Yenidoğan Anneden Ayrılma Fare Modelinde perigenital Duyarlılık ve Prostat Mast Hücre aktivasyonu Değerlendirilmesi

Özet

Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu bir klinik öncesi modelini teşvik etmek amacıyla yenidoğan anne ayrılık, - Biz bir erken yaşam stresi paradigmasını uygulanan erkek C57BL / 6 farelerin prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre aktivasyonunu ölçüyorlar.

Özet

Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS)% 14 yaşam boyu yaygınlığı vardır ve 50 yaşın altındaki erkeklerde en sık ürolojik tanı, henüz en az anlaşılan ve çalışılan kronik pelvik ağrı bir hastalıktır. Kronik pelvik ağrı raporu ile hastaların önemli bir alt kümesi belirgin hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen işleyişi ve düzenlenmesini etkileyen erken yaşam stresi ya da kötüye, deneyimli. Gösterilmiştir mast hücresi aktivasyonu, kısmen HPA ekseninin alt aktivasyonu ile düzenlenir, her iki idrar artmış ve CP / CPPS hastanın prostat salgıları ifade edilmesi. Yenidoğan anne ayırma (NMS) HPA eksenin ve visseral duyarlılık değişiklikleri de dahil olmak üzere, kemirgen modellerinde erken yaşam stresi sonuçlarını incelemek için iki yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadır. Burada erkek C57BL / 6 farelerinde CP / KAPS preklinik model olarak NMS kullanılarak ayrıntılı protokol sağlar. Biz metodoloji tarifperigenital mekanik allodini ve mast hücresi aktivasyonu histolojik kanıtları değerlendirirken, NMS gerçekleştirmek için. Biz de erken psikolojik stres farelerde erkek ürogenital sistem üzerinde uzun süreli etkilere sahip olduğuna dair kanıt sağlamaktadır.

Giriş

Kronik pelvik ağrı başlı başına bir hastalık değildir, daha ziyade irritabl barsak sendromu (IBS) tanısı hastalar tarafından devam eden spontan ve / veya uyarılmış ağrı, interstisyel sistit / ağrılı mesane sendromu (IC / PBS), vulvodini ile ilgili bir terim, veya kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS). Bu sendromlar genellikle bağışıklık sistemi, merkezi sinir sistemi ve periferal sinir sistemi içinde işlev bozuklukları bu bozukluklara ¹ bakım ve ilerlemesine katkıda gösterilmiştir, ancak bunlar, herhangi bir ilişkili patolojisini veya tespit altta yatan nedeni olduğu birçok özelliklere eşlik eden ve paylaşan ^-3. Kronik pelvik ağrısı olan hastalar semptomları ile ortaya olasılığı daha yüksektir ek olmayan pelvik ilgili hipotalamik değişmiş işleyişi ile ilişkili bulunmuştur anksiyete, depresyon ve panik bozukluk ^4-6 da dahil olmak üzere fonksiyonel ağrı bozuklukları ve duygudurum bozuklukları, hipofizadrenal (HPA) eksen ^7-10. Erken yaşam stres veya travma Pozlama HPA anormallikleri ve ilişkili kronik ağrı sendromları ^10,11 ve gibi geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür, fonksiyonel pelvik ağrı bozukluğu olan hastaların önemli bir alt kümesi gibi istismar veya ihmal gibi olumsuz çocukluk olayları deneyimli rapor ^12-14.

Sütten kesim öncesi dönemde zaman belirli bir süre için kendi baraj yavrular kaldırmayı içerir neonatal anne ayrılık (NMS), kemirgen modelleri, erken yaşam stresi sonuçlarını incelemek için son iki yıldır kullanılmaktadır. Genel olarak, NMS doğrudan hipotalamus içinde gen ekspresyonunu etkileyebilen yanı sıra, limbik yapılarda ^15-18 aşağı akış düzenleme bozulmasıyla, HPA eksen aktivasyonu ve elde edilen anksiyete benzeri davranışları geliştirmek için gösterilmiştir. Doğru HPA ekseninin işleyişinin bozulması artan kolorektal ^19-22 katkıda gösterilmiştir Ve vajinal ¹⁶ duyarlılık kemirgen NMS modelleri tarafından görüntülenen, ancak doğum sonrası mesane iltihabı ^23-25 ​​uzun vadeli etkisi geniş karakterizasyonu rağmen, erken yaşam stresinin etkisi büyük ölçüde ürogenital organlarda unstudied gitti. Bu nedenle, aşağıdaki çalışma farelerde NMS gerçekleştirmek ve daha sonra CP / KPAS için bir preklinik model olarak erkek NMS farelerin kullanımını doğrulamak için prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre infiltrasyonu / aktivasyonunu değerlendirmek için nasıl anlatacağız.

