Yöntem makalesi

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

31.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53124

⸱

29 Ekim 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

Bu makalede

Özet

Burada, yeni antiviral ajanları tanımlamak ve değerlendirmek için viral girişin belirli adımlarını inceleyen bir protokol sunuyoruz.

Özet

Hücre tabanlı sistemler, antiviral ajanları keşfetmek için kullanışlıdır. Viral yaşam döngüsünün, özellikle erken giriş aşamalarının incelenmesi, viral girişin belirli adımlarını hedefleyen antiviral ajanların tanımlanması ve değerlendirilmesi için mekanik bir yaklaşıma izin verir. Bu raporda, hepatit C virüsü model alınarak, viral inaktivasyon, viral bağlanma ve viral giriş/füzyonun bu tür amaçlar için antiviral testler olarak incelenmesi yöntemleri anlatılmıştır. Bu tahliller, erken viral girişe yönelik yeni antagonistleri/inhibitörleri keşfetmek için yararlı olmalı ve daha ileri ilaç geliştirme için aday antiviral ajanların kapsamını genişletmeye yardımcı olmalıdır.

Giriş

Viral enfeksiyonlar halk sağlığı için sürekli bir tehdittir ve dünya çapında salgın hastalıkların, morbiditenin ve ölümlerin önemli bir nedenidir. Viral enfeksiyonlara karşı spesifik kontrol modları arasında aşı geliştirme ve antiviral tedaviler yer alır. Aşı çabalarının çeşitli virüslere karşı bağışıklamada başarılı olduğu kanıtlanmış olsa da, dang virüsü (DENV), insan sitomegalovirüsü (HCMV), hepatit C virüsü (HCV), insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve solunum sinsityal virüsü (RSV) dahil olmak üzere birçok viral patojen koruyucu bir aşıdan yoksun kalmaktadır1-5. Öte yandan antiviraller, profilaktik aşıların mevcut olmadığı durumlarda bu viral enfeksiyonların yönetimi için önemli bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, bugüne kadar, halk sağlığını tehdit eden viral patojenlerin sayısına kıyasla çok az sayıda lisanslı ve uygun maliyetli antiviral ilaç mevcuttur. Daha da önemlisi, küresel seyahatteki artış ve hızlı kentleşme nedeniyle, durum, yerli olmayan bölgelere sokulan ortaya çıkan/yeniden ortaya çıkan viral enfeksiyonlardan kaynaklanan salgın salgın riskleri ile daha da kötüleşmektedir6. Şiddetli akut solunum sendromu (SARS) virüsü, influenza virüsleri (H1N1, H5N1, H3N2 ve H7N9), DENV, Batı Nil virüsü (WNV), kızamık virüsü (MV), Orta Doğu Solunum Sendromu (MERS) virüsü ve Ebola virüsü6-12'nin neden olduğu son salgınlar, bağışıklama ve/veya terapötiklerin bulunmadığı durumlarda antiviral geliştirme ihtiyacını yansıtan örnekler arasındadır. Ek olarak, şu anda kullanılan antivirallerle ilaca dirençli enfeksiyonlar oluşturma riski her zaman vardır. Bu nedenle, daha iyi yönetim stratejileri sağlamak ve halk sağlığını korumak için bu ortaya çıkan/yeniden ortaya çıkan viral enfeksiyonlara karşı antivirallerin kapsamının sürekli geliştirilmesi ve genişletilmesi gereklidir.

Çoğu antiviral tedavi, viral yaşam döngüsündeki önemli adımlara aracılık eden spesifik bir viral proteini veya kofaktörü hedef alan doğrudan etkili antivirallerden (DEA'lar) oluşur. Örneğin, nükleosit analogu Asiklovir, herpesvirüs DNA polimerazını inhibe eder, proteaz inhibitörleri Boceprevir ve Telaprevir, HCV NS3'ü antagonize eder ve Oseltamivir ve Zanamivir, enfekte olmuş hücrelerden13-15 influenza virüsü partiküllerinin salınmasını bloke eden nöraminidaz inhibitörleridir. Bununla birlikte, füzyonu önlemek için HIV gp41'i hedef alan Enfuvirtide ve HIV ko-reseptörü CCR5'i bloke eden ve böylece viral girişiönleyen Maraviroc dahil olmak üzere çok az lisanslı viral giriş inhibitörü vardır 16. Viral girişe karşı yeni antagonistlerin / inhibitörlerin araştırılması, viral enfeksiyonları daha iyi yönetmek için farklı bir etki mekanizmasına sahip diğer antivirallerle kombinasyon gibi profilaktik veya terapötik kullanım için ek terapötiklerin sağlanmasına yardımcı olabilir17-19.

