Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

11.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53174

⸱

20 Ağustos 2015

 ,  , 
1Centre for Eye Research Australia & Department of Ophthalmology, University of Melbourne

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Özet

Yeniden programlamadaki son gelişmeler, somatik hücreleri insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) dönüştürmemize izin veriyor. Hastaya özgü hiPSC'leri kullanan hastalık modellemesi, patogenez için altta yatan mekanizmanın incelenmesine olanak tanır ve ayrıca tedavi seçeneklerini iyileştirmek için in vitro ilaç taraması ve gen terapisinin geliştirilmesi için bir platform sağlar. hiPSC'lerin rejeneratif tıp için umut verici potansiyeli, son yıllarda iPSC'lerle ilgili artan yayın sayısından (>7000) da açıkça görülmektedir. Deri fibroblastları, hematopoietik hücreler ve epidermal keratinositler dahil olmak üzere hiPSC üretimi için farklı soylardan çeşitli hücre tipleri başarıyla kullanılmıştır. Deri biyopsileri ve kan alımı, hiPSC'lerin üretilmesi için somatik hücrelerin kaynağı olarak birçok laboratuvarda rutin olarak gerçekleştirilirken, saç keratinositlerinin toplanması ve ardından türetilmesi daha az yaygın olarak kullanılmaktadır. Saçtan elde edilen keratinositler, hastalardan hücre örnekleri elde etmek için invaziv olmayan bir yaklaşımı temsil eder. Burada, koparılmış saçlardan keratinositlerin türetilmesi için basit bir non-invaziv yöntemi özetliyoruz. Ayrıca, keratinositlerin bakımı ve ardından epizomal vektörler kullanarak entegrasyonsuz hiPSC oluşturmak için yeniden programlama için talimatlar sağlıyoruz.

Giriş

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) keşif hastaya özgü kök hücrelerin 1-3 üretimi için uygun bir yöntem sağlayan, rejeneratif tıp alanında devrim yarattı. hiPSCs başarılı fibroblastlar 4,5, hematopoietik hücrelerin 6,7, idrar 8 böbrek epitel hücreleri ve 9,10 keratinositler dahil olmak üzere çeşitli somatik hücre tiplerinin, elde edilmiştir. Bugüne kadar, deri fibroblastları ve hematopoietik hücreler hastaya özgü iPSCs üretilmesi için en yaygın olarak kullanılan hücre kaynağıdır. Muhtemelen, bu deri biyopsileri ve kan toplama rutin tıbbi prosedürler ve birçok ülkede kurulmuştur hastanın kan veya cilt örneklerinin büyük biyobankalar olmasından kaynaklanmaktadır.

Kan hücreleri ve invazif çıkarma yöntemleri gerektiren deri fibroblast aksine, keratinositler hiPSC üretimi için kolay erişilebilir bir hücre tipini temsil etmektedir. Keratinocytes cildin dış epidermal bariyer oluşturur ve ayrıca çivi ve saç 11'de bulunan keratin bakımından zengin epitel hücreleri vardır. Özellikle, keratinositler saç köklerinin, iç kök kılıfı (IRS) hücreleri (12, Şekil 1) ile birlikte saç gövdesine kaplı bir dış hücresel tabakanın dış kök kılıfı (ORS) bulunabilir. Saç toplama sağlık personelinin yardım gerektirmeyen, basit bir prosedür olduğu gibi hastaların toplamak ve büyük ölçüde hiPSC nesil için hasta örneklerinin koleksiyonu kolaylaştıracak laboratuvarlar, kendi saç örneklerini göndermek için, bir fırsat sağlar. Epidermal keratinositler, aynı zamanda hiPSC üretimi 9,13 başlangıç ​​hücreleri gibi keratinositleri kullanmanın avantajları ekleyerek, fibroblastlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir yeniden programlama verimliliği ve daha hızlı bir yeniden programlama kinetiği sahiptir. Ayrıca, hiPSCs da saç folikülü içinde diğer hücre popülasyonları kullanılarak üretilebilir,saç folikülü 14,15 tabanında bulunan dermal papilla hücrelerini dahildir.

