Yöntem makalesi

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

11.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53186

⸱

11 Eylül 2015

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

Bu makalede

Özet

Bu protokol, COS7 fibroblast hücreleri üzerindeki epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) etiketlenmesini ve ardından hidratlı durumdaki tüm hücrelerin korelasyon ışık ve elektron mikroskobunu açıklar. Etiket, floresan kuantum noktaları içeriyordu. Protokol, EGFR'nin stokiyometrisini tek molekül seviyesinde incelemek için kullanılabilir.

Özet

Bu protokol, COS7 fibroblast hücreleri üzerinde epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), ve daha sonra bağıntılı, flüoresans mikroskopisi ve hidre edilmiş halde, tüm hücrelerin taramalı elektron mikroskopisi (ESEM) etiketleme tarif eder. Floresan kuantum noktaları (QDS) reseptörünün bir etiket ile indüklenen kümeleme kaçınarak, etkin ve spesifik protein etiketleme sağlayan iki aşamalı bir etiketleme protokolü üzerinden EGFR birleştirilmiştir. Floresan mikroskopi EGFR hücre yerle genel görüntüsünü sağladı. Taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM) dedektörü nano çözünürlükte QD etiketleri tespit etmek için kullanılmıştır. Elde edilen bağıntılı görüntüleri hidratlı bozulmamış hücrenin doğal bağlamında tek moleküler düzeyde hücresel EGFR dağıtımı ve stokiyometri veri sağlar. ESEM-KÖK görüntüleri reseptör homodimer olarak, monomer olarak mevcut olabilir ve küçük kümelerde ortaya koymuştur. İki farklı QDS Etiketleme,yani, bir 655 nm yayan ve 800 benzer karakteristik sonuçlar ortaya koydu.

Giriş

Yeni bir yaklaşım STEM 1-3 veya bağlaşık floresan mikroskobu kullanarak ve 4-7 STEM sıvı halde etiketlenmiş proteinler ile görüntü tüm hücrelere, son zamanlarda tanıtıldı. Bu metodoloji, zar proteinleri ve bütün hücrelerin dokunulmamış plazma membranlarında tek bir molekül düzeyde stokiyometri de dahil olmak üzere protein kompleksleri uzamsal dağılımını incelemek yeteneğine sahiptir. Burada, bir floresan kuantum noktaları (QDS) reseptör proteinlerinin iki aşamalı bir özel etiketleme içeren protokol 8 ve bağlaşık ışık mikroskopisi ve ESEM sap tarif eder. Örnek olarak, EGFR, protein kinaz süper ailesine ait olan bir zar proteini incelenmiştir. Ligand bağlanma üzerine, alıcı aktive eder ve daha sonra başka bir aktive edilmiş EGFR ile birlikte bir dimer meydana getirir; daha sonra sinyal kaskadı hücre çoğalmasını 9 hareket ettirir. Anormal EGFR ekspresyonu veya aktivitesine yol açan mutasyonlar kanser 10 birçok çeşit merkezi bir rol oynamaktadır. Okuyorg Bütün hücrelerde bu membran reseptörü mekansal düzenleme işlevi ve 11-14 bunların olası değişikliklerle ilgili önemli bağlam bilgi sağlar. Ama doğrudan biochemical- veya geleneksel mikroskop yöntemleriyle 15 ile (alt) hücresel seviyede EGFR monomerlerin, dimerlerin ve kümelerin dağılımını araştırmak için zorlu kalır. Önerilen yöntem, bir kompleks içinde proteinlerin yer tespit edilebilir şekilde birkaç nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip EGFR görselleştirme yeteneğine sahiptir. Daha da önemlisi, stoikiometrik dağılımı hakkında bilgi elde edilen sağlam hücre proteinin nativ durum ile de ilgilidir.

