Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Sandy S.C. Hung; Alice Pébay; Raymond C.B. Wong

doi:10.3791/53174

Yöntem makalesi

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

DOI:

10.3791/53174

⸱

20 Ağustos 2015

Sandy S.C. Hung¹ , Alice Pébay¹ , Raymond C.B. Wong¹

¹Centre for Eye Research Australia & Department of Ophthalmology, University of Melbourne

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeniden programlamadaki son gelişmeler, somatik hücreleri insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) dönüştürmemize izin veriyor. Hastaya özgü hiPSC'leri kullanan hastalık modellemesi, patogenez için altta yatan mekanizmanın incelenmesine olanak tanır ve ayrıca tedavi seçeneklerini iyileştirmek için in vitro ilaç taraması ve gen terapisinin geliştirilmesi için bir platform sağlar. hiPSC'lerin rejeneratif tıp için umut verici potansiyeli, son yıllarda iPSC'lerle ilgili artan yayın sayısından (>7000) da açıkça görülmektedir. Deri fibroblastları, hematopoietik hücreler ve epidermal keratinositler dahil olmak üzere hiPSC üretimi için farklı soylardan çeşitli hücre tipleri başarıyla kullanılmıştır. Deri biyopsileri ve kan alımı, hiPSC'lerin üretilmesi için somatik hücrelerin kaynağı olarak birçok laboratuvarda rutin olarak gerçekleştirilirken, saç keratinositlerinin toplanması ve ardından türetilmesi daha az yaygın olarak kullanılmaktadır. Saçtan elde edilen keratinositler, hastalardan hücre örnekleri elde etmek için invaziv olmayan bir yaklaşımı temsil eder. Burada, koparılmış saçlardan keratinositlerin türetilmesi için basit bir non-invaziv yöntemi özetliyoruz. Ayrıca, keratinositlerin bakımı ve ardından epizomal vektörler kullanarak entegrasyonsuz hiPSC oluşturmak için yeniden programlama için talimatlar sağlıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) keşif hastaya özgü kök hücrelerin ^1-3 üretimi için uygun bir yöntem sağlayan, rejeneratif tıp alanında devrim yarattı. hiPSCs başarılı fibroblastlar ^4,5, hematopoietik hücrelerin ^6,7, idrar ⁸ böbrek epitel hücreleri ve ^9,10 keratinositler dahil olmak üzere çeşitli somatik hücre tiplerinin, elde edilmiştir. Bugüne kadar, deri fibroblastları ve hematopoietik hücreler hastaya özgü iPSCs üretilmesi için en yaygın olarak kullanılan hücre kaynağıdır. Muhtemelen, bu deri biyopsileri ve kan toplama rutin tıbbi prosedürler ve birçok ülkede kurulmuştur hastanın kan veya ci....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bireylerin insan saçı örnek toplama konak kurumlarında insan araştırma etik komitesi tarafından etik onayı gerektirir ve kurumsal kurallarına uygun yapılmalıdır.

Mızraplı Saç gelen Keratinositler 1. İzolasyonu

Buz O / N (yani, Matrigel) çözülme Ekstrasellüler Matriks (ECM) çözümü.
Önceden soğutulmuş pipet uçları kullanılarak, soğutulmuş DMEM / F12 ortamında 12 ml 200 ul ECM çözeltisi ilave edilir. Kat her bir seyreltilmiş ECM çözeltisi, 1 ml ile 12 oyuklu plaka. 37 ° C 'de, kaplanmış plak O / N inkübe edin. Kullanmadan önce, önceden ısıtılmış DMEM / F12 ortamı ile kaplanmış plaka yıkanır.
Saç kö....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