Saç türetilmiş hücreleri kullanarak iPSC nesil Önceki raporlar genellikle retroviral veya lentiviral tabanlı yeniden programlama yöntemlerini 9,14,15 kullanmaktadır. Ancak, bu viral yöntemler yeniden programlama sırasında yabancı transgenlerin istenmeyen genomik entegrasyon tanıtmak. Karşılaştırma olarak, epizomal vektörlerin kullanımı entegrasyonu içermeyen iPSCs 4 oluşturmak için uygun bir non-viral yeniden programlama yöntemi temsil eder. Biz daha önce verimli epizomal vektörler 13 kullanan hiPSCs içine keratinosit yeniden programlamak için basit, düşük maliyetli ve viral olmayan bir yöntem geliştirdik. Burada koparıp saç büyüme ve keratinositler bakım ve hiPSCs oluşturmak için daha sonra yeniden programlama ile ilgili keratinosit türetilmesi dahil olmak üzere, keratinosit türetilmiş hiPSCs, üretimi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

bireylerin insan saçı örnek toplama konak kurumlarında insan araştırma etik komitesi tarafından etik onayı gerektirir ve kurumsal kurallarına uygun yapılmalıdır.

Mızraplı Saç gelen Keratinositler 1. İzolasyonu

  1. Buz O / N (yani, Matrigel) çözülme Ekstrasellüler Matriks (ECM) çözümü.
  2. Önceden soğutulmuş pipet uçları kullanılarak, soğutulmuş DMEM / F12 ortamında 12 ml 200 ul ECM çözeltisi ilave edilir. Kat her bir seyreltilmiş ECM çözeltisi, 1 ml ile 12 oyuklu plaka. 37 ° C 'de, kaplanmış plak O / N inkübe edin. Kullanmadan önce, önceden ısıtılmış DMEM / F12 ortamı ile kaplanmış plaka yıkanır.
  3. Saç köküne yakın parmakları yerleştirerek ve bir hızlı ve pürüzsüz hareket saç yolma ile bireyin kafasından birincil insan saçı toplamak. Her toplanan saç bozulmamış bir saç folikülü içerdiğini teyit ve saç un büyüme fazını belirlemek için kontrol edinbir mikroskop (Şekil 1) der.
    1. Keratinositler ayıklamak için her bireyin 5-10 anagen tüyleri toplayın. Süreç keratinositlerinin başarılı türetme sağlamak için en kısa sürede tüyleri koparıp.
      Not: Şekil 1 büyüme döngüsünün farklı aşamalarında kılların morfolojisi göstermektedir. Anajen saç ORS olarak bilinen saç uzunluğunu çevreleyen epitel görünür bir dış tabaka ile, bir büyüme aşamasında. Öte yandan, telojen saç dinlenme aşamasında saç temsil eder ve görünür bir ORS sahip değildir, ancak telojen çıkıntı olarak bilinen saç kökü kapsayan hücrelerin net bir top yer alır.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yıkama antibiyotik karışımı 10 ml ihtiva eden bir petri çanağı içine numuneler saç.
  5. Saç şaftının 1 cm - sterilize makas ve forseps kullanarak, sağlam bir saç folikülü ve yaklaşık 0.5 olan bir saç parçası bırakarak, aşırı saç şaft kesti.
  6. Dikkatle traforseps kullanılarak ECM kaplı plakanın her oyuğuna nsfer 1 saç parçası.
  7. Saç örnekleri göre - (200 ul ~ 100) bir 1 ml'lik bir pipet kullanarak, nakavt Serum Replacement (KSR) ortam, yaklaşık 3 damla ekleyin.
    Not: eki ve sonraki keratinosit akıbet için izin vermek için plaka yüzeyine yakın temas içinde saç parçaları tutun. Bu aşamada aşırı medya ekleyerek olabilir saç parçaları float neden olur ve başarılı bir saç eki olasılığını azaltır.
  8. % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör saç örnekleri inkübe ve saç köklerinin / N O takmak için izin verir. Nemli saç örneği tutmak için - (200 ul ~ 100) Ertesi gün, yavaşça KSR ortamının başka bir 3 damla ekleyin.
  9. Saç folikülleri başarıyla eklenmiş onaylamak için günlük saç örnekleri dikkate alın. Genellikle saç köklerinin eki 1-3 gün içinde görülür. Ince tüyleri yüksek olması gibi kalın kıllar, ince kıllar ile karşılaştırıldığında takmak için genellikle daha kolayeğilim eki sürecini engelleyen hangi float.
    1. Saç kaplı plaka takılı sonra, kuyuya KSR orta 500 ul ekleyin. Saç örnekleri sıkıca bağlı olmayabilir olarak orta eklerken ekstra özen gösterin. Bu noktadan itibaren, her 2 gün medya değiştirin.
      Not: Keratinosit çıkıntılar 3-7 gün (Şekil 2A-B) sonra saç fragmanı ORS bölgesinden görünür olmalıdır. Keratinositler sonraki bölümde açıklandığı gibi hücrelerin Pasajlanması 14 gün öncesine kadar büyümeye izin verin.