Etiket ve reseptörü arasında kısa bir mesafe elde etmek için, EGFR doğrudan QD bir biyotin-streptavidin bağı ile, ligandı EGF ile etiketlenmiştir. Bu etiket Floresan-ve elektron mikroskopi ile her iki tespit edilebilir. Biz COS7 hücrelerinin bağıntılı görüntülemede bu etiketi kullanmışmikroakışkan bölme daha önceden 1,16,17 içine sıvı. Ancak, QD başına molekülleri streptavidin katları nedeniyle, bu etiketin düşük etiketleme verimliliği ya da oldukça pahalı deneylere lider, reseptör kümeleme neden olabilir ve bu soruşturma kapsamında protein stokiyometri sonucuna varılması mümkün değildir. Etiket uyarılmış reseptör kümelenme olan tek streptavidin kuantum dot (STR-QD) bağlanmış olduğu, biyotinile edilmiş EGF içeren bir prob ile sonuçlanan, burada sunulan iki adımlı etiketleme prosedürü kullanılarak tamamen önlenebilir. Hücreler ilk olarak biyotinile EGF ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra sabitlenir. Sabitleme aşaması protein işlemleri (tespitin hızına bağlı olarak) durduğu zaman noktasını belirler. STR-QD etiketleme protokolünün ikinci adımında, bundan sonra uygulanır. Proteinler sabit kez proteinlerin dinamik membran hareketi engellenmiş olduğundan Kümelenme yer almaz. Ayrıca, STR-QD çözeltisi, ki buDeneyin en pahalı bileşeni, optimize edilmiş bir düşük konsantrasyonda uygulanabilir ve etiketleme bu ikinci aşama, yani, QD birkaç dakika bağlanmış olabilir, zaman önemli değildir.

Bütün hücrelerde dağıtılmış olarak EGFR stokiyometri incelemek için, hücre örnekleri, silikon mikroçip 18 ile hazırlanmıştır. Iki aşamalı bir QD etiketleme ve floresan mikroskobu görüntü kayıt uygulandıktan sonra, hücreler, saf su ile durulanmış ve ESEM-STEM 19 ile hidratlanmış halde görüntüsü alınmıştır. Elde edilen bağıntılı görüntüler hidratlı hücrelerin doğal bağlamında hücresel EGFR dağılımı ve stokiyometri hakkında bilgi verir. Benzer bir yöntem Yeni bir çalışmada 7 göğüs kanseri hücrelerinin HER2 proteini incelemek için kullanılmıştır.

Protokol

Etiketleme ve Fiksasyon Reaktiflerin hazırlanması 1.

  1. Otoklavdan geçirilmiş fosfat tamponlu salin kullanılarak etiketleme tamponu (BSA-GEL-PBS), pH 7.4 (PBS) hazırlayın. % 1 BSA (sığır albümin fraksiyonu V, biotin ücretsiz) ve% 0.2 jelatin (GEL, soğuk su balıkları deriden) ve vorteks ile Supplement / iyice sallayın.
    Not: 4 ° C'de ~ 5 gün muhafaza edilebilir.
  2. Otoklavlanmış fosfat tamponlu tuzlu su, pH 7.4 yıkama tamponu (BSA-PBS) hazırlayın. % 1 BSA ve vorteks ile Supplement / iyice sallayın. Not: 4 ° C'de ~ 5 gün muhafaza edilebilir.
  3. 200 mM ila 50 mM borat tamponu (BB), borik asit stok solüsyonu hazırlayın, pH'ı 200 mM sodyum tetraborat ile 8.3 olacak şekilde ayarlanır. Not: 4 ° C'de ~ 12 ay süreyle saklanabilir.
  4. 0,2 M sodyum kakodilat stok çözeltisinden 0,1 M kakodilat tamponu (CB) hazırlayın, pH'ı 0.1 M sukroz ile takviye edilmiş, 7.4'e ayarlanmıştır.
    Not: Açılmış stok çözeltisi 4 ° C'de ~ 5 gün muhafaza edilebilir.
  5. (PBS içinde 0.1 M glisin G hazırlayınLY-PBS).
    Not: 4 ° C'de ~ 2 ay boyunca saklanabilir.
  6. Taze yapılmış veya açılmış% 16 PFA flakon, stok solüsyonu, EM notu gelen CB% 3 paraformaldehid (% 3 PFA) hazırlayın.
    Not: Açılmış stok çözeltisi 4 ° C'de ~ 5 gün muhafaza edilebilir.
  7. CB taze (ya da şişe açık) (% 2 GA)% 25 GA stok çözeltisi, EM sınıf içinde% 2 glutaraldehid hazırlayın.
    Not: Açılmış stok çözeltisi 4 ° C'de ~ 5 gün muhafaza edilebilir.
  8. 300 nM EGF-biyotin etiket çözeltisi hazırlayın
    1. BSA-GEL-PBS içinde 6 uM EGF-biyotin stok çözeltisi seyreltilir mikroçip 100-200 ul bir hacim kullanılır. Birkaç saat içinde kullanın.
  9. 10 nM STR-QD etiketleme çözüm hazırlayın
    1. , 8000 x g'de 4 dakika streptavidin QD stok solüsyonu santrifüj süpernatant alıp BB 1:10 sulandırmak. QDS farklı tipte, örneğin, QD655 veya QD800 için kullanılabilir. BSA-GEL-PBS içinde nihai konsantrasyon sulandırmak mikroçip başına 75-100 ul kullanın. Içinde kullanınBirkaç saat.

