Method Article

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve Mycobacterium abscessus Zebra balığı Embriyolar

DOI:

10.3791/53130

⸱

September 9th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optik olarak şeffaf zebra balığı embriyoları, patojenik mikroorganizmalar ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek ve görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mycobacterium abscessus'un mikro enjeksiyonu, floresan görüntüleme ile birlikte, zebra balığı embriyolarında kordon oluşumu gibi temel patojenik özellikleri incelemek için kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio) embriyoları, konak-patojen etkileşimlerinde omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sisteminin işlevini incelemek için bir enfeksiyon modeli olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır. Çok sayıda embriyo elde etme kolaylığı, dış gelişime bağlı olarak erişilebilirlikleri, optik şeffaflıklarının yanı sıra geniş bir genetik/immünolojik araç yelpazesi ve transgenik raportör hat koleksiyonlarının mevcudiyeti, bu modelin çok yönlülüğüne katkıda bulunun. Bu bağlamda, bu el yazması, Mycobacterium abscessus enfeksiyonunun kronolojisini araştırmak için zebra balığının in vivo model bir sistem olarak kullanımını açıklamaktadır. Bu insan patojeni, hücre duvarı bileşimine bağlı olarak pürüzsüz (S) veya pürüzlü ( R ) varyantlar olarak mevcut olabilir ve bunların ilgili virülansları zebra balığı embriyolarında ve larvalarında görüntülenebilir ve karşılaştırılabilir. S veya R floresan varyantlarının kaudal ven yoluyla doğrudan kan dolaşımına mikro enjeksiyonu, sırasıyla kronik veya akut / ölümcül enfeksiyonlara yol açar. Bu biyolojik sistem, apse oluşumunu teşvik etmede mikobakteriyel kordonun rolünün yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine ve analizine izin verir. Ek olarak, floresan makrofajları barındıran transgenik zebra balığı hatları ile birlikte floresan bakterilerin kullanılması, konakçı-patojen etkileşimlerinin çok renkli görüntülenmesi için eşsiz bir fırsat yaratır. Bu makale, homojen M. abscessus inoculum'un hazırlanması ve makrofajlarla etkileşimin müteakip floresan görüntülemesi için zebra balığı embriyolarının intravenöz enjeksiyonu için ayrıntılı protokolleri açıklamaktadır. Bu teknikler, kordon oluşumunda kusurlu mutantları içeren gelecekteki araştırmalara yol açar ve bunun bütün bir omurgalıda M. abscessus patojenitesini nasıl etkilediğini anlamaya adanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium abscessus insanlarda klinik sendromların çok geniş bir yelpaze neden olan bir yükselen bir patojendir. Bunlar deri enfeksiyonları gibi ciddi kronik akciğer enfeksiyonları, çoğunlukla bağışıklık sistemi baskılanmış ve kistik fibroz hastalarında 1,2,3,4 karşılaşılan sayılabilir. M. abscessus insanlarda da, hastane ve iatrojenik enfeksiyonlara yol açan önemli bir hızla büyüyen bir mikrobakteriyel tür olarak kabul edilir. Dahası, birçok yeni raporlar imkanı vurgulanan M. abscessus, kan-beyin bariyerini geçer ve merkezi sinir sistemi (MSS) 5,6 önemli lezyonlar tetikleyebilir. Hızlı bir yetiştiriciye, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı deneysel esaslar ilgili kurum ve devlet düzenlemelere uymak zorundadır. Mevcut çalışmada, zebrabalıkları deneyler laboratuar hayvanlarının kullanımı için, Avrupa Birliği kurallarına göre, Üniversite Montpellier (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) yapıldı ve referansı kapsamında onaylanan CEEA-LR-13007.

Reaktifler ve Mikroenjeksiyon Ekipman 1. Hazırlık

  1. Sonra yukarı 1 ay 28.5 ° C ve mağaza (20 dakika boyunca 120 ° C) sterilize otoklav, 1 L distile su 31 0.06 g Instant Ocean Deniz tuzu çözerek balık suyu hazırlayın.
  2. 1 L damıtılmış su içinde metilen mavisi 1 g çözülm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli anatomik yerler 32 enjekte edilebilir, ancak, kuyruk damarı enjeksiyonu genellikle sağkalım deneylerde bakteriyel yük belirleme, fagositoz aktivitesi veya kordon oluşumu da dahil olmak üzere daha sonraki analizler için sistemik bir enfeksiyon elde etmek için kullanılır. Kuyruk kaslarda Enjeksiyonlar Enjeksiyon (Şekil 3A) yerinde makrofajların işe değerlendirmek için kullanılır. Araştırmak ve M. R ve S varyantları virülansını karşılaştırmak abscessus, floresan bakteri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı son gerçek zamanlı 36 geniş bir alan ve konfokal görüntüleme kullanılarak bakteriyel enfeksiyon dinamiklerini incelemek için mükemmel bir omurgalı bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Birlikte mikro-enjeksiyon yöntemleri (protokol 4) ile dağınık mikobakteriyel süspansiyonlar (protokol 2.2) kombinasyonu tekrarlanabilir sistemik enfeksiyonlar ve daha sonraki izleme ve ev sahibi makrofajlar ile bakteriyel etkileşimleri üzerine özel bir odaklanma ile enfeksiyonun ilerlemesi görselleştirme sağlar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar yararlı tartışmalar için sırasıyla, tdTomato ve Wasabi ifadesini sağlayan pTEC27 ve pTEC15 cömert hediye için lipo-klodronat ve L. Ramakrishnan sağlamak için K. Kissa minnettarız. Fransız Ulusal Araştırma Ajansı projelerinden (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 ve DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) ve Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı Bu çalışma parçasını oluşturmaktadır (FP7-PEOPLE-2011-ITN) Hibe sözleşmesi kapsamında hayır. PITN-GA-2011-289209 Marie-Curie İlk Eğitim Ağı FishForPharma için. Biz CM Dupont fon Derneği Gregory Lemarchal ve Vaincre La mukoviskidoz (RF20130500835) teşekkür etmek de isterdim.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BBL MGIT PANTABD Biosciences245114
Sığır Serum Albümini Euromedex04-100-811-E Sığır Karaciğerinden Katalaz
 Sigma-AldrichC40
Difco Middlebrook 7H10 AgarBD Biosciences262710
Difco Middlebrook 7H9 Et SuyuBD Biosciences271310
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)Sigma-AldrichA5040
Oleik AsitSigma-AldrichO1008
ParaformaldehitDelta Mikroskopi15710
Fenol KırmızıSigma-Aldrich319244
Tween 80Sigma-AldrichP4780
AgarGibco Life Technologie30391-023
Düşük erime noktalı agarozSigma-Aldrich
Anında Okyanus Deniz Tuzları Akvaryum Sistemleri A.Ş
. Borosilikat cam kılcal damarlar Sutter enstrümanı IncBF100-78-101 mm OD X 0.78 mm ID
Mikropipet çektirme cihazı Sutter Instrument IncFlamming/Brown Mikropipet Çektirme p-87
MikroenjektörTritech Research Dijital microINJECTOR, MINJ-D
CımbızBilim Araçları incDumont # M5S 
Mikro Yükleyici UçlarıEppendorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterium abscessusZebrafish EmbryosIntravenous InjectionFluorescence MicroscopyConfocal MicroscopyMacrophage DepletionBacterial Inoculum PreparationCording FormationHost Pathogen InteractionVirulence Comparison

Related Articles