Tanısı kronik pelvik ağrı bozukluklarının tüm CP / CPPS bel ağrısı ya da romatoid o iki belki de yaklaşık% 14 ²⁶ yaşam boyu yaygınlığı ve 4.400 $ (tahmini yıllık hasta maliyetlerinin olmasına rağmen en az iyi tanınan ve karakterize sendrom olduğunu artrit ^27). Perine, rektum, prostat, penis, testisler ve / veya karın ^28, hi deneyim CP / CPPS raporu ağrısı olan hastalarGher kontrol hastalara ²⁹ den psikolojik stres derecesi, ve ya semptomları ile yaygın mevcut komorbid kronik pelvik ağrı ya da duygudurum bozuklukları ^5,29-31 ile tanı konur. Tekrarlayan enfeksiyonu, sızan epiteli, nörojenik enflamasyon ve otoimmünite tüm potansiyel yatan / CPPS ^2,32,33 CP nedenleri olarak mast hücresi aktivasyonu ve degranülasyonunu ³⁴ olarak tahmin etti edilmiştir. Ayrıca artmıştır, mast hücresi aktivasyonu bir belirteç CP / KPAS'li erkeklerden ifade prostat salgıları mast hücre triptaz ve sinir büyüme faktörü (NGF) seviyeleri ³⁴ artmış ve bir sonraki çalışma triptazın doğruladı ve A (CPA3) carboxypeptidase CP / CPPS hastalarının ³⁵ idrar. başlangıç ​​ve CP / KAPS bakım mast hücreleri için potansiyel rolü bugüne kadar bu sendromun hayvan araştırmalarının önemli bir odak noktası olmuştur. En sık kullanılan kemirgen modeli CP incelemek için kullanılan / CPPS deneysel otoimmün prostatit ise (DAP) modeli gen^34,36-39 kullanılan türler ve suşu ile ilgili olarak, prostat iltihabı, çeşitli derecelerde sonuçlanan Tam Freund katkı maddesi, prostat antijeni deri altına enjeksiyon tutulmasıyla oluşturulmuştur. Mast hücresi infiltrasyonu ve aktivasyon / degranülasyon DAP ^34,35,40 aşağıdaki indüksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir. Mast hücreleri ³⁴ veya triptaz reseptörü PAR2 ³⁵ ya eksik transgenik fareler vahşi tipli DAP fareler aksine DAP aşağıdaki prostat taktik duyarlılık geliştirmek yok. Bu preklinik model, insan CP / KPAS özelliklerinin birçoğu çoğaltır ederken, indüksiyon protokolü doğrudan inflamasyon, enfeksiyon ya da prostat yaralanma içermeyen, genellikle farklı etyolojisi vardır ve insan koşulu, göstergesi değildir.

İnsanlarda CP / KPAS gelişimine erken yaşam stresinin etkisi büyük ölçüde soruşturulmadan uğramış; Ancak, Hu ve ark. ⁴¹ tarafından yapılan bir çalışmada, bana gösterdin çocukluk fiziksel, duygusal öyküsü bildirdi ve / veya cinsel istismar CP / KPAS düşündüren belirtileri yaşamaya anlamlı olarak daha fazlaydı kim. Dahası, onlar acı ve idrar skorları hem fiziksel hem de duygusal istismar öyküsü olan hastalarda artmış olduğunu gösterdi. Biz daha önce dişi C57BL / 6 farelerinde aynı NMS paradigma vajinal hipersensitiviteye ve anormal gen ifadesini ürettiğini göstermiştir hem vajina ve işlevsiz HPA ekseninin çıkışı ¹⁶ düşündüren mesane. Daha net erken yaşam strese maruz kalma ^12-14 ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir IC / PBS ve duygudurum bozuklukları gibi diğer komorbiditeler ^42, ile başvuran CP / CPPS hastalarının yüksek prevalans ile birlikte bu delil, bir kullanma gerekçelerini sağlar NMS modeli farelerde CP / KPAS araştırmak.

Protokol

Bu protokol açıklanan tüm deneyler Kansas Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak NIH kurallarına uygundur.