Silikon Nitrür Membran mikroçipler 2. Hazırlık

  1. Temiz oda doku ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) seviye etanol ile, ışık mikroskopisi için kullanıldığı gibi, bir mikroskop cam slayt temizleyin.
  2. Düşük toz seviyesine sahip bir laminar hava akımı tezgahında ise, 100 mm çaplı Petri kabı açın ve tabağa temizlenmiş mikroskop camı yatıyordu; Açık çanak bırakın.
  3. Tercihen karbon fiber veya diğer kaplama ile kaplanmış temiz cımbız ile, kendi depolama kutudan ve cam slayt üzerine ince (50 nm) silisyum nitrür zarları ile 4-10 mikroçipler, birbiri ardına almak. Nazikçe yanlarında mikroçip tut ve ince silisyum nitrür zarında oluşan kırılgan üst tarafa dokunmaktan kaçınınız. Her zaman zar tarafı tutmak için büyük bir özen ve dokunmayın.
    Mikroçipler dikdörtgen olmalı ve onların silisyum nitrür için örtülü dik düz kenarları Not:kolayca kavranabilir böylece yüz.
  4. Petri kapağını kapatın ve Davlumbaz getirmek. Yeni bir temiz oda doku alın ve petri yanına yatırın. 50-70 ml aseton ile bir ve etanol içindeki benzer bir hacmi ile diğer HPLC kalitesinde iki doldurarak iki temiz 200 ml'lik bir cam beher hazırlayın. İlk temiz oda doku üzerine cam slayt mikroçipler aktarın.
  5. Doku, koruyucu tabakasını karşı çıkarılması için aseton ile ilk behere tek mikroçip tek aktarın. Hafifçe mikroçip iyice durulandı sağlamak için bir beher birkaç kez hareket ederken, 2 dakika bekleyin.
  6. Onları kurumasına izin vermeden, doğrudan etanol ile beher içine mikroçipler aktarın. 2 dk bekleyin. Sonra laminer hava akışı tezgah için beher aktarın. Yeni bir temiz oda doku alın.
  7. Doku üzerine cips aktarın ve bir kaç dakika kurumaya bırakın. , Petri kabındaki cam slayt üzerine mikroçip aktarın çanak kapatınve plazma temizleyici getirmek.
  8. Plazma süpürge içine mikroçipler ile cam slayt yatırın. Silisyum nitrür membran hidrofilik yüzeyini işlemek için 5 dk temizleme programını çalıştırın.
    Not: Bizim plazma temizleyici uygulanan Uygun ayarlar şunlardır: 70 mTorr, O 2 için 11.5 sccm'lik ve Ar için 35.0 sccm'lik, 50 W ileri radyo frekansı (RF) hedefe, 5 W RF aralığı ve maksimum gaz akışı. RF yansıtmaktadır.
  9. Geri petri içine mikroçip ile cam slayt koymak ve onun kapağı kapatın. Şu andan itibaren steril mikroçip tutmaya özen gösterin.
  10. Olası zar yırtığı veya kalan kir parçacıklarının bir ışık mikroskobu altında mikroçip pencere alanları inceleyin.
  11. Laminer hava akışı tezgah için petri getirin.
  12. Laminer hava akışı tezgahında aşağıdaki öğeleri koyun: tüpler / şişe,% 0.01 poli-L-lisin solüsyonu sterilize içeren (. PLL mol 150,000-300,000 wt, steril filtre edilmiş ve hücre kültürü test), HPLCdereceli su, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 fetal bovin serumu, serum olmadan DMEM, yeni bir temiz oda dokusu steril bir 24 oyuklu plaka (12 oyuklu plaka da kullanılabilir), 96- steril takviye iyi levha, steril pipet uçları, bir pipet ve düz, yuvarlak uçlu, cımbız.
  13. 24-plaka alın ve PLL iyi bir dolgu ve HPLC dereceli su ile iki kuyu, yaklaşık bir kullanın. oyuk başına 1 ml hacmi. Bir yaklaşık kullanın 96-plaka alın ve serum serbest DMEM ile de her mikroçip iki DMEM desteklenmiş serum ile kuyu ve bir doldurun. oyuk başına 200 ul hacmi.
  14. Mikroçip işlemek için steril ipuçları kullanım cımbız Şu andan itibaren. Kısaca yanan ve daha sonra cımbız ipuçları serinlemek tarafından, örneğin, bunu başarmak.
  15. İlk temiz oda doku üzerine cam slayt mikroçipler aktarın.
    Doku, iyi PLL dolu içine altı mikroçip kadar transferi 5 dakika boyunca mikroçipler kuluçkaya yatmaktadır.
    Değile: Daha fazla mikroçip içeren bir deney için, 24-çukurlu plaka içinde ilave kuyu doldurun.
  16. Daha sonra ilk su dolu kuyuya, tek-birer onları yerleştirerek mikroçip durulayın ve oradan ikinci kuyu su dolu içine. PLL kaldırılmasını önlemek için uzun bir dakika daha suda mikroçip bırakmayın.
  17. Son olarak 96 oyuklu plakanın DMEM dolu oyuklara ayrı ayrı yerleştirin. Hücre süspansiyonu hazırlanmıştır kadar CO2 inkübatöründe 96 oyuklu plaka saklayın.