2. Bakım ve Keratinositler arasında Pasajlanması

  1. Ön kaplama kaplama maddesi Kit kullanılarak, 6-çukurlu plaka. Kaplama matris solüsyon içerisinde 6.8 ul ve ardından her oyuğa kit, seyreltme ortamı 680 ul ekle. Plaka üzerinde kaplama maddesi solüsyonu homojen dağılımını sağlamak için plakayı sallayın.
  2. Kaplanmış levha oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyona izin verin. KaldırKeratinositlerin kaplama öncesinde kaplama maddesi solüsyonu.
  3. 37 ° C'de 2-5 dakika boyunca oyuk başına% 0.25 tripsin 500 ul olan tek bir hücre süspansiyonu içine keratinositler ayrıştırmaları. Serum ihtiva eden kültür (örneğin, fetal sığır serumu (FBS) ortamı) 500 ul tripsin inaktive ve steril bir 15 ml tüp içine toplar. Sterilize forseps kullanarak saç fragmanı çıkarın.
  4. Bir hemositometre kullanılarak hasat hücrelerinin sayısını belirler.
  5. X g 200'de 3 dakika boyunca hücreleri Santrifüj. PBS ve tekrar santrifüj hücreleri yıkayın. PBS aspire ve taze keratinosit ortamında hücre pelletini.
  6. Keratinosit ortamın mevcudiyetinde ECM kaplı plakanın bir kuyuya plaka aşağı 4 x 10 4 keratinositler. % 5 CO2 (Şekil 2C) ile 37 ° C inkübatör keratinositler tutun. Kültür olduğunda ~ Ortam% 80 konfluent her gün ve geçiş hücreleri değiştirmek, WHIch keratinositlerinin geçiş numarası ve çoğalma hızına bağlı olarak yaklaşık 2-7 gün sürebilir. türetilmiş keratinositler standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri kullanılarak 16 yeterli dondurulmuş stokları oluşturmak için yaygınlaştırılmalıdır.
    Not: Tarif edilen kültür koşulları tipik arnavut kaldırımı morfolojisi (Şekil 2C) ile keratinosit homojen popülasyonunun büyümesini desteklemektedir. Bazen, birkaç farklı, büyük ve düz morfolojisi keratinositler ve replikatif potansiyeli kaybetmiş, kültür görülebilir. Keratinositlerin karakterizasyonu sitokeratin 14 karşı antikorlar kullanılarak imüno-boyama ile gerçekleştirilebilir, daha önce tarif edilen 17. Kurulan keratinosit hücre çizgileri aynı zamanda, ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak 1-3 geçişten sonra mikoplazma için test edilmelidir.

Epizomal vektörlerin kullanılması keratinositlerinden hiPSCs 3. Nesil

  1. 6-çukurlu plaka ile ön-kaplama% 0.1 jelatin (2 ml / oyuk). Oda sıcaklığında en az 20 dakika süreyle kaplamak için jelatin izin verir.
  2. Yeniden programlama deneme için, kullanımı keratinositler geç geçiş 6'dan ayrışır, 37 ° C'de 2-5 dakika boyunca oyuk başına% 0.25 tripsin, 1 ml ile tek bir hücre süspansiyonu içine keratinositler. Ortam serum içeren (ör: FBS ortamı) 1 ml tripsin inaktive ve 15 ml bir tüp içinde toplayın.
  3. Keratinosit ortamı içinde 200 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri 3 dakika boyunca santrifüj hücreleri. Bir jelatinleştirilmiş plaka O / N kuyu başına Levha 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 keratinositler.
  4. Ertesi gün (Gün 0) günü, hücreler% 50-60 konfluent olduğundan emin olmak için plakayı kontrol edin.
    Not: keratinositler ~% 50 konfluent onlar iyi transfeksiyondan sonra büyümek olmayabilir daha az ise.
  5. Gün 0 günü, 2 ug plasmid DNA, toplam 8 ul transfeksiyon reaktifi bir oran kullanılarak, keratinositler üzerinde epizomal yeniden programlama vektörlerinin transfeksiyonu gerçekleştirin.
    1. 4, plazmidler (pCXLE EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-hul) her biri için 0.5 ug al ve düşük serum ortamında (örneğin, OPTI-MEM) 100 ul seyreltin.
      Not: Plazmid pCXLE EGFP keratinositlerde transfeksiyon verimliliği izlenmesi için kullanılan ve başarılı bir yeniden programlama için gerekli değildir.
    2. Seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktifi 8 ul ekleyin. Tüp hafifçe vurarak karıştırın. DNA, Reaksiyon karışımı 15 dakika boyunca oda sıcaklığında rahatsız dinlenmeye bırakın.
    3. Taze ortam ile keratinosit orta değiştirin.
    4. Yavaşça 4 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör keratinosit kültürü DNA Reaksiyon karışımı ekleyin ve inkübe edilir.
      Not: bunlar düşük hayatta kalma sonrası transfeksiyon sergileyen olarak keratinositler uzun süreli transfeksiyon O / N gerçekleştirmek için tavsiye edilmez.
    5. 4 saat sonra, transfeksiyondan sonra, taze ortam ile keratinosit orta yerine.
  6. Gün 1 (1 gün sonrası transFection), keratinosit orta değiştirmek ve bir floresan mikroskop altında EGFP pozitif hücrelerin yüzdesi tahmin edilerek transfeksiyon etkinliğini kontrol edin. Tipik haliyle>% 60-70 transfeksiyon verimi, bu protokol kullanılarak primer keratinositler gözlenmektedir.
  7. Aşama 3,5 anlatıldığı gibi 2. Gün, transfeksiyon tekrarlayın. İki ardışık transfeksiyonlar genellikle>% 90 transfeksiyon verim elde ederim. Keratinosit kültürü genellikle ikinci transfeksiyon sonunda izdiham ulaşır.
    1. Her yeniden programlama reaksiyon için fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici bir 10 cm çanak hazırlayın. Daha önce tarif edildiği gibi 18 mitotik inaktive MEF besleyiciler hazırlayın.
    2. Ön kaplama, en az 20 dakika süreyle,% 0.1 jelatin, 5 ml ile 10 cm tabak. FBS ortamında 10 cm çanak başına Plaka 4 × 10 6 mitotik inaktif MEF. Hücreler yerleşmek ve% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör O / N takmak için izin verin.
  8. Gün 3 günü, haradım 3.2 ve 3.3 açıklandığı gibi% 0.25 tripsin ile keratinositler yelek. KSR ortamı içinde yeniden süspanse edin ve keratinositleri KSR ortamı ile, 10 cm MEF besleyici çanak içine bir 6-yuvalı plaka 1 kuyusundan keratinosit% 90 plaka.
  9. Itibaren Day 4, her gün KSR orta değiştirin.
    1. Alternatif Gün 18 sonra, her ikinci gün kültür ortamı değiştirin.
      Not: İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) benzeyen tanımlanan sınır ile hiPSC koloniler Gün 14 çıkacak iken Sigara yeniden programlanan keratinositler, çoğalmaya sona erecek - 21.
  10. Itibaren Gün 21 manuel diseksiyon ile hiPSC koloniler izole edin. Yakından birlikte kümelenmiş ve yalnızca açıkça diğerlerinden ayrılır hiPSC koloniler almak vardır hiPSC koloniler kaçının.
    Not: hiPSC koloniler önce alınabilir, ancak belirlenen sınırları koloni küçük koloni büyüklüğü göz önüne alındığında erken zaman noktalarında belirgin olmayabilir. Yeniden programlama verimliliği fark arasında değişebilirFarklı hasta en keratinositler, ve aynı zamanda geçiş sayısı veya keratinosit proliferasyon hızı gibi diğer faktörler tarafından etkilenir.
    1. HiPSC kolonilerinin manuel diseksiyon için, bir mikroskop altında hiPSC kolonileri kesmek için bir 26G iğne kullanın. Uzunluğunda 600 um - 300 civarında küçük parçalar halinde bir hiPSC koloni kesin. HiPSCs klonal çizgi oluşturmak için yeni bir MEF besleyici plakası (2.5 × 10 4 MEF / cm 2) içine bir hiPSC kolonisinden parçaları aktarın. Başlangıçta, kültür 12 kuyu plakası veya organ kültürü yemekleri tek kuyuda her hiPSC klonal çizgi, daha sonra 6 kuyu plaka formatına genişletin.
    2. MEF besleyiciler üzerinde KSR ortamda hiPSCs kurulan klonal hatları korumak. Kültür kez 70 ulaşır - hiPSC kolonileri ile% 80 confluency ~ çapı 1,5 mm, üreticinin talimatlarına göre standart enzimatik Pasajlanması yöntemleri (Accutase, Dispase veya kollajenaz IV) kullanarak geçiş hiPSCs.
  11. Kurulan hiPSC hattını karakterizes pluripotensini ve in vitro ve / veya in vivo 13,19 üç germ hücreleri temsil ayırt etme yeteneğini doğrulamak için. Ayrıca, piyasada mevcut kitler kullanılarak mikoplazma için rutin kurulan test hiPSC çizgiler patojen içermez sağlamak. Rutin karyotipleme ya da dizi tabanlı kopya sayısı varyasyonu (KNV) analizi ile hiPSC hatlarının genomik istikrarı izlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