1. Yenidoğan Anne Ayırma (NMS)

1. Çöp doğum günlük hamile baraj izleyin.
   Not: doğar çöp P0 kabul edilir bir gün.
2. P1, ev kafes baraj kaldırmak ve temiz bir kap içine koyun ikincil.
3. Evde kafes kokusunu korumak için temiz eldivenli elleri arasına yatak bir avuç ovun.
4. Uygun 2 L cam beher etiketli, temiz içine ev kafes yatak 2 cm - 1 derinliğe ekleyin. Cam beher, ev kafes içinde mevcut olan herhangi bir ek zenginleşme yatak malzeme, örneğin, nestlet, kırışık kağıt yaklaşık yarısını ekleyin.
5. Yavaşça aynı beher, bireysel, tek bir çöp gelen yavruların hepsi koyun.
6. Hemen yerbir kuluçka makinesi içinde beher 180 dakika süreyle 33 ^o C ve% 50 nemlilikte tutulmaktadır.
7. İkincil kaptan baraj çıkarın ve ev kafesine onu iade edin. Vivaryum içinde kendine uygun konut konumu ev kafes dönün.
8. , NMS geçiren her çöp / baraj temiz eldiven ve ikincil kapları kullanarak her çöp için bu işlemi tekrarlayın.
9. Bunlar çıkarıldı olarak 180 dakika ayırma sürenin sonunda, aynı sırada kendi kafeslerine ibrelerin döndürür.
10. Günün erken ayrıldı ilk çöp ev kafes alın. Ev kafesinden baraj çıkarın ve temiz bir kap içine koyun ikincil.
11. Inkübatör ilk beher çıkarın ve yavrular işlerken evde kafes kokusunu korumak için temiz eldivenli elleri arasına yatak bir avuç ovalayın.
12. Yavaşça ev kafesine kaptan ayrı ayrı, yavruların taşıyın.
13. Için beher kalan zenginleşme ve yatak dönev kafes.
14. Ev kafesine ikincil kaptan baraj İade ve vivaryum içinde kendine uygun konut konumuna geri döndürebilir.
15. Su ile durulayın ve beher inkübatör geri. Ayırma işlem boyunca her çöp için aynı beher kullanın.
16. Onlar inkübatör yerleştirildi aynı sırayla NMS geçiren her çöp için bu işlemi tekrarlayın.
17. Her çöp Yapılıyor NMS P21 ile her gün için tüm bu işlemi tekrarlayın.
18. Yiyecek ve su ile tam temiz kafeslerde birlikte aynı cinsiyetten yavruları koyarak P22 üzerinde NMS ve naif yavrular vazgeçirmek. Naif yavru doğdu ve NMS fareler ile aynı koşullar altında muhafaza fakat normal hayvancılık görevleri dışında başka bir işleme tabi tutulabilir olmalıdır.

2. perigenital Mekanik Hassasiyet

1. von Frey tertibat Ayar
   1. Test odasına fareler getirin ve onları için 30 gelmesini bekleyindk evlerinde kafeslerde kalan süre.
   2. Araştırmacı fareler, yüksekliği yaklaşık 55 cm şaşırtıcı olmadan alt gelen yaklaşmasına izin için yeterli alan sağlar yükseltilmiş bir tel örgü-üst tablo (79 cm x 28 cm) altında bir emici underpad koyarak test alanını hazırlayın.
   3. Şeffaf, delikli plastik odaları altında, ayrı ayrı, 12 fareye tel örgü tablosunun üstündeki (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) kadar yerleştirin. Kaçan fareler önlemek için odaların üstünde ağır bir nesne yerleştirmeyin.
   4. Geri çekme eşiği değerlendirmesine önceki ekrana ek bir 30 dakika boyunca fareler alıştırıldı.
2. Perigenital Mekanik Hassasiyet Değerlendirme
   1. Kademeli von Frey monofillerin ⁴³ standart seti kullanarak yukarı-aşağı yöntemi uygulayın. Aşağıdaki monofilamanlar kullanın: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, ve 4.74 g.
      1. 3.22 g monofilament tabanını tutun ve geri çekilmiş mono maruzFilament.
         Not: Bazı modellerde bir geri çekilme monofilament olmayabilir.
      2. Monofilament dikey odaklı böylece sonda yerleştirmek ve fare, uyarı hareketsiz ve onun vücut ağırlığı arka pençelerinin arasında eşit olarak dağıtılır zaman hafif bir kadar orta hat kaçınarak, skrotum sol veya sağ tarafına ya uygulamak eğme filament görülmektedir.
      3. 10 sn veya hayvan olumlu bir yanıt gösterene kadar yerinde monofilament tutun.
         Not: bir pozitif tepki monofilin uygulama ya da yalama ya da monofilament yönelik ısırma davranışları karşılık olarak bir canlı pislik ya da atlama olarak kabul edilir. Bu davranışları görüntülemeden 10 sn monofilament uygulama sırasında fare hareket, monofilament asgari 1 dakika süren dinlenme dönemi izleyen tekrar test edilmesi gerekir. Bir fare ne hamle de 10 sn monofilament uygulama sırasında listelenen davranışların üzerinde herhangi sergilerse, bu olumsuz bir yanıt olarak kabul edilir.
      4. Bir laboratuar dizüstü veya dizüstü bilgisayar, olumlu veya olumsuz, bir yanıt kaydedin ve 3.22 g monofilament kullanılarak, kalan farelerin tüm bu işlemi tekrarlayın.
      5. Daha sonraki uygun monofilament kullanan farelerin hepsi sınayın. Not: Fare 3.22 g monofilament olumsuz yanıt sergiledi ise, aynı şekilde 3.61 g monofilament uygulamak ve yanıtı kaydedin. Fare 3.22 g monofilament olumlu yanıt sergiledi ise, 2.83 g monofilaman uygulamak ve yanıtı kaydedin.
   2. İlk olumlu cevap görülmektedir sonra ek bir 4 uygulamalar için, uygun şekilde, bir sonraki daha büyük veya daha küçük monofilament kullanarak her fare test devam edin.
   3. Ev kafeslere fareler dönün.
   4. Chaplan ve arkadaşları. ^43'de tarif edildiği gibi% 50 gr geri çekme eşiğinin için günlük birimlerinin deneme dizisi uygulanan son von Frey monofilin değerini kullanın.

