Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)
Bu makalede
Özet
Özet
Protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) biyoloji için anahtar moleküler olaylardır. Bununla birlikte, PPI'leri hücrelerde yeterli çözünürlük ve hassasiyetle görselleştirmek bir zorluk olmaya devam etmektedir, çünkü geleneksel ışık mikroskobunun çözünürlüğü ~ 250 nm ile kırınım sınırlıdır. Bimoleküler floresan tamamlayıcısı (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek, PPI'ler tek molekül duyarlılığı ve nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilebilir. BiFC, bir floresan proteinin floresan olmayan iki parçaya bölünmesini içeren, floresan kontrastlı PPI'leri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. PALM, fotoaktif floresan proteinler (PA-FP'ler) gibi fototransforme edilebilir floresan probları kullanan, nanometre ve tek molekül ölçeklerinde biyolojik numuneleri görüntülemek için yeni bir süper çözünürlüklü mikroskopi tekniğidir. BiFC-PALM, PALM ile uyumlu bir PA-FP olan PAmCherry1'in monomerik yapısı, iyi tek molekül parlaklığı, yüksek kontrast oranı ve stokiyometri ölçümleri için kullanışlılığı nedeniyle bölünmesiyle gösterildi. 159 ve 160 amino asitleri arasında bölündüğünde, PAmCherry1, PPI'lara yüksek özgüllük ve düşük spesifik olmayan sulandırma ile 37 ° C'de verimli bir şekilde yeniden oluşturulan bir BiFC probuna dönüştürülebilir. Ras-Raf etkileşimi, BiFC-PALM'ın nanometre ölçeğinde ve tek molekül çözünürlüğünde etkileşimleri araştırmaya nasıl yardımcı olduğunu göstermek için bir örnek olarak kullanılır. Difüzyonları, tek molekül izleme (smt-) PALM kullanılarak canlı hücrelerde de izlenebilir. Bu protokolde, BiFC-PALM için füzyon proteinleri tasarlanırken göz önünde bulundurulması gereken faktörler tartışılmakta, numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi adımları açıklanmakta ve birkaç örnek sonuç sergilenmektedir. Yüksek uzamsal çözünürlük, özgüllük ve hassasiyet sağlayan BiFC-PALM, BOZULMAMIŞ BIYOLOJIK numunelerde PPI'leri incelemek için yararlı bir araçtır.
Giriş
Protein-protein etkileşimleri (PPİ) biyoloji 1 için temel olan ve sıkı birçok zaman ve uzunluk ölçeklerinde genelinde zamanmekansal mekanizmalar üzerinden düzenlenir. Hücre zarı üzerinde hücre sinyal ile ilgili çalışmalar, örneğin, belirli bir PPIs ve hücresel süreçlerin 2 kolaylaştıran dinamik nano ölçekli mekansal bölmeleri göstermektedir. Bu nedenle, yeterli mekansal ve zamansal çözünürlükte, yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet ile biyolojik sistemlerde PPIs prob yeteneği biyoloji mekanistik anlayış ulaşmanın anahtarıdır.
5 - Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) hücre içi çözünürlük ve canl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Klonlama
- Klonlamak ve bir bağlayıcı seçmek için yapılandırmaları belirleyin. Onların uygun lokalizasyonu bozmayacak böylece N- veya C-terminali üzerindeki parçaları ile Etiket proteinleri, aşağıda anlatıldığı gibi. Böyle (GGGGS) x2 olarak esnek bir bağlayıcı kullanın.
- Genetiği PAmCherry1 fragmanları ilgi proteinleri etiketleyin. Tek seçenek olarak, MCS dizileri komşu olan parçaları RN (PAmCherry1 kalıntıları 1-159) ve RC (Met artı PAmCherry1 kalıntıları 160-236) içeren malzemeler Listesi'nde yer klonlama plasmidlerini kullanın.
- Insersiyon noktasındaki fragmanları RN ve Re, ters PCR (ya da restriksiyon sindirimi) ihtiva eden plasmi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gösterilen BiFC PALM örnek Craf etki (RBD) (Şekil 1A) bağlayıcı Ras ile etkileşim Kras G12D mutant olduğunu. Tartışıldığı gibi Ras zar lokalizasyonu ve dolayısıyla biyolojik aktivitesini bozacak, çünkü, RN veya RC fragmanları Ras'ın C-terminaline etiketlenmemiş. Bu dört (Şekil 1B) sekizden olası kombinasyonları azalır. Bu dört kombinasyon her lentiviral enfeksiyonu ile U2OS hücrelerine dahil edilmiştir. Protokolde ayrıntılı olarak hücreler sabitlendi ve BiFC sinyalleri PALM kurulumu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PALM sağlam biyolojik örneklerin nano ölçekli sokulmuşlardır son tek bir molekül superresolution mikroskopi tekniği ise BiFC, tespit ve hücrelerde PPIs görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik, olmuştur. PALM ile BiFC kombinasyonu nanometre mekansal çözünürlükte ve tek bir molekülün duyarlılığı ile bir hücrenin içinde PPİ seçici görüntüleme elde etti. BiFC PALM her iki tekniğin yararını uzanır ve bu çalışmada gösterildiği gibi, kendi ana hücresel bağlamda PPİ moleküler ayrıntıları ortaya büyük olacağını .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, yararlı tartışmalar için Dr. Steven Chu ve Joe W. Gray'e, BiFC-PALM projesindeki ilk çalışması için Henry Marr'a ve teknik yardımı için Alexis Shoemaker'a teşekkür eder. Bu çalışma, OHSU'dan X.N.'ye başlangıç fonları tarafından desteklenmektedir. Nan laboratuvarındaki araştırmalar ayrıca NIH 5U54CA143836-05, Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı, MJ Murdock Charitable Trust ve FEI şirketi tarafından da desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mikroskop çerçevesi | Nikon | Ti-U | |
| 60X yağa daldırma TIRF objektif, 1.49 NA Nikon | CFI Apo TIRF 60x H | ||
| EMCCD kamera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 561 nm lazer | Opto Engine | MGL-FN-561 | |
| 405 nm lazer | Tutarlı | CUBE-405 50mW | |
| 561 nm dikroik ayna | Semrock | Di01-R405 / 488/561 / 635-25x36 | |
| 561 nm filtre | Semrock | FF01-525 / 45-25 | |
| 405/561 nm çentik filtresi | Semrock | NF01-405 / 488 / 568-25 | |
| Sıcaklık ve CO2< / sub> kontrollü aşama | Tokai Hit | INUBG2ATW-PLAM | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS | Addgene | 60545 | |
| pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS | Addgene | 60546 | |
| pcDNA3.2-DEST | Yaşam Teknolojileri | 12489-019 | |
| pLenti-DEST | Addgene | http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ | |
| Phusion Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz | Thermo Scientific | F-531 | |
| In-Fusion HD Klonlama | Clontech | 639649 | |
| LR Klonaz | Yaşam Teknolojileri | 11791 | |
| Vira Power Lentivirus Ambalaj | Yaşam Teknolojileri | K497500 | |
| X-tremeGENE Transfeksiyon Reaktifi | Roche | 13873800 | |
| Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı | Thermo Scientific | 155409 | # 1.5 cam alt tabaklar |
| U2OS hücreleri | ATCC | HTB-96 | |
| 293T / 17 hücreleri | ATCC | CRL-11268 | |
| Fenol kırmızısı ile DMEM | Yaşam Teknolojileri | 11995 | |
| DMEM fenol kırmızısı içermez | Yaşam Teknolojileri | 21063 | |
| Fetal sığır serumu | Yaşam Teknolojileri | 10082 | |
| Leibovit'in L-15'i, fenol kırmızısı içermez | Yaşam Teknolojileri | 21083-027 | |
| İndirgenmiş serum ortamı | Yaşam Teknolojileri | 31985 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Yaşam | Teknolojileri | 14040 | |
| Şırınga | BD Biosciences | 309604 | |
| Şırınga filtresi | Millipore | SLHV033RB | |
| Retroviral yoğunlaştırıcı | Clontech | 631455 | |
| 10 cm kültür çanak | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 oyuklu kültür plakası | BD Biosciences | 353046 | |
| Polibren | Sigma | 107689 | |
| Puromycin | Yaşam Teknolojileri | A11138 | |
| G-418 | Calbiochem | 345812 | Neomisin |
| Doksisilin | Fisher | BP2653 | |
| Tris tabanı | Fisher | BP152 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Sodyum Hidroksit | Sigma | S5881 | |
| Paraformaldehit | Sigma | 158127 | |
| Gluteraldehit | Sigma | G6257 | |
| BORULAR | Sigma | P6757 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| EGTA | Sigma | 3777 | |
| Magnezyum Sülfat | Sigma | M2643 | |
| Potasyum Hidroksit | Sigma | 221473 | |
| Sodyum klorür | Fisher | BP358 | |
| Magnezyum klorür | Fisher | M33 | |
| 100 nm altın parçacıkları | BBI Çözümleri | EM. GC100 | |
| Moleküler dereceli su | Yaşam Teknolojileri | 10977 | |
| Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
| PCR arıtma kiti | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kiti | Qiagen | 27104 | |
| Midiprep kiti | Macherey-Nagel | 740410 | |
| 0.6 ml mikrosantrifüj tüpleri | Fisher | 05-408-120 | |
| 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri | Fisher | 05-408-137 | |
| 15 ml tüpler | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler | BD Biosciences | 352063 | |
| 14 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 ml tüp | BD Biosciences | 352070 | |
| PCR tüpü | GeneMate | C-3328-1 | |
| SOC ortamı | Yaşam Teknolojileri | 15544 | |
| LB et suyu | BD Biosciences | 244610 | |
| Kanamisin sülfat | Fisher | BP906 | |
| Yetkili hücreler | Yaşam Teknolojileri | C4040 | |
| Matlab | Mathworks |
Kaynaklar
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