Mikroçipler Hücreler 3. hazırlanması

  1. Yaklaşık bir konsantrasyonuna sahip bir hücre süspansiyonu hazırlamak için COS7 hücreleri bir alt kültür gerçekleştirin. 5 × 10 5 hücre / ml. Hücreler tek dağılmış olduğundan emin olun.
  2. Mikroçip ile 96 oyuklu plaka almak ve her bir mikroçip hücre süspansiyonu, bir damlacık ekleyin. 5 dakika bekleyin.
  3. Cho için ters bir mikroskop ile mikroçip pencere alanlarını incelemek başlayınserum serbest DMEM ile yeni bir kuyunun içine aktarmak için doğru anı ose.
    Not: hücrelerin iyi bir yoğunluk 150 x 400 um bir pencere boyutu 24 COS7 hücreleri karşılık gelen 2500 um 2 alan başına yaklaşık bir hücre ile elde edilir. Yüksek hücre yoğunlukları hücrelerinin maksimal düzleşme engel riski var. Bir hücre SIN membran üzerine yerleşmiş sonra, yeni kuyunun içine transferi sırasında kapalı yüzen direnecek kadar yapışma geliştirmek için 3-5 dakika gerektiğini unutmayın.
  4. Yeterli hücreler pencere üzerine yapıştırılır zaman bir sonraki kuyuya mikroçip aktarın. Yukarı bakacak şekilde hücreler ile her zaman mikroçip tutun ve bu tarafa herhangi bir dokunma kaçının.
  5. Transferden sonra, yine her mikroçip penceresini inceleyin. Çok hücreler kapalı yıkandı ve kalan hücrelerin sayısı yetersiz ise, yeniden çiğnemek hücre süspansiyonu (yeni oluşan hücre kümeleri break up) ve tekrar 3.1-3.5 adımları tekrarlayın.
  6. Tüm transfer mikroçipler yeterli olduğundaonların pencere alanlarında hücreleri kalarak,. serum serbest DMEM son kuyuya cips transferi CO 2 kuvöz içine geri 96-plaka koyun ve hücreler kurtarmak izin ve birkaç saat, en iyi O / N düzleştirmek.