başlığı "> 3. Acidified Toluidine Mavi Mast Hücre Boyama

1. Doku İşleme
   1. Intrakardiyak buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit ile perfüze ⁴⁵ olan farelerden prostat dokusu ⁴⁴ teşrih. Postfix'i oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4'lük paraformaldehit doku ve daha sonra 4 ° CO / N 1x PBS içinde% 30 sukroz içinde cryoprotect.
   2. Heptan küçük bir (30 mi) bir banyo hazırlayın ve kuru buz üzerine yerleştirin.
   3. 1x PBS prostat dokusunu durulayın ve bir hafif yük silin kullanarak kurutun.
   4. Dondurulmuş kadar soğuk heptan içine prostat dokusunu yerleştirin.
   5. Donmuş kadar hemen kuru buz üzerinde montaj medya ve yeri içeren bir cryomold dondurulmuş prostat dokusunu yerleştirin.
   6. Mağaza -20 ° C 'de cryomolds.
   7. Enine bir Kriyostat kullanarak 7 mikron kalınlığında cryosections halinde prostat dokusunu kesti.
   8. Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine, doku uzunluğu kapsayan 12 olmayan seri cryosections - 8 koyun.
   9. Mağaza fazla işlem kadar -20 ° C'de slaytlar tamamladı.
2. Acidified Toluidin Blue Hazırlama
   1. % 1 'lik bir stok çözeltisi hazırlamak üzere çözelti içinde kadar, 100 ml% 70 etanol ve vorteks Toluidin Mavi O 1 g ekleyin. stok çözeltisi en fazla üç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
   2. Bir karıştırıcı plaka üzerine yerleştirilmiş bir çanak içinde 100 ml su, 1 g NaCI ekleyin.
   3. 1.0 elde edilir - 0.5 arasında bir pH aralığı kadar 12 M HCI kullanılarak NaCl çözeltisi pH ayarlayın.
   4. Toluidin Mavi stok çözeltisi 8 ml ve% 1 NaCl çözeltisi 32 ml birleştirerek% 0.25 Toluidin Mavi çalışma çözeltisi hazırlayın. Toluidin Mavi stok solüsyonu toplam birleşme sağlamak ve bir girdap kullanarak karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve. çalışma çözeltisi taze yapılmış ve kullandıktan sonra atılmalıdır.
3. Prostat cryosections Boyama
   1. Dondurucu işlenecek slaytları çıkarın ve yaklaşık 30 m oda sıcaklığına gelmesini sağlayınıziçinde.
   2. Bireysel slayt monte doku bölümleri tamamen sular altında olacak emin olmak için 1x PBS yeterli bir hacmi içeren 50 ml'lik konik tüp içine yaklaşık 1 saniye boyunca slaytlar batırarak doku bölümleri yıkayın. Slaytlar bir kağıt havlu üzerinde kuru hava için izin ver.
   3. Yeterince% 0.25 çalışan Toluidine Mavi çözeltisi içeren bir cam boyama kavanoza yerleştirin slaytlar slayt monte doku bölümleri tamamen sular altında olacak emin ve 10 inkübe - süre 15 rpm'de ayarlanmış bir platformdur rocker 15 dakika.
   4. Yaklaşık 1 saniye 1x PBS Dip slaytlar aşırı Toluidine Mavi yıkayın.