Antivirallerin tanımlanması, yapı güdümlü ilaç tasarımını ve aday ilaç taramasına dayalı stratejiyi içerebilir. Test ajanlarının antiviral aktivitesini değerlendirme yöntemleri, enzimatik aktivitenin biyokimyasal analizlerini ve hücre bazlı sistemler20-23 tarafından değerlendirmeyi içerir. Hücre bazlı sistemlerde, viral yaşam döngüsü, giriş olayları (bağlanma, füzyon, kılıfın açılması), replikasyon fazı (viral genom replikasyonu ve protein translasyonu) ve virion çıkışı (montaj, olgunlaşma ve serbest bırakma) gibi farklı enfeksiyon aşamalarına ayrılabilir. Tahliller, çeşitli araçlar ve yöntemler kullanılarak her bir spesifik aşamayı araştırmak için uyarlanabildiğinden, bu yaklaşım, analiz edilen farklı aşamayı hedefleyen belirli bir etki mekanizması ile potansiyel aday antivirallerin tanımlanmasına/incelenmesine olanak tanır. Örneğin, konakçı hücreye bağlanmadan önce özellikle serbest virüs partikülleri üzerindeki ilaç etkisini analiz etmek için bir 'viral inaktivasyon testi' gerçekleştirilebilir. Bu tahlilde, virüsün test ilacı ile inkübe edilmesine izin verilir ve daha sonra bir hücre tek tabakasını enfekte etmeden önce ilacı titre etmek için seyreltilir. Viral bağlanma ve giriş/füzyon aşamaları gibi ek adımlar, enfeksiyon sırasında sıcaklığın kaydırılmasıyla ayrı ayrı analiz edilebilir. Birçok zarflı virüs için, konak hücre zarındaki viral giriş / füzyon 37 ° C'de büyük ölçüde kolaylaştırılır, ancak tipik olarak 4 ° C'de engellenir ve bu da virüs bağlanmasınıetkilemez 24-29. Son olarak, raportör virüslerin veya hücre sistemlerinin kullanılması bu çalışmaları kolaylaştırabilir ve yüksek verimli bir analize izin verebilir.

Daha önce hücre tabanlı yaklaşımı kullandık ve viral girişi potansiyel olarak antagonize eden antiviral bileşiklerin incelenmesi için çeşitli zarflı virüslerin erken girişini inceledik30,31. Burada, viral inaktivasyon, viral bağlanma ve viral giriş/füzyon testleri dahil olmak üzere kullanılan çeşitli yöntemler açıklanmaktadır.

Protokol

Not: hücre kültürü ve virüs enfeksiyonu ile ilgili tüm prosedürler işlenen örneklerin biyogüvenlik düzeyi için uygun olan sertifikalı biyogüvenlik davlumbaz yapılan emin olun. Protokolleri tarif edilmesi amacıyla, Gaussia lusiferaz raportör-etiketli HCV model virüs 32 olarak kullanılır. Temsili sonuçlar bağlamında bileşikler chebulagic asit (chlA) ve punicalagin (PUG) 31 adım erken viral girişi sırasında, hücre yüzeyi glikozaminoglikanların viral glikoprotein etkileşimleri hedef aday antiviral olarak kullanılır. Birçok virüs 30,31,33,34 girişi ile müdahale edilmesi bilinmektedir Heparin, bu bağlamda, bir pozitif kontrol tedavisi olarak kullanılır. Temel viroloji teknikleri arka plan, virüslerinin üretilmesi ile, virüs titresinin belirlenmesi ve plak oluşturucu birim enfeksiyöz doz (PFU) ekspresyonu için, oluşturucu birim (FFU) ya da enfeksiyon (MOI) çokluğu odak okuyucu yeniden olduğu35 referans yönlendirildiler. Önceki örnekler ve temsili sonuçlarda görüldüğü virüs için kullanılan optimum koşullar için okuyucu Tablo 1, Şekil 1A ve Şekil 2A'da yer alan referanslar 30-32,36-39 ve detayları adlandırılır.

1. Hücre Kültürü, Bileşik Hazırlama ve Bileşim Sitotoksisite

  1. Virüs enfeksiyonu sistemi için ilgili hücre hattı büyütün (Tablo 1) analiz edilecek. HCV için, Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM), 200 U / ml penisilin G, 200 ug / ml streptomisin içinde Huh-7,5 hücrelerin büyümesine ve 0,5 ug / ml amfoterisin B
  2. Kendi çözücüler kullanılarak Test bileşikleri ve kontroller hazırlayın: örneğin, chlA ve dimetil sülfoksit içinde PUG (DMSO) çözülür; Steril çifte damıtılmış su içinde heparin hazırlar. Sonraki tüm seyreltilerde için, kültür ortamı kullanın.
    Not: Son concentTest bileşiği, tedavi DMSO oranı deneylerde% 1'den az olduğu; % 1 DMSO karşılaştırma deneylerinde, bir negatif kontrol tedavisi olarak dahil edilir.
  3. Örneğin XTT olarak reaktif belirleyici hücre canlılığı ile viral enfeksiyon için hücreler üzerinde test bileşiklerinin (örneğin, chlA ve PUG) sitotoksisitesini belirlemek (2,3-bis [2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil] -5-fenilamino) -karbonil] -2H-tetrazolyum hidroksit):
    1. HCV için, bir 96-çukurlu plaka içinde Huh-7,5 hücreler (çukur başına 1 x 10 4 hücreleri) tohum ve bir tek tabaka elde etmek üzere% 5 CO2 inkübatöründe O / N 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Üç kopya halinde kültür çukurlarına DMSO kontrolü (% 1) ya da test bileşimleri chlA ve PUG artan konsantrasyonlarda (ör., 0, 10, 50, 100 ve 500 uM) uygulayın.
    3. Daha sonra, 72 saat süre ile 37 ° C'de inkübe plaka içinde orta atmak ve iki kez fosfat tamponlu tuzlu su içinde 200 ul (PBS) hücreleri yıkayın.
    4. Assayin 100 ul ekleg her oyuğa XTT tabanlı in vitro toksisite deneyi kiti çözeltisi ve XTT formazan üretimini sağlamak için, başka bir 3 saat daha 37 ° C'de inkübe edin.
    5. 492 nm dalga boyunda bir test bir mikroplaka okuyucu ve 690 nm'lik bir referans dalga boyu ile absorbans belirler.
    6. . Test bileşiklerinin absorbans ve solvent kontrolü bakın (ex% 1 DMSO 'gibi'% 100 'At' × gibi / hücre canlılığı (%) At = ve aşağıdaki formül kullanılarak hücrelerin hayatta yüzdesini hesaplayın sırasıyla) tedaviler. Üreticinin protokolüne göre olan, GraphPad Prizmasında gibi bir analitik yazılım test bileşikleri% 50 hücresel sitotoksisite (CC 50) konsantrasyonunu belirler.

Viral Enfeksiyon 2. Saati

Not: viral enfeksiyonun okuma kullanılan virüs sistemine bağlıdır ve plak tahlilleri ya da mea gibi yöntemleri içerebilirmuhabir-etiketli virüslerden muhabiri sinyalleri suring. Lusiferaz raportör etkinliği göre muhabir-HCV enfeksiyonunu belirlemek için bir yöntem aşağıda tarif edilmektedir.

  1. Enfekte kuyulardan süpernatantlar toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 17,000 xg'de belirler.
  2. Gaussia lusiferaz deney kiti lusiferaz alt-tabaka, 50 ul test süpernatan 20 ul karıştırın ve, imalatçı firmanın talimatlarına göre, bir lüminometre ile ölçün.
  3. Üreticinin protokolüne göre, GraphPad Prism yazılımı algoritmaları kullanarak, HCV enfeksiyonuna karşı test bileşiklerinin% 50 etkili konsantrasyon (EC 50), viral inhibisyon (%) belirlemek için, nispi ışık birimleri (RLU) log 10 olarak, HCV enfektivitesini ifade edebilir ve hesaplar.

3. Viral İnaktivasyonu Testi

Not: Çeşitli virüsler için kuluçka süresi örnek olarak ve viral dozunŞekil 1A listelenen yeniden. Virüsün yüksek konsantrasyonlar da MOI / PFU artırarak test edilebilir.