anagen (büyüme fazı), katagen (regresyon fazı) ve telojen (dinlenme fazı) 20-21: saç 3 farklı büyüme döngüsünün evreleri geçer. anagen kıl folikülü epitel Birden çok katman içeren; Bu tabakalar ORS, IRS ve saç gövdesine (Şekil 1) içerir. Anagen kıl sonunda ORS ve saç şaft farklılaşma fesih apoptoz ile işaretlenir katajen faza, geçiş uğrar. Son olarak, apoptoz durur ve telojen folikül karakteristik telojen ile sakin olur telojen faza için katajen saç geçiş 20,21 şişer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hastaya özgü hiPSCs üretilmesi, in vitro olarak hastalıklı hücre tiplerinde patojenezinin araştırılması için eşsiz bir yaklaşım sunmaktadır ve ayrıca hastalığın fenotipleri kurtarabilir yeni moleküllerin belirlenmesi için ilaç tarama için bir platform sağlar. HiPSCs kullanılarak bu hastalığa modelleme yaklaşımı uzun QT sendromu, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz 22 de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların, umut vaat eden sonuçlar vermiştir. Çeşitli girişimler ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar teknik destek için Harene Ranjithakumaran ve Stacey Jackson'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (R.C.B. Wong, A. Pébay), Melbourne Üniversitesi (R.C.B. Wong), Retina Avustralya (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) ve Avustralya Oftalmik Araştırma Enstitüsü (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Vakfı Bursu (RCB Wong); Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) okul içi finansman ve Victoria Hükümeti'nden operasyonel altyapı desteği.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antibiyotik Karışımı: 
250 ng/ml Antimikotik amfoterisin BSigmaA2942-20mlAntibiyotik karışımı PBS'de oluşturulur.
1X Penisilin / Streptomisinİnvitrojen15140-122
PBS (-)İnvitrojen14190-144
Nakavt Serum Replasmanı (KSR) orta: KSR ortamı, kullanılmadan önce Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) kullanılarak filtrelenir. bFGF, kullanılmadan önce ortama taze olarak eklenir.
% 20 nakavt serum replasmanı (KSR)Invitrogen10828-028
DMEM / F12, glutamax ileInvitrogen10565-042
1 & kez; MEM esansiyel olmayan amino asitInvitrogen11140-050
  0.5 kez; Penisilin / Streptomisinİnvitrojen15140-122
  0.1 mM β-merkaptoetanolInvitrogen21985
  bFGF (10 ng/ml, taze eklenmiş)MilliporeGF003
Keratinosit ortamı: 
  60  ile EpiLife; &mikro; M KalsiyumİnvitrojenM-EPI-500-CA
1 & kez; İnsan keratinosit büyüme takviyesi (HKGS)İnvitrojenS-001-5
Fetal Sığır Serumu (FBS) orta: FBS besiyeri, kullanılmadan önce Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) kullanılarak filtrelenir.
% 10 fetal sığır serumu (FBS)İnvitrojen26140079
DMEM İnvitrojen11995-073
0.5x Penisilin / Streptomisinİnvitrojen15140-122
2 mM L-glutaminİnvitrogen25030
%0.25 tripsin-EDTAİnvitrojen25200-056
Hücre Dışı Matriks (ECM):
MatrigelCorning 354234Aliquot Matrigel stoğu ve mağazası -80 derece; Üreticinin ardından C s talimatları. Matrigel'in stok konsantrasyonu partiden partiye biraz değişir (~ 9mg / ml). 200 & micro kullanmanızı öneririz; l 12 oyuklu bir plakayı kaplamak için matrigel (~ 150 & mikro; g/kuyu). 
Kaplama Matris Kiti İnvitrojenR-011-K
Plazmitleri: pCXLE-eGFP'nin yalnızca transfeksiyon verimliliğini izlemek için kullanıldığını ve yeniden programlama için gerekli olmadığını unutmayın.
-                  pCXLE-eGFPAddgene27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53FAddgene27077
-                  pCXLE-hSKAddgene27078
-                  pCXLE-hULAddgene27080
Transfeksiyon reaktifi Fugene HDPromegaE231B
Jelatin (domuz derisinden)SigmaG1890Damıtılmış suda %0.1 jelatin oluşturun. Kullanmadan önce otoklavlayın. 
Azaltılmış Serum ortamı: OPTI-MEMInvitrogen31985062
AccutaseSigmaA6964-100ml
Fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyiciMEF, daha önce tarif edildiği gibi mitomisin C tedavisi veya ışınlama ile inaktive edilebilir 16.
26G iğneTerumoNN2613R
6 oyuklu plaka (doku kültürü ile tedavi edilir)BD Biosciences353046
10 cm'lik tabak (doku kültürü ile tedavi edilir)BD Biosciences353003
DispaseInvitrogen17105-04110 mg / ml'de
kullanınKollajenaz IVInvitrogen17104-0191 mg / ml
TRA-160 antikorundaMilliporeMAB43605 & mikro'da kullanın; g/ml
OCT4 antikoruSanta CruzSC-52795 & mikroda kullanın; g/ml
NANOG antikoruR& D SistemleriAF199710 & mikroda kullanın; g/ml
MycoAlert Algılama kitiLonzaLT07-418
12 oyuklu plaka (doku kültürü ile tedavi edilir)BD Biosciences 353043 kullanın

Kaynaklar

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  5. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
  6. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
  7. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
  8. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
  9. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  10. Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).
  11. Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445, 834-842 (2007).
  12. Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
  13. Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
  14. Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
  15. Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
  16. Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
  17. Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
  18. Conner, D. A., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22(2001).
  19. Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
  20. Myung, P., Ito, M. Dissecting the bulge in hair regeneration. J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).
  21. Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
  22. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  23. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
  24. McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
  25. Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
  26. Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
  27. Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
  28. Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
  29. Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Epizomal Yeniden ProgramlamaKeratinosit İzolasyonuPluripotent Markör EkspresyonuBesleyici Hücre KültürüTransfeksiyon VerimliliğiKolonilerin Manuel DiseksiyonuHücre Dışı Matriks KaplamasıKeratinosit Büyüme Besiyeri
Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.