4. EGFR Etiketleme, Fiksasyon ve Floresan Mikroskopi

  1. Aşağıdaki adımlar için bir 96-kuyu ve bir 24-çukurlu plaka kullanılır. İlgili çözümlerle kuyu öncesi dolgu ve mikroçip başına bir satır veya sütun kullanın. 24- kuyu plaka CB, PFA ve GA ile tespit adımlar için davlumbaz altında kullanılmaktadır. Daima yukarı bakacak şekilde hücreler ile mikroçip aktarmak ve bu tarafa herhangi bir dokunma kaçının.
  2. Bir de taze BSA-GEL-PBS ile mikroçip yerleştirerek mikroçip durulayın, sonra 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir.
  3. 37 ° C 'de 3 dakika süre ile 300 nM EGF-biyotin çözeltisi ile inkübe edilir. Hücreler EGF-etiketli düzeyde EGFR endositozu başlayacak Çünkü, Ste mümkün olduğunca hızlı ilerlemeks 4.4.
  4. PBS ile 3 kez ve CB ile 1 defa (şimdi 96 plaka oda sıcaklığında yine) durulayın.
  5. 10 dakika süreyle% 3 PFA inkübe edin.
  6. Cips CB ile 1 kez, ve PBS ile 3 kez durulayın.
  7. , 2 dakika boyunca GLY-PBS içinde inkübe 1 kez PBS ile 2 kez çalkalayın.
  8. 10 dakika boyunca 10 nM STR-QD inkübe edin.
  9. BSA-PBS ile 4 defa yıkayın.
  10. Cam alt 35 mm çanak RT'de BSA-PBS ile önceden doldurulmuş bir mikroçip Batmak.
  11. QD etiketli hücrelerin diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri ve floresan görüntüler elde.
    1. QD655 etiketli hücrelerin genel görüntüler için 40X hava hedefini kullanın. Neşr edilen floresan ışığın en verimli şekilde toplanmasını sağlar (örneğin, 63X için) Bir yağ batırma objektifi kullanarak; QD800 ile etiketlenmiş hücrelerin görüntüleme zaman bu özellikle gereklidir.
    2. 420 nm sui yukarıda yayılan ışığın toplanmasını 340 ve 380 nm arasında floresan uyarma ışık QDS ortaya ve izin veren bir filtre küp kullanınEn QDS (bu durumda filtre küp A) tablo.
    3. Numuneyi zarar verebilir çok yoğun ışık önlemek için ışık yoğunluğunu en aza indirin. Tüm QDS sinyaller yakalanır ve böylece QDS floresan yanıp sönen bir davranış olduğunu belirterek, en az 300 msn pozlama süresini ayarlayın.
    4. Işık yoğunluğunu ayarlayın ve ışık yoğunluğunu en aza indirerek büyütme, görünür görüntü gürültüsü olmadan parlak görüntüler sunmak için.
      Not: Görüntü serisi aynı bölgeden alınan Alternatif olarak, daha kısa maruz kalma süresi de kullanılabilir. Bu dizi, resmin, böylece ortalama gürültü azaltılmasına yol açan, maksimum projeksiyon görüntüsünü elde etmek için işlenebilir.
  12. BSA-PBS ile dolu bir 96-çukurlu plaka iyi geri (hücreler yukarı bakacak şekilde) görüntülü mikroçip yerleştirin.
  13. CB mikroçip 1 kez durulayın.
  14. 10 dakika boyunca% 2 GA inkübe edin.
  15. CB 1 defa ve BSA-PBS ile 3 kez durulayın.
  16. ESEM i kadar Mağaza mikroçipmaging, BSA-PBS içinde yeni bir 96-kuyulu plakanın kuyularının önceden doldurulmuş. Her mikroçip HPLC dereceli su ile dört kuyuların bir satır doldurun.
    Not: numuneler bir kaç hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir, bununla birlikte, tam bir görüntüleme serisi iki gün içinde gerçekleştirilir, en iyi sonuçlar elde edilir. QDS yavaş yavaş bu nedenle ESEM görüntüleme yapılmadan önce fazla 10 gün beklenmesi tavsiye edilmez, numuneden ayırmak başlayacaktır.
    Not: Floresan görüntüleri gelecek analizi için saklanır. Görüntülerde hücrelerin pozisyonları kolayca SİN penceresinin köşeleri lokalize ve köşelere göreli konumlarını ölçmek yoluyla elektron mikroskobu görüntüleri ile ilişkili olabilir.
    Not: Bu yüksek kaliteli floresan görüntüleri yazdırmak ve ESEM görüntüleri kaydederken oryantasyon amaçlar için kullanılması tavsiye edilir.