anagen (büyüme fazı), katagen (regresyon fazı) ve telojen (dinlenme fazı) ^20-21: saç 3 farklı büyüme döngüsünün evreleri geçer. anagen kıl folikülü epitel Birden çok katman içeren; Bu tabakalar ORS, IRS ve saç gövdesine (Şekil 1) içerir. Anagen kıl sonunda ORS ve saç şaft farklılaşma fesih apoptoz ile işaretlenir katajen faza, geçiş uğrar. Son olarak, apoptoz durur ve telojen folikül karakteristik telojen ile sakin olur telojen faza için katajen saç geçiş ^20,21 şişer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastaya özgü hiPSCs üretilmesi, in vitro olarak hastalıklı hücre tiplerinde patojenezinin araştırılması için eşsiz bir yaklaşım sunmaktadır ve ayrıca hastalığın fenotipleri kurtarabilir yeni moleküllerin belirlenmesi için ilaç tarama için bir platform sağlar. HiPSCs kullanılarak bu hastalığa modelleme yaklaşımı uzun QT sendromu, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı ve amiyotrofik lateral skleroz ²² de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların, umut vaat eden sonuçlar vermiştir. Çeşitli girişimler .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar teknik destek için Harene Ranjithakumaran ve Stacey Jackson'a teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (R.C.B. Wong, A. Pébay), Melbourne Üniversitesi (R.C.B. Wong), Retina Avustralya (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) ve Avustralya Oftalmik Araştırma Enstitüsü (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Vakfı Bursu (RCB Wong); Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) okul içi finansman ve Victoria Hükümeti'nden operasyonel altyapı desteği.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Antibiyotik Karışımı:
250 ng/ml Antimikotik amfoterisin B	Sigma	A2942-20ml	Antibiyotik karışımı PBS'de oluşturulur.
1X Penisilin / Streptomisin	İnvitrojen	15140-122
PBS (-)	İnvitrojen	14190-144
Nakavt Serum Replasmanı (KSR) orta:			KSR ortamı, kullanılmadan önce Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) kullanılarak filtrelenir. bFGF, kullanılmadan önce ortama taze olarak eklenir.
% 20 nakavt serum replasmanı (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM / F12, glutamax ile	Invitrogen	10565-042
1 & kez; MEM esansiyel olmayan amino asit	Invitrogen	11140-050
0.5 kez; Penisilin / Streptomisin	İnvitrojen	15140-122
0.1 mM β-merkaptoetanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, taze eklenmiş)	Millipore	GF003
Keratinosit ortamı:
60 ile EpiLife; &mikro; M Kalsiyum	İnvitrojen	M-EPI-500-CA
1 & kez; İnsan keratinosit büyüme takviyesi (HKGS)	İnvitrojen	S-001-5
Fetal Sığır Serumu (FBS) orta:			FBS besiyeri, kullanılmadan önce Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) kullanılarak filtrelenir.
% 10 fetal sığır serumu (FBS)	İnvitrojen	26140079
DMEM	İnvitrojen	11995-073
0.5x Penisilin / Streptomisin	İnvitrojen	15140-122
2 mM L-glutamin	İnvitrogen	25030
%0.25 tripsin-EDTA	İnvitrojen	25200-056
Hücre Dışı Matriks (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Aliquot Matrigel stoğu ve mağazası -80 derece; Üreticinin ardından C s talimatları. Matrigel'in stok konsantrasyonu partiden partiye biraz değişir (~ 9mg / ml). 200 & micro kullanmanızı öneririz; l 12 oyuklu bir plakayı kaplamak için matrigel (~ 150 & mikro; g/kuyu).
Kaplama Matris Kiti	İnvitrojen	R-011-K
Plazmitleri:			pCXLE-eGFP'nin yalnızca transfeksiyon verimliliğini izlemek için kullanıldığını ve yeniden programlama için gerekli olmadığını unutmayın.
- pCXLE-eGFP	Addgene	27082
- pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
- pCXLE-hSK	Addgene	27078
- pCXLE-hUL	Addgene	27080
Transfeksiyon reaktifi Fugene HD	Promega	E231B
Jelatin (domuz derisinden)	Sigma	G1890	Damıtılmış suda %0.1 jelatin oluşturun. Kullanmadan önce otoklavlayın.
Azaltılmış Serum ortamı: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
Fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici			MEF, daha önce tarif edildiği gibi mitomisin C tedavisi veya ışınlama ile inaktive edilebilir 16.
26G iğne	Terumo	NN2613R
6 oyuklu plaka (doku kültürü ile tedavi edilir)	BD Biosciences	353046

10 cm'lik tabak (doku kültürü ile tedavi edilir)	BD Biosciences	353003
Dispase	Invitrogen	17105-041	10 mg / ml'de
kullanınKollajenaz IV	Invitrogen	17104-019	1 mg / ml
TRA-160 antikorunda	Millipore	MAB4360	5 & mikro'da kullanın; g/ml
OCT4 antikoru	Santa Cruz	SC-5279	5 & mikroda kullanın; g/ml
NANOG antikoru	R& D Sistemleri	AF1997	10 & mikroda kullanın; g/ml
MycoAlert Algılama kiti	Lonza	LT07-418

12 oyuklu plaka (doku kültürü ile tedavi edilir)BD Biosciences 353043 kullanın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Epizomal Yeniden Programlama Keratinosit zolasyonu Pluripotent Mark r Ekspresyonu Besleyici H cre K lt r Transfeksiyon Verimlili i Kolonilerin Manuel Diseksiyonu H cre D Matriks Kaplamas Keratinosit B y me Besiyeri

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler