halojen lambadan gelen ışık aydınlatılmış ilk uzun geçiş filtresi (LP) tarafından filtre edilir. Işık doğrusal (P1) polarize ve 40X / 1.4 NA objektif yoluyla numune aydınlatır edilir. Dağınık ışık bir çapraz polarize (P2) yoluyla objektif ile toplanır ve geçirilir. A 50/50 ışın ayırıcı (BS) eşzamanlı spektroskopik ve görüntülerinin analizi için toplanan ışık yoluna sokulur. Sağ Üst:. 300 nm sahada ayrılmış 9 ayrı nanoyapıların bir atomik kuvvet mikroskopisi görüntü tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

figure-results-3
Şekil 3. Canlı Hücre LSPRi Çalışması. A 12 diziler çevrili tek bir hibridoma hücre (sol alt) gösteren iletilen ışık ve LSPRi görüntü birleşti. Bu kontrastlı görüntü. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4. Canlı Hücre Floresan Çalışması. Bir zar boya olan rhodamine DHPE, lekeli bir tek hibridoma hücresinin bir floresan sahte renkli görüntü. Diziler genellikle görünmeyen floresan görüntüleme modunda ise, yakındaki bir dizi ab burada gözlemlenebilirsağ alt köşedeki kare yoksundur. Hücre hücreleri (oklar) dışarı doğru uzanan dokunacı benzeri uzantıları (muhtemelen filopodia ya lamellipodia), ancak bir dizi ayrılmış olması görülebilir. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5. Spektral Şekli. Öncesinde ve anti-c-myc antikor 400 nM çözeltisinin giriş sonra c-myc işlevselleştirilmiş diziden elde edilen spektrumlar. Hiçbir hücreleri bu çalışmada hazır bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-6 Şekil 6. Tek Hücre salgılanması. 15, tek bir hücrenin um ve 130 mikron uzaklıkta bulunan bir (Kontrol) içinde bulunan bir dizi tepki. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada açıklanan LSPR görüntüleme tekniğinin, hücre salgılarını tespit etmek için daha geleneksel metodolojilere göre çok sayıda avantajı vardır. Birincisi, tekniğimizin zaman çözünürlüğü saniyeler mertebesindeyken, EliSpot olarak bilinen bir immünosand testi olan ticari alternatif, 2 ila 3 günlük tipik bir zaman çözünürlüğüne sahiptir. 7,32 Sonuç olarak, Şekil 6'da gösterilenler gibi protein salgılama hızındaki ani değişiklikleri çözebildik. İkincisi, çip üzerine dağıtılmış dizilere sahip olmak, salgılanan sinyalin uzay ve zamanda izlenmesine olanak tanır ve bu da difüzyona dayalı hücre salgısı modelleriyle daha titiz karşılaştırmalara olanak tanır. Ek olarak, Şekil 6'da gösterilen kontrol dizisi gibi diziler, görüntüde tipik olarak odak kayması gibi araçsal faktörlerden kaynaklanan genel değişiklikleri çıkarmak için kullanılabilir. Üçüncüsü, tekniğimiz hücrelerde herhangi bir değişiklik gerektirmez. İstenirse, deney, floresan proteinler gibi yaygın olarak kullanılan etiketleri içerebilir, ancak bu tür etiketlerin hücre canlılığını veya homeostazını olumsuz etkileyebileceğine dair endişeler varsa, yaklaşımımızın etiketsiz doğası bunları gerektirmez. Dördüncüsü, spektroskopik verileri kullanarak, yüzeye bağlı ligandların fraksiyonel doluluğuna ilişkin nicel bilgilerin hesaplanabileceğini gösterdik.

Metalik nanopartiküllerin üretilmesi için EBL'ye çok sayıda alternatif yöntem vardır. Bununla birlikte, EBL'nin, incelenen optiklere ve hücrelere en iyi şekilde uyacak şekilde nanoyapı ve dizi boyutlarını optimize etmek için önemli ölçüde esneklik sağladığını bulduk. Ayrıca çiplerin plazma külleme yoluyla kolayca yeniden üretilebilmesi de kritik öneme sahiptir. Bu sayede tipik bir çip onlarca kez kullanılabilir. Biyoişlevselleştirme detayları, spesifik uygulama için değiştirilmelidir. Burada sunulan protokol, yüzeyi nispeten küçük c-myc peptit ligandları ile konjuge etti. Tam antikorlar gibi daha büyük ligandlar tipik olarak daha fazla boşluk ve dolayısıyla daha yüksek bir SPO/SPN/SPC oranı gerektirir. Ne olursa olsun, canlı hücre deneylerinde spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için iyi oluşturulmuş bir SAM katmanı gereklidir. Genel olarak, daha büyük moleküler ağırlıklı analitler LSPR tarafından daha kolay tespit edilir. Bu nedenle, tek hücreli tezahüründe bu teknik, sitokinler gibi küçük proteinlerin salgılanmasını tespit etmek için uygun olmayabilir.