Tüm Hücreleri 5. Islak ESEM-KÖK

  1. Islak KÖK için Esem hazırlayın
    1. Gazlı ikincil elektron d monteetector (GSED) ve (numune altında bulunan) KÖK detektörü içeren Peltier sahne.
    2. Aşamasında soğutma suyunun akışını başlatmak ve 3 ° C sıcaklık ayarlayın.
    3. Sahne xy sıfıra koordinatları ayarlayın ve yaklaşık 6 mm çalışma mesafesi ayarlayın.
  2. Mikroçip plastik bir kutu içinde, dondurulmuş soğutma elemanları olarak örneğin, serin ile ESEM görüntüleme sırasında, 96 oyuklu plaka tutun.
  3. Precooled ESEM-STEM aşamasında içine bir örnek yüklenmesi için, soğutma konteyner: 96-plaka almak ve yakın açıldı ESEM sahneye yerleştirin. Bunun yanında, yeni bir temiz oda doku koyun.
  4. Hızla iyi HPLC dereceli su ile dolu içine yaklaşık bir saniye o dört kez, her seferinde daldırarak (yukarı bakacak şekilde hücreler) ile bir mikroçip durulayın.
  5. Temiz oda dokusu üzerindeki mikroçip kısaca ters kurulayın ve önceden soğutulmuş aşamaya mikroçip yerleştirin. Hücreler ıslak kalmasını emin olun, bu olabilir,Bir yansıtıcı yüzey tarafından tanınan (donuk yüzeyinde sonuçları kurutma).
  6. Soğutmalı HPLC dereceli su 3 ul (pipet ucuyla yüzeyine dokunmamaya dikkat edin) ile örnek yüzeyini ıslak ve evre örnek düzeltmek.
  7. Numunenin yakın sahnede üç ek 3 ul su damlacıkları yerleştirin.
  8. Numune odasına kapatın
  9. . Basıncı Pa 800 ila 1.500 beş kez bisiklet ile numune odasına Temizle 800 Pa ile bisiklet sonlandırın.
  10. Elektron ışını (30 kV) Anahtarı ve mikroçip penceresinin konumu aramak için, yani her iki dedektörleri, GSED ve STEM dedektörü ile en düşük büyütme altında numune inceleyin.
    Not: Su tabakası çok kalınsa, pencere görünmeyebilir. Bu durumda, 760 Pa basınç düşürücü başlar ve bir kaç dakika bekleyin. Pencere ilk GSED ile görünür hale gelir.
  11. Specim hareket ettirerek görüntünün merkezinde SİN zar penceresini yerleştirinsahneye tr ve 750-720 Pa basıncı azaltmak.
    Not: Su tabakası kadar ince ise, pencere de STEM detektörü ile görünür hale gelir.
  12. Bundan görüntüleri kaydetmek için KÖK dedektör karanlık alan segmentini kullanın. İlk olarak, tam pencere alanında tüm hücreleri gösteren bir ya da iki görüntü kazanır.
  13. Işık mikroskobu görüntüleri ile bu ESEM görüntüleri karşılaştırın SıN penceresinin köşeleri bulun.
  14. Büyütme, döndürme, yansıtma ve olası karşılaştırarak hem mikroskopi yöntemleri kareleri koordine ilişkilidir. Her iki görüntüde de aynı hücreleri bulun.
  15. Böyle eucentric yüksekliği, ince odaklama ve objektif stigmatism düzeltilmesi gibi görüntüleme ayarlarını yapmak için küçük özellikleri ile çok küçük kir parçacıklarını veya hücre bölge seçin. En azından 50.000X büyütmede çalışmak, bir elektron prob akımı yaklaşık 0,6 nA, 30 ms'den bir piksel bekleme süresi ve 1024 x 884 piksel boyutunu kullanın.
    Not: Diğer ayarlar da b olabilire sürece elektron dozunun bir artış önlenir olarak kullandı.
    Not: çok temiz çalışma bile protokol temiz oda ortamında idam değil, çünkü yonga yüzeyleri pratikte her zaman, bazı kir parçacıkları içerecektir.
  16. QD etiketli hücreleri KÖK görüntüleri kaydetmek için, floresan görüntüleri bakın ve ilgi bir hücreyi seçin.
    Not: Bu güçlü QD sinyallerini gösteren bir hücre ile başlamak en iyisidir.
  17. Bu hücrenin bir KÖK genel görüntüsünü kaydedin.
  18. Hücre sınır görünür bir çevresel bölgeye gidin ve 50.000X büyütme ulaşmak için yakınlaştırmak.
  19. Bireysel QDS gösteren Tutanak görüntüleri, 20-30 mikro-saniye piksel bekleme sürelerini kullanın. Sadece bir kez yüksek büyütme ile radyasyon hasarı, görüntü her bölgeyi önlemek için.
    Not: Genellikle, bu aşamada hem odak ve stigmatism düzeltilmesi de, bazı ince ayar gerekiyor.
  20. Yüksek büyütme görüntüleri, zoom-out ve ac yeterli sayıda Kayıttan sonraquire başka KÖK genel görüntü, sadece karanlık dikdörtgenler gibi yüksek büyütme ile kaydedilmiş bölgeleri tasvir.
    Not: Bu genel görüntüler daha sonra ESEM ve floresan görüntüleri ilişkilendirmek için ve hücresel bağlamda yüksek büyütme görüntüleri kesin konumunu belirlemek için görev yapacak.
  21. Ilgi sonraki hücreye geçin bir bakış görüntüyle başlarsanız, yüksek büyütme görüntüleri bir dizi kaydedebilir ve bir bakış imajı ile biter.
  22. Bir ESEM görüntüleme oturumun sonunda, odasını havalandırmak başlamadan önce 850-900 Pa basınç artışı.
    Not: Bu basınç artışı hala ıslatılmış yüzeye sahip mikroçip kurtarma şansı geliştirir; Bununla birlikte, bu her zaman elde edilemez. İsterseniz kurutulmuş olmamıştı örnek bir zaman içinde daha sonraki bir noktada Esem yeniden araştırılmış, BSA-PBS restore edilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1 ve 2 sağlam, tamamen hidratlanmış COS-7 hücrelerine görüntülenmiştir QD655 etiketli zara-bağlı EGFR temsili görüntüleri gösterir. Şekil 1 a DIC görüntü hücrelerinin zar topografya bir izlenim verir ve Şekil 1b karşılık gelen floresan görüntü EGF-Biyotin inkübasyon. Şekil 1A 3 dakika sonra EGFR dağılımını göstermektedir ve B her ikisinden birleştirilir 40X hava amacı ile kaydedilen görüntüler. EGF aktif EGFR, tüm hücre yüzeyi üzerine dağıtılır. En hücrelerinde floresan (Şekil 1B) hafif bir geliştirme EGFR 20 bir lokal artış meydana gelmesini gösteren hücre kenarlarında görülebilir. Benzer bir protokol kullanılarak gerçekleştirilir kontrol deneyleri (veriler gösterilmemiştir) belirli bir EGFR etiketleme sunmaktadır. Bu kontroller şunlardır: ce önceki inkübasyon olmadan 1) kontrol etiketlemeolmayan biyotinlenmiş EGF ve STR-QDS EGF-biyotin, yani, STR-QDS sadece inkübasyon ve 2) bir inkübasyon lls.