  1. Tohum Huh-7,5, 96-çukurlu plaka içindeki hücreler (oyuk başına 1 x 10 4 hücreler) ve bir tek tabaka elde etmek üzere bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de O / N inkübe edin.
  2. Test bileşikleri veya kontroller inkübe (nihai konsantrasyonlar: chlA = 50 uM; PUG = 50 uM; heparin = 1000 ug / ml; DMSO =% 1) 37 ° C (Şekil 1A HCV partikülleri ile, Uzun Vadeli ' ) bir 1: 1 oranında elde edildi. Örneğin, 1 x 10 4 FFU ihtiva eden bir 100 ul virüs aşı için bir 100 uM chlA çalışma seyreltme 100 ul; Bu 50 uM'lik nihai bir konsantrasyonda chlA tedavi verir.
  3. Virüs-ilaç karışımı test bileşiklerinin için "alt terapötik" (etkisiz) konsantrasyonu sulandırmak. Örneğin, HCV karşı chlA ve PUG etkisiz konsantrasyonu 1 mcM 31 olan; bu nedenleBu (% 2 FBS ile hücre kültürü ortamı) bazal ortam içinde 9.8 ml ile gerçekleştirilebilir virüs ilaç karışımı bir 50-kat seyreltme gerektirir.
    Not: alt terapötik konsantrasyonuna seyreltme test bileşikleri ve konak hücre yüzeyi arasında önemli bir etkileşim önler ve hücre içermeyen viryonları üzerindeki tedavi etkisinin incelenmesine olanak tanır. Bu seyreltme, özellikle viral enfeksiyona karşı test bileşiklerinin anti-viral doz yanıtı bağlıdır, ve bu belirli tahlil 31 gerçekleştirmeden önce belirlenir unutmayın.
  4. Karşılaştırma için, test bileşikleri ile virüs karışımı hemen alt terapötik konsantrasyonu enfeksiyon öncesinde (Şekil 1A 'Kısa Dönem') ila (inkübasyon süresi) seyreltin.
  5. Ve viral izin vermek için 37 ° C'de 3 saat süreyle inkübe edilir, Huh-7,5 hücre mono tabakasında üzerine seyreltilmiş HCV ilaç karışımı, 100 ul ilave edin (nihai MOI = 0,01 virüs miktarı 1 x 10 2 FFU şimdi de)adsorpsiyon.
  6. Enfeksiyonu takiben, seyreltilmiş inokulum çıkarıp hafifçe iki kez 200 ul PBS ile kuyu yıkayın.
    Not: hücrelerini kaldırarak önlemek için hafifçe yıkar gerçekleştirin.
  7. Her bir oyuğa bazal ortam 100 ul uygulayın ve 72 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  8. 2 'de tarif edildiği gibi lusiferaz aktivitesi için supernatant analiz etmek sureti ile elde edilen enfeksiyon analiz edin. Viral Enfeksiyon okunması '.

4. Viral ataşman Deneyi

Not: Çeşitli virüsler için kuluçka süresi ve viral doz örnekleri arasında, Şekil 2A'da yer alan 'ataşman' vardır. Virüsün yüksek konsantrasyonlar da MOI / PFU artırarak test edilebilir.

  1. Tohum Huh-7,5, 96-çukurlu plaka içindeki hücreler (oyuk başına 1 x 10 4 hücreler) ve bir tek tabaka elde etmek üzere bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de O / N inkübe edin.
  2. 4 ° C de fo plakalarda hücredeki tekli katmanlara önceden soğukr, 1 saat.
  3. HCV aşı ile hücreleri (MOI = 0.01) ve test bileşikleri veya kontroller Co-muamele (nihai konsantrasyonlar: chlA = 50 uM; DMSO =% 1 PUG = 50 uM; heparin = 1000 ug / ml) 4 ° C'de 3 saat. Örneğin, 1 x 10 2 FFU ihtiva eden bir 90 ul virüs aşı için, 500 uM chlA çalışma seyreltme 10 ul; Bu chlA 50 uM'lik bir son konsantrasyon elde tedavi ve MOI'da HCV enfeksiyonu = 0.01, hücre tek tabaka elde edilir.
    Not: bağlayıcı virüs için izin verir, ancak en verimli 37 ° C'de meydana girişi engeller beri 4 ° C'de deneyi yürütmek için önemlidir. Sıcaklık 4 ° C de muhafaza edilmesini sağlamak için, buz üzerinde virüs ve test bileşiklerinin ilave bir 4 ° C buzdolabında izleyen inkübasyon gerçekleştirin.
  4. Süpernatantı ve yavaşça iki kez buz gibi soğuk 200 ul PBS ile hücre mono tabakasının yıkayın.
    Not: hücrelerini kaldırarak önlemek için hafifçe yıkar gerçekleştirin <./ li>
  5. Her bir oyuğa bazal ortam 100 ul uygulayın ve 72 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  6. 2 'de tarif edildiği gibi lusiferaz aktivitesi için supernatant analiz etmek sureti ile elde edilen enfeksiyon analiz edin. Viral Enfeksiyon okunması '.

