Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama
Bu makalede
Özet
Özet
Sarkoplazmik retikulum (SR) Ca2+ elleçlemesi normal uyarma-kasılma eşleşmesinde anahtar bir rol oynar ve anormal SR Ca2+ elleçlemesinin belirli aritmi tiplerinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Aritmiler mekansal olarak farklı, ortaya çıkan fenomenler olduğundan, doku düzeyinde araştırılmalıdır. Bununla birlikte, sağlam kalpte SR Ca2 + 'yı doğrudan problama yöntemleri sınırlı kalmaktadır. Bu makale, Langendorff perfüze tavşan kalbindeki transmembran potansiyelinin (Vm) ve serbest intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) ikili optik haritalaması için protokolü açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre içi [Ca 2 +] ([Ca2 +] i) nispeten düşük olduğu sitozolde minimum floresan bulunan ancak SR lümeninde önemli floresan sergileyen düşük afiniteli Ca 2 + indikatörü Fluo-5N'den yararlanır. Kalbin epikardiyal yüzeyi boyunca mekansal olarak SR Ca2 + özelliklerini ortaya çıkarmanın yanı sıra, bu yaklaşım, Vm ve SR Ca2 + arasındaki çift yönlü ilişkinin araştırılmasına izin veren Vm'nin eşzamanlı izlenmesi gibi belirgin bir avantaja sahiptir ve SR Ca2 + 'nın aritmojenik olaylardaki rolü.
Giriş
Sağlam Langendorff perfüze kalpte hücre içi Ca2+ ve transmembran potansiyelinin (Vm) ikili optik haritalanması, aritmi mekanizmaları ve uyarma-kasılma eşleşmesi1-4 dahil olmak üzere kardiyak elektrofizyolojideki araştırmaların temel dayanağı haline gelmiştir. Bu yaklaşım, normal ve anormal elektrofizyolojiye ve daha da önemlisi, Vm ile hücre içi Ca2+ arasındaki çift yönlü ilişkiye eşi görülmemiş bir bilgi sağlamıştır. Bununla birlikte, yüksek afiniteli floresan indikatörlerle (Rhod-2 ve Fluo-4 gibi) hücre içi Ca2 + 'nın optik haritalanması, yalnızca hücre içi Ca2 + 'daki toplu değişiklikleri ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları da içeren tüm prosedürler California, Davis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu yapıştırılır bulundu.
1. Hazırlık
- 4 ° C'de önceden ve mağaza modifiye Tyrode çözeltisi iki konsantre edildi (25X) stokları hazırlayın: (1) Stok I (mM olarak: NaCl 3205, CaCl2 32.5, KCI 117.5, NaH 2 PO 4 29,75, MgCI2 26,25) ve (2) (mM olarak: 500 NaHCO 3) Stok II.
- (DI) NaCl 128.2, CaCl2 1.3, KCI 4.7, MgCl2 1.05, NaH ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1A, çift V m ve SR Ca2 + eşleme için optik konfigürasyonunda şematik bir diyagramını göstermektedir. Bu ayar ile, V m ve SR Ca 2 + sinyalleri (Şekil 1B) tam spektral ayrılık yoktur. Fluo-5N boya yüklemesinin için kullanılan çift döngü perfüzyon sistemin bir şeması Şekil 1C 'de gösterilmiştir. Şekil 1 D perfüzyon çanak kalp yatay yönünü gösterir. Örnek V m ve kalp epikardiyal yüzeyi üzerind.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Başarılı Fluo-5N boya yükleme anahtarları boyanın büyük miktarda yükleme süresi (1 saat) uzunluğu gerek kalmadan yüksek Fluo-5N konsantrasyonu sağlar küçük hacimli çevrimli perfüzyon kurulum vardır ve yükleme gerçekleştirme oda sıcaklığında karıştırıldı. Yükleme hızla fizyolojik sıcaklıklarda, hücresel enzimatik aktivite böler boya sitozolde boya moleküllerini yakalama ve onları SR zarı geçmeye izin vermiyor, hücre zarı haçlar -AM etiketi gerçekleştirilir edin. Oda sıcaklığında, bununla birlikte, enzim aktivitesi yavaşl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 HL 111600) ve Amerikan Kalp Derneği (12SDG9010015) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| D-Glikoz | Fisher Scientific | D16-1 | Tyrode çözeltisinin bileşeni |
| %95 O2 %5 CO2 | AirGas | karbojen | Tyrode çözeltisinin oksijenasyonu ve pH'ı için |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Uyarma-kasılma birleştirici |
| RH237 | Biotium | 61018 | Gerilime duyarlı boya |
| Fluo-5N | Invitrogen | F-26915 | Düşük afiniteli Ca2+ göstergesi; Alternatif: Invitrogen F-14204; Yükleme oda sıcaklığında yapılmalıdır |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | Ca2+ göstergesi yüklemesi için; Kullanmadan önce çözelti berraklaşana kadar ısıtın |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Blebbistatin ve boyaları çözmek için |
| Filtre | EMD Millipore | NY1104700 | 11 & # 956; m hat içi filtre |
| Basınç Dönüştürücü | WPI | BLPR2 | Perfüzyon basıncını ölçmek için |
| Transbridge Dönüştürücü Amplifikatör | WPI | SYS-TBM4M | Basınç sinyalini dönüştürmek/yükseltmek için; PowerLab ayrıca uygun BioAmp ile de kullanılabilir |
| PowerLab 26T | Cihazları: | Basınç ve EKG sinyallerinin sürekli kaydı için | |
| THT Macroscope | SciMedia | Makroskopik optik kurulum. Ayrıntılar: 0,63X objektif (NA = 0,31), 2X yoğuşmalı objektif, bileşke görüş alanı = 3,1 cm x 3,1 cm, odak derinliği = ~ 1,5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optik haritalama kameraları | |
| Hassas LED Spot Işık | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED ışık kaynağı |
Kaynaklar
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