Dikdörtgenler ile işaretlenmiş üç hücre daha ESEM-KÖK ile incelenmiştir. Şekil 1C tasvir ESEM-STEM görüntüleri - E bu hücrelerin düşük büyütme bakışlar göstermektedir. Bu iletim görüntüsü silisyum nitrür (SİN) görüntüleme penceresi ile bir silikon mikroçip yerleştirilen hücre üzerinde bulunan ince bir su tabakası ile hidratlanmış halde bütün hücreler göstermektedir. Mikroskop su buharının vakum bölmesi ve numune sıcaklığı ve basıncı arasındaki denge hücreleri üzerinde sıvının bir ince tabaka sağlayacak şekilde ayarlandı. Bireysel hücreleri kolayca SıN zar penceresinde şekil ve konum nedeniyle kabul edilebilir. Düşük büyütme ESEM-STEM görüntüleri komşu hücrelere doğru hücre kenarından uzanan, örneğin filopodia gibi ince yapılar, ortaya, ve bazı yapılarince hücre bölgelerin içinde. Numune boyunca iletim kullanılan enerji (30 keV) elektron mümkün değildir, çünkü çekirdeği içeren Kalın merkezi hücresel bölgelerde beyaz görünür.

Yüksek çözünürlüklü ESEM-STEM görüntüleri ince periferal bölgelerde kaydedildi. Ince bir sıvı tabaka içinde hücreler, ince bölgelerde nanoparçacıkların ESEM-KÖK için uzamsal çözünürlük 3 nm miktar için bir önceki çalışmada 6 tespit edilmiştir. Şekil 2A gösterilen dört yüksek çözünürlüklü görüntüler - D Şekil 1C küçük dikdörtgenler yerlerde kaydedildi - E. büyütme parlak, mermi şeklindeki çubuklar görünen bireysel QDS, ayırt etmek için yeterli olduğunu kullanılmış, her bir bireye bağlı EGFR. QD655 6 x 14 nm 2 tipik boyutlara sahiptir.