5. Viral kayıt / Füzyon Analizi

Not: kuluçka dönemleri ve çeşitli virüsler için viral doz Örnek Şekil 2A 'Giriş / Fusion' listelenmiştir. Virüsün yüksek konsantrasyonlar da MOI / PFU artırarak test edilebilir.

  1. Tohum Huh-7,5, 96-çukurlu plaka içindeki hücreler (oyuk başına 1 x 10 4 hücreler) ve bir tek tabaka elde etmek üzere bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de O / N inkübe edin.
  2. 1 saat süre ile 4 ° C 'de plakalarda hücredeki tekli katmanlara önceden soğuk.
  3. 3 saat boyunca 4 ° C 'de HCV ile hücreleri (MOI = 0.01) Infect. Örneğin, 1 x 10 2 FFU ihtiva eden bir 100 ul virüs inokulum kullanın.
    Not: addin gerçekleştirBuz üzerinde viral inokülüm ve 4 ° C buzdolabı izleyen inkübasyon tion viral bağlanmayı değil girişini sağlayacak 4 ° C'de, bir ısıyı sürdürmek için.
  4. Süpernatantı ve yavaşça iki kez buz gibi soğuk 200 ul PBS ile hücredeki tekli katmanlara yıkayın.
    Not: hücrelerini kaldırarak önlemek için hafifçe yıkar gerçekleştirin.
  5. (Nihai konsantrasyonlar:; PUG = 50 uM; heparin = 1000 ug / ml; chlA = 50 uM DMSO =% 1) test bileşikleri veya kontroller ile kuyu tedavi ve 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Örneğin, ortam 90 ul 500 uM chlA çalışma seyreltme 10 ul karıştırın ve kuyu tedavi; Bu 50 uM'lik nihai bir konsantrasyonda chlA tedavi verir.
    Not: 37 ° C, 4 ° C kayma geç viral giriş / füzyon olgusuna kolaylaştırır ve bu nedenle bu özel adım test, bileşiklerin etkisinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.
  6. İlacı içeren süpernatant aspire olmayan içselleştirmiş kaldırmaksitrat tamponu (50 mM sodyum sitrat, 4 mM potasyum klorür, pH 3.0) ya da PBS 200 ul ya da yıkama ile hücre dışı virüs. 72 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilmeden önce, bazal ortam 100 ul uygulanır.
  7. 2 'de tarif edildiği gibi lusiferaz aktivitesi için supernatant analiz etmek sureti ile elde edilen enfeksiyon analiz edin. Viral Enfeksiyon okunması '.

Sonuçlar

Şekil 1'de, 'viral inaktivasyon deneyi' iki özel doğal bileşikler chlA ve PUG hücre serbest halde farklı zarflı virüsler inaktive ve sonraki enfeksiyonu önlemek olabilir olup olmadığını incelemek için yapıldı. Bu bileşiklerin sitotoksisitesi ve antiviral dozu tepkisi mekanik çalışma 31 gerçekleştirmeden önce tespit edilmiştir. Virüs test bileşikleri ile ön-muamele edilmiştir ve sonra virüs-ilaç karışımları her bir virüs sistemi için ilgili hücre tek tabaka üzerine aşılamadan önce alt terapötik konsantrasyonlarda seyreltilmiştir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, chlA ve PUG hem sonraki enfeksiyona hücre tek katmanının korumalı olmayan etki ile sonuçlanan, hücresiz virionlar ile etkileşim ortaya çıktı. % 80 blok MV ve RSV karşı gözlendi - 60 ise iki test bileşikleri, HCMV, HCV ve DENV-2'ye karşı neredeyse% 100 inhibisyon elde etti. Bu sonuçlar, suggeest chlA ve PUG onları inaktive ve enfektivitesini nötralize ederek bu serbest virüs partikülleri üzerinde doğrudan etkisi olduğunu.