   5. Slaytlar, drenajı mümkün kılması için kendi tarafta olduğu şekilde bir slayt kutusu ya da rafa slaytlar yerleştirin.
   6. 2 saat oda sıcaklığında veya O / N, en az 37 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde slaytlar kurutun.
   7. Alkol maruziyet arasındaki slaytlar tamamen kuru izin hızla alkol kullanarak slaytlar dehydrate. Bir kağıt havlu a üzerinde drenaj kuru slaytlarnd hafif görev ile silinerek arkaları ve kenarları silin.
      1. Yaklaşık 1 saniye% 95 EtOH slaytlar daldırın ve tamamen kuru izin verin. Doku mor daha mavi kuruyana kadar 10 kez - Bu işlemi 1 tekrarlayın.
      2. Yaklaşık 1 saniye% 100 EtOH slaytlar daldırın ve tamamen kuru bekleyin. Doku ve orta mavi karanlık, ama mor olmayana kadar 10 kez - Bu işlemi 1 tekrarlayın.
   8. 3 dakika boyunca% 100 ksilen slaytlar inkübe edilerek leke sabitleyin. Kurumasını bekleyin.
   9. Gliserol, PBS, ya da ksilen bazlı kalıcı montaj medya ile slaytlar lamel. Oda sıcaklığında aşırı medya ve mağaza boşaltın.
4. Ükler Mast Hücreleri
   1. 20X büyütme ışık mikroskobu kullanılarak (Şekil 2) toluidin blue-lekeli doku bölümleri gözünüzde canlandırın.
   2. Görüntülenmiştir alanı içinde bulunan mast hücrelerinin toplam sayısını ve olmayan degranüle ve degranüle mast hücreleri arasında ayrım. 40X Magnificatiyon bazı mast hücrelerindeki granülasyon durumunu onaylamak için gerekli olabilir.
      Not: Non-degranüle mast hücreleri ya da hiç soluk nükleer anahat ve / veya hücre çevresinde hiçbir granül ekstrüzyon ile yoğun metakromazi gösterirler. Degranüle mast hücreleri daha az yoğun metakromazi sergileyen ve sitoplazma içinde ve hücre sınırın dışında çekirdek ve / veya serbest granül bariz bir açık anahat var.
   3. Mevcut doku kesitinin bütünüyle olmayan degranüle ve granüle mast hücrelerinin toplam sayısını değerlendirmek için devam edin. Uzunluğu, her dokuyu kapsayan, en az 7 ek ayrı bölümlerde bu işlemi tekrarlayın.
   4. Aşağıdaki denkleme göre her bir doku / fare için toplam mast hücreleri için granüle (DG) yüzdesini hesaplayın: (DG mast hücreleri / Toplam mast hücreleri) x 100.

Sonuçlar

NMS geçiren fareler CP / KPAS göstergesidir davranışsal kanıt gösterdi. Von Frey monofiller, 8 haftalık fareler NMS kademeli bir dizi ile test edildiği zaman (n = 4) saf karşılıkları ile karşılaştırıldığında perigenital mekanik alodinya gösterilmiştir (n = 5, Şekil 2). Monofilament yönelik monofilin uygulama ya da yalama ve ısırma davranışları yanıt olarak canlı bir pislik ya da atlama olarak kaydedilir, pozitif bir davranış yanıtı ortaya çıkardı, mekanik geri çekme eşiği, bu önemli bir azalmaya (Studen...

Tartışma

Bu protokol, yetişkin erkek farelerde CP / KAPS gösterge semptomolojisini indükleme NMS şeklinde neonatal stres kullanmak için bir yöntem sağlar. Yetişkinler olarak NMS fareler önemli düzeyde perigenital mekanik alodinya, hem de prostat dokusu mast hücre degranülasyonunu kanıt gösterir. NMS kullanımı olarak, genellikle kronik pelvik ağrı ^12-14 olan hastalar tarafından bildirilen erken yaşam stresi, çoğaltır CP / KPAS bir klinik öncesi bir model geliştirilmesi yanı sıra non-invaziv indüksiyon birleşmeyle için ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gebe C57BL / 6 dişi fare	Charles River	027	Zamanlanmış veya zamansız hamile kadınlar, evde doğum için günlük olarak izlenmelidir.
2 L cam beher(ler)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Her NMS çöpü, 21 günlük ayırma süresi boyunca aynı beherde tutulacaktır.
VWR Cebri Hava İnkübatörü, Temel	VWR International	414005-124	Kuluçka makinesi 33 ° C'de tutulmalıdır; C ve% 50 nem.
Dokunma Testi Duyusal Değerlendirici, 20'li Kit (Dokunma değerlendirmesi için Semmes-Weinstein Von Frey Anesteziyometresi)	Stoelting	58011	Perigenital duyarlılık değerlendirmesi için aşağıdaki monofilamentler kullanılmalıdır: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g ve 4.74 g.
Hayvan Muhafazası (12 fare 6 sıçan)	IITC	435	Farelerin kaçmasını önlemek için akrilik hayvan muhafazalarının üzerine ağır bir nesne koyduğunuzdan emin olun.
Fareler ve sıçanlar için Mesh Standı (12 fare, 6 sıçan)	IITC	410	Rahat erişim için standı sabit bir masa üstüne yerleştirin.
Fosfat tamponlu salin	Sigma-Aldrich	P5493	10x PBS stoğunu 1x PBS'ye seyreltin.
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148	Mast hücre boyamaya hazırlanırken fareleri intrakardiyal olarak perfüze etmek ve dokuyu sabitlemek için %4'lük bir paraformaldehit çözeltisine ihtiyaç vardır.
Sükroz	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect sabit doku, 4 ° C'de% 30 sükroz çözeltisi içinde; C bir gecede.
Heptan	Sigma-Aldrich	246654	Dokuyu dondurmak için heptanı kuru buz üzerinde soğutun.
Standart Cryomold	VWR International	4557	Kriyostat kesitinden önce prostat dokusunun dondurulmasına yardımcı olmak için
: Tissue-Tek OCT Bileşiği	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidin Mavisi O	, Sigma-Aldrich	198161	Biyolojik Leke Komisyonu tarafından onaylanmıştır. Mast hücreleri için metakromatik bir boya olarak kullanıma uygundur.
Etanol, Mutlak (200 Kanıt)	Fisher Scientific	BP2818-4	Moleküler Biyoloji Sınıfı, Fisher Biyoreaktifleri; Mast hücresi görselleştirmesinden önce lekeli kriyoseksiyonları dehidre etmek için %95 ve %100 solüsyonlara ihtiyaç duyulacaktır.
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	S9888	Asitlendirilmiş NaCl çözeltisi, kriyokesitler boyanmadan önce taze hale getirilmelidir.
GeneMate Steril 50 ml Santrifüj Tüpleri	BioExpress	C-3394	Toulidin mavisi elementleri karıştırmak veya slaytları 1xPBS'ye daldırmak için kullanılan tek kullanımlık tüpler.
10 slayt için Coplin boyama kabı, buzlu cam kapaklı	Fisher Scientific	08-815	10 standart 3 x 1 inç'e kadar tutun. (75 x 25mm) arka arkaya kayar. Toluidin Blue çalışma solüsyonu, %95 EtOH, %100 EtOH ve ksilen için ayrı kaplar kullanın.
Ksilenler (Histolojik)	Fisher Scientific	X3P	Susuz kaldıktan sonra doku ksilen ile temizlenir.
Mikroskop Slayt Kutuları, 100'lü	VWR International	82003	Kutuları, slaytların depolanması ve taşınması için kullanılabilir.
Fisherbrand Mikroskop Slayt	Kutusu Fisher Scientific	22-363-400	Bu slayt kutuları tipik olarak bir kriyostatın içine sığacak kadar küçüktür.
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516	Gliserol geleneksel bir montaj ortamıdır.
Montaj Ortamı, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Montaj ortamı, lamel lamel kızağa sıkıca yapışır.
Mikro Kapak Camları, Dikdörtgen, No. 1	VWR International	48393-106	Numuneyi korumak için susuz kalmış ve temizlenmiş dokunun üzerine bir lamel yerleştirilir.
Işık Mikroskobu	Nikon		Laboratuvarımız tarafından kullanılan Gelişmiş Otomatik Araştırma Mikroskobu Eclipse 90i'nin üretimi durdurulmuş ve Eclipse Ni-E'nin yerini almıştır.