Mevcut kurulum, bireysel yapışık olmayan hücreleri incelemek için kullanılmıştır. Bu çalışmada bildirilen sonuçların doğrudan uygulanabilir olduğu önemli sayıda salgılanan sinyal proteini ve vezikül vardır. Örneğin, onlarca yıldır kanser için tanısal bir belirteç olan karsinoembriyonik antijen (CEA). Kolon kanseri hücrelerinin binlerce molekül/hücre/saat hızında CEA salgıladığı bilinmektedir ve moleküler ağırlığı 180 kDa'dır ve bu da IgG antikorlarınınkini aşmaktadır. CEA'nın otokrin ve parakrin sinyal yollarında yer aldığına inanılmaktadır, ancak bu sekresyonların uzay-zamansal doğası hiçbir zaman ölçülmemiştir. Tekniğimiz bu sinyal sorularını doğrudan ele alabilir. Bu çalışmanın bir uzantısı, tek hücrelerden CEA salgılanmasının uzay-zamansal doğasını ölçmek olacaktır. 33 Gelecekteki çalışmalar, LSPRi'yi yapışık hücrelerin iki ve üç boyutlu hücre kültürleriyle entegre etmeye de odaklanacaktır. Bir dizi salgılanan proteini paralel olarak tespit edebilen çoğullanmış dizileri içeren bu teknik, hücre salgılarına ve bunların komşu hücreleri nasıl etkilediğine yeni bir pencere açma potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yararlı yorumlar ve tartışmalar için George Anderson'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Deniz Araştırma Laboratuvarı Nanobilim Enstitüsü ve Ulusal Araştırma Konseyi Araştırma Ortaklığı Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
25  mm çaplı cam lamellerBioscience Tools CSHP-No1.5-25ve nbsp; 170 & plusmn; 5 ve mikro; m optimaldir
Poli-metil metakrilatMicrochemPMMA 950 A4
Etil laktat metil metakrilatMicrochemMMA EL6
Elektron ışını evaporatörüTemescalFC-2000
Elektron ışını litografisiRaithSerisi 150
EtanolSigma-Aldrich459836
AsetonSigma-Aldrich320110
CR-7 krom aşındırıcıCyantekCR-7
Taramalı elektron mikroskobuZeissUltra 55
Atomik kuvvet mikroskobuVeecoNanoskop III
Plazma külleme sistemiTeknikler Serisi85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)ProchimiaTH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)ProchimiaTH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)ProchimiaTH 002-m11.n3-0.2
Yüzey plazmon rezonans sistemiBioradXPR36
Çıplak altın çipBioradGLC çipiTek tabakayı çıkarmak için plazma küllü
1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimidThermo22980
N< / em>-hidroksisüksinimid (NHS)Thermo24510
Pentilamin-Biotin         Thermo21345
EtanolaminSigma-AldrichE9508
NeutraavidinThermo31000
Fosfat tamponlu salinThermo28374
Tween 20Sigma-AldrichP2287
Ters mikroskopZeissAxio ObserverMikroskop 40X yağa daldırma objektifi ile donatılmıştır; Pecon GmbH'den CO2 ve nem inkübasyonu
CCD kameraHamamatsuOrca R2Termoelektrik soğutmalı (16 bit)
SpektrometreOkyanus OptiğiQE65Pro
SpectrasuiteOkyanus Optiğiversiyon1.4
c-myc peptit HyNic EtiketiSolulinkSP-E003
monoklonal anti-c-myc antikoruSigma-AldrichM4439
Hibridoma hücre hattıATCCCRL-1729
Antibiyotik Antimikotik Çözeltisi (100 kez;)Sigma-AldrichA5955
Serum ücretsiz ortam RPMI 1640 Canlandırıcı  11835-030 
Fetal sığır serumuATCC30-2020
Rhodamine DHPEYaşam TeknolojileriL-1392
, , : ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yerelle tirilmi Y zey Plazmon Rezonans G r nt lemeLSPRi TeknolojisiAlt n Plazmonik Nanosens rlerKendi Kendine D zenlenen MonotabakaLigand Fonksiyonelle tirmeMikroak kan EntegrasyonuUzamsal Zamansal HaritalamaProtein Salg Tespiti

İlgili makaleler