Şekil 2'de, eki ve giriş / füzyon deneyleri HCMV, HCV, NV-2, MV ve RSV bu erken viral giriş ile ilgili olaylara karşı chlA ve PUG etkisini araştırmak amacıyla yapılmıştır. ChlA ve PUG Hem etkili bir ortaya çıkan viral enfeksiyon (: açık gri çubuklar Şekil 2'de, 'Ek') üzerine inhibisyonu ile gösterildiği gibi ilgili konakçı hücre üzerine incelenen virüslerin bağlanmasını engellemiştir. Her iki bileşiğin virüs eki üzerindeki önleyici etkisi, HCMV 'nin (Şekil 2B), HCV (Şekil 2C) karşı benzer, NV-2 (Şekil 2B) ve 90 arasında değişen, RSV (Şekil 2F), -% 100. Öte yandan, PUG tw gelen inhibisyon oranı ile, MV bağlanması (Şekil 2E) karşı chlA daha etkili olduğu ortaya çıktı80 -% 50 arasında değişen o bileşikleri. Birçok virüs girişini HCMV'nin da inhibe eki, NV-2, RSV, reklam MV engellemek için bilinen, ancak HCV karşı daha az etkili oldu kontrolü tedavisi heparin. Bunu takip eden 'viral giriş / füzyon deneyi' chlA ve PUG virüs girdi / füzyon aşamasında kendi faaliyetini muhafaza olup olmadığını inceledik (Şekil 2 'Entry / Fusion': koyu gri çubuklar). İlgili hücre tek tabaka üzerinde% 90 koruyucu etki - 50 verimli, - Yine chlA ve PUG hem etkin bir muayene virüsler (F Şekil 2B) viral giriş / füzyon adımını bozduğu gözlendi. Heparin da kuvvetli inhibe giriş / DENV-2 ve RSV enfeksiyonlarının füzyon, ancak HCMV, HCV ve MV (

Virüs Hücre Tipi
HCMV HEL
HCV Huh-7.5
NV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tablo 1:. Viral enfeksiyon için konukçu hücre türü için temsili sonuçlarda tarif edilen her viral enfeksiyon sistemi için kullanılan hücre tipi gösterilir. Hücreleri ile ilgili ilave detaylar referans 31 bulunabilir.

figure-results-1
Şekil 1. deney bileşikleri chlA ve PUG viral enfeksiyonların inaktivasyonu farklı virüs uzun bir süre için deney bileşikleri ile muamele edilmiştir. (1.5 inkübe - titrasyon önce 3 saat, hafif gri çubuklar) ya da kısa bir süre (hemen seyreltildi; koyu gri alt terapötik konsantrasyonları bir seyreltme öncesinde 37 ° C 'de çubuklar)yon ve ilgili konakçı hücreler üzerinde enfeksiyonun sonraki analiz. Nihai virüs konsantrasyonu ile (sol tarafta), deney (A) Şeması (PFU / göz veya İB), uzun vadeli bir virüs ilacın inkübasyon süresi, (i), ve (ii) daha sonra inkübasyon süresi sağdaki tabloda her bir virüs için belirlenmiştir. (B) HCMV, (C) HCV için analizler, (D), NV-2 (E) OG, ve (F) RSV her ek panelinde gösterilir. Sonuçlar Üç bağımsız deneyden ortalama (SEM) standart hataları ± araçlar virüsü enfeksiyonunun DMSO negatif kontrol tedavisi ve gösterilen veriler karşı çizilmiştir. Bu rakam referansı 31 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Virüs eki ve giriş / füzyon karşı test bileşikleri chlA ve PUG antiviral aktiviteleri değerlendirme. (A) gösterilen deney prosedürü, virüs konsantrasyonu (PFU / göz veya İB) ve test bileşikleri ile toplama ve işlem süresi, (i, ii, iii) şemaları ve ilişkili tablolar, her bir virüs için sunulmaktadır. Virüs bağlanma analizi (açık gri çubuklar), farklı hücre tiplerinin mono tabakaları, 1 saat boyunca 4 ° C'de önceden soğutulmuş olan, daha sonra 4 ° C de, ilgili virüsler ve test bileşikleri ile birlikte muamele edilmiş (1,5-3 saat i) daha sonra inkübasyon için inoculates ve test bileşikleri yıkamadan önce (37 ° C, ii) ve virüs enfeksiyonu incelenmesi. Virüs giriş / füzyon analizi (koyu gri çubuklar) olarak, aşılanmış hücre mono tabakaları, 1 saat boyunca 4 ° C'de önceden soğutulmuş ve daha sonra 1.5, 4 ° C de, ilgili virüs ile meydan - 3 saat, (i). Bundan sonra hücreler,yıkandı ve sıcaklık viral giriş / füzyon olgusuna kolaylaştırmak için 37 ° C'ye kaydırılır (ii) 'sırasında ek bir inkübasyon süresi için, test bileşikleri ile muamele edildi. İnkübasyonun sonunda, hücre dışı virüs ya sitrat tampon maddesi (pH 3.0) ya da PBS yıkama ile uzaklaştırılmış ve hücreler virüs bulaşması analizi için, (iii) kuluçkalanmıştır. (B) HCMV, (C) HCV için sonuçlar, (D), NV-2 (E) OG, ve (F) RSV her ek panelinde gösterilir. Veriler, virüs enfeksiyonunun DMSO negatif kontrol tedavisi karşı çizilmiştir ve üç bağımsız deneyden ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu rakam referansı 31 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu raporda, erken viral giriş olaylarını parçalara ayırmaya yönelik mekanik bir yaklaşıma dayalı olarak antiviral bileşikleri tanımlama ve değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Spesifik olarak, tahliller, test bileşiklerinin serbest virüs partikülleri, viral bağlanma ve viral giriş/füzyon üzerindeki etkisini incelememize izin verdi. Erken viral girişin spesifik aşaması üzerindeki ilaç etkisini belirgin bir şekilde değerlendirmek için kritik adımlar uygulandı. Örneğin, 'viral inaktivasyon testinde', virüs-ilaç karışımının terapötik olmayan konsantrasyona seyreltilmesi, ilacı 'titre ederek' test bileşiği ile konakçı hücre yüzeyi arasındaki önemli etkileşimi önler. Bu, konakçı hücrenin müteakip enfeksiyonu üzerinde gözlenen inhibitör etkinin, test bileşiğinin konakçı hücre zarı veya viral reseptörler30 dahil olmak üzere zarla ilişkili moleküller üzerindeki etkisinden ziyade, test bileşiği ile hücresiz viryonlar arasındaki doğrudan etkileşimden kaynaklanmasını sağlar. Benzer şekilde, 'viral bağlanma testi' ve 'viral giriş/füzyon testi'nde 4 °C (virüs bağlanmasına izin veren ancak girişe izin vermeyen) ile 37 °C (virüs girişini/füzyonunu kolaylaştıran) arasındaki sıcaklık değişimi, test bileşiğinin bu spesifik olayların her biri üzerindeki etkisini belirlemek için çok önemlidir. Bu, enfeksiyondaki bu adımlar sırasında zarflı virüslerin sıcaklık duyarlılığı nedeniyle mümkündür24-29. Bu nedenle, sonuçların doğruluğunu sağlamak için testlerin belirtilen sıcaklıkta yapılması önemlidir; örneğin, deneyi 4 °C'de tutmak için buz üzerinde gerçekleştirerek ve numuneyi sıcaklık değişimi için doğrudan 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirerek. Ek olarak, negatif (örn. ilaç hazırlama için DMSO çözücüsü) ve pozitif (örn. heparin tedavisi) kontrollerin kullanılması da testlerin doğruluğunun daha da belirlenmesine yardımcı olur. Bu tür yöntemlerin faydası ve uygulanabilirliği birçok antiviral çalışmada gösterilmiştir26,30,31,40,41. Heparin, temsili sonuçlar bağlamında her üç tahlil için bir kontrol olarak dahil edilirken, tipik olarak takip eden füzyon/giriş adımından ziyade ilk virüs bağlanmasını bloke ettiğini unutmayın ( Şekil 2'deki verilerle yansıtıldığı gibi). Virüse karşı yönlendirilen nötralize edici antikorlar (viral inaktivasyon testi için), virüs için hücre yüzeyi reseptörlerini maskeleyen antikorlar (viral bağlanma testi için) ve membran füzyon inhibitörleri (viral füzyon/giriş testi için) gibi ek kontroller de kullanılabilir.

Bu raporda açıklanan ve viral enfeksiyonun erken evrelerine özgü olan testler, tipik olarak viral enfeksiyonu daha geniş bir şekilde hedef alan birincil taramalardan aday ilaçların etki mekanizmasını karakterize etmek için ikincil testler olarak uygulama açısından yararlıdır. Alternatif olarak, virüs inaktive edici ajanlar, viral bağlanma antagonistleri ve viral giriş/füzyon inhibitörleri dahil olmak üzere özellikle erken viral giriş inhibitörleri aranıyorsa, birincil taramalara da dahil edilebilirler. Bu durumda, bunların kullanımı, mekanizmaya özgü antiviral adayların tanımlanması için daha odaklı ve kesin bir tarama analizine izin verir ve bu da aşağı yönlü ilaç geliştirmeyi hızlandırır.

Antiviral ajanların tanımlanmasında hücre bazlı tahlillerin kullanılması, biyokimyasal tahlillere kıyasla, potansiyel hedef dışı etkilerin (sitotoksisite gibi) ortaya çıkarılması ve test ajanlarının biyoaktivitesine fizyolojik alaka eklenmesi dahil olmak üzere birçok önemli avantaj sağlar42. Bu konular, bir aday ajanın ilaç geliştirmenin sonraki aşamalarında devam etmek için değerli olup olmadığına karar vermek için önemli hususlardır. Benzer şekilde, bu raporda açıklanan erken viral girişe özgü testler, ilacın farklı viral giriş aşaması üzerindeki etkisinin hücresel düzeyde ve daha spesifik olarak in vitro otantik bir viral enfeksiyon bağlamında incelenmesine izin verir. Bu tür tahlillerden elde edilen sonuçlar, bu nedenle, test bileşiklerinin antiviral etkinliğini daha iyi tahmin etmeye ve ayrıca konakçı hücreye karşı potansiyel olarak istenmeyen hedef dışı etkileri belirlemeye yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, potansiyel bir sınırlama, in vitro hücre bazlı bir tahlilin, doğal bir viral enfeksiyon bağlamında gerçek in vivo giriş adımını tam olarak yansıtmayabilmesidir. Bununla birlikte, bu protokolde sunulan tahliller, yeni antiviral ajanların mekanizmaya dayalı tanımlanması ve değerlendirilmesi için analitik bir platform görevi görmektedir.

Viral enfeksiyon miktarını ölçmek için raportör virüslerin veya raportör hücre sistemlerinin geliştirilmesi, antiviral bileşiklerin hücre bazlı taranmasını ve değerlendirilmesini büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Örnekler, bir raportör gen taşıyan rekombinant virüslerin kullanımını veya spesifik virüs promotörü31,43 tarafından yönlendirilen bir raportör gen içeren rekombinant insan hücre dizileri aracılığıyla kullanımını içerir. Bu raporda, lusiferaz etiketli HCV'den kaynaklanan enfeksiyon, raportör sinyalinin nicelleştirilmesiyle kolayca izlenebilir ve böylece veri analizi kolaylaştırılabilir. Bu yararlı raportör tabanlı araçları dahil ederek, burada açıklanan erken viral giriş deneyleri, esasen küçük molekül kitaplıklarının mekanizma tabanlı taraması için yüksek verimli formata uyarlanabilir.

Sonuç olarak, mekanizmaya özgü antiviral bileşikleri tanımlamanın ve değerlendirmenin bir yolu olarak erken viral girişi inceleyen testler için bir protokol tanımlanmıştır. Bu tür tahliller, viral girişe karşı yeni antagonistlerin/inhibitörlerin keşfedilmesi ve profilaktik ve/veya terapötik tedaviler olarak geliştirilmek üzere antiviral ajanların kapsamının genişletilmesine yardımcı olmak için faydalı olacaktır.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışmasının bulunmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu çalışma, Taipei Tıp Üniversitesi Hastanesi (102TMU-TMUH-19) ve Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MOST103-2320-B-038-031-MY3) tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
Penisilin-StreptomisinGIBCO15070-063
Amfoterisin BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
İn vitro toksikoloji test kiti, XTT bazlıSigmaTOX2
PBS pH 7.4 GIBCO10010023
Mikroplaka okuyucuThermo Scientific89087-320
MikrosantrifüjThermo Scientific75002420
BioLux Gaussia lusiferaz test kitiNew England BiolabsE3300L     
LuminometrePromegaGloMax-20/20
Sodyum sitrat, dihidratSigma71402
Potasyum klorürSigmaP5405

Kaynaklar

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21(2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187(2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hepatit C Vir sViral naktivasyonViral TutunmaViral F zyonLusiferaz ReporterSitotoksisite TestiH cre K lt r nk basyonuPBS ile Y kama
Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.