Dikdörtgen alana karşılık gelen Şekil 2A, (fig hücre belirtilen1C yeniden) bir zar üzerinde QD etiketleri görüntü kapısı çaprazdan kat gösterir. Bu membran yapısı çevreleyen zar bölgelerden daha yüksek EGFR yoğunluğuna sahiptir. Çeşitli yerlerde, iki etiket yakın idi. 20 ve 24 nm mesafelerde iki örnek ok uçları ile gösterilir. Etiket Bu çiftleri EGFR dimerleri ait olarak yorumlanır. Şekil 2B, bir hücre (Şekil 1D, sol dikdörtgen) kenarından bir örnek verir EGFR monomerler ve dimerler da görülebilir. Şekil 2C (Şekil 1C, sağ dikdörtgen) bir düşük değerli floresan sinyali, örneğin, düşük değerli EGFR yoğunluğu olan bir bölgenin kaydedilmiştir. Bununla birlikte, EGFR ayrıca dimerler burada bulunmuştur. Buna ek olarak, 10 ya da 11 düzeyde EGFR olarak iki öbek mevcuttu elipse (bakınız). Şekil 2B birçok monomer ilave olarak, 5-6 düzeyde EGFR içeren küçük kümelere sahip bir membran kat (Şekil 1E) bir başka örneğini göstermektedirve dimerler.

Şekil 2'de tüm etiket pozisyonları için tespit edilmiştir, bu veriler, bir çift bağıntı fonksiyonu 21 g (x) 'den elde edilebilir bilgilerin tür bir örnek olarak,. Bu analiz, bu protokol bir parçası değildir ve işlem tarif etmektedir Not Başka bir yerde 6,7. g (x), bir referans parçacıktan belli bir radyal mesafesi x içinde bulunabilir bir parçacığın şansı bir ölçüsüdür. g (x) = 1 rasgele dağılım gösteren ve büyük bir değer kümeleme için kanıtıdır. 210 etiket toplam pozisyonları otomatik Şekil 2A-D, dört görüntülerde tespit edilmiştir, g (x) 5 nm'lik bir boyut ve bin 10 nm'lik bir bant genişliğine sahip bir düzeltme filtre kullanılarak hesaplandı. G (x) eğrisi (Şekil 3) 25 nm'lik bir tercih edilen merkez-merkez QD mesafeyi gösterir. EGFR böylece rastgele odaklı ancak bunların önemli bir kısmının bu tercih mesafede ikamet değildir. Bir approximat itibarene moleküler bir modeli, 6 (Şekil 3 ek), biz QD ve EGF bağlama cebi arasındaki merkezden merkeze mesafe anlamına geldiği tahmin etmek ~ bir EGFR dimer bağlı iki QDS arasındaki 14 nm ve merkezden-merkeze mesafe ~ 27 nm (bu değer nedeniyle bağlayıcı esnekliği birkaç nanometre göre farklılık muhtemeldir) olacak. Tercih etiket mesafesi yönteminin hassasiyeti içinde EGFR dimeri için beklenen etiket mesafe ile böylece tutarlıdır. G (x) eğrisi verileri ile tutarlı kümeleri olduğunu belirten, en fazla 300 nm mesafe için birden daha büyüktür. Bu analiz EGFR stokiyometri bizim yöntemi ile çalışıldı edilebileceğini göstermektedir.

Şekil 4, markalama EGF-QD800 ile gerçekleştirildi ve 63X yağa batırılmış objektif floresan görüntü için kullanılması haricinde, Şekil 2'de olduğu gibi benzer bir sonuç görülmektedir. Bu veriler, bu tipik sonuçları ne zaman bulunur teyitEGFR markalama yakınındaki tayfta yayan QDS, ile yapılır. Şekil 4A, bir temsili hücrenin floresan görüntü, Şekil 4B ESEM-KÖK genel modunda aynı hücre gösterir ve Şekil 4C kaydedilen 150,000 x büyütme görüntü, bir hücrenin üst zarı sınırında (Şekil 4B'de dikdörtgen bakınız). 2A ve D Şekil benzer görüntüler bir membran kat üzerinde QD etiketli EGFR yakalamak ve monomerik, dimerik ve kümelenmiş reseptörleri gösterir. Elektron yoğun QD çekirdek ~ 5 nm onların küçük çekirdek büyüklüğü 22 ile tutarlı 655 nm'de yayan QDS çekirdek biraz daha küçük ve yuvarlak, göründüğünü unutmayın.

figure-results-1
Şekil 1. Korelatif DIC, EGF-QD655 floresansı ve ESEM-KÖK tamamen hidratlanmış COS-7 hücreleri üzerinde EGFR etiketli Rong>., plazma zarının topografik izlenimi veren SiN membran pencere alanının üzerine yetiştirilen hücreler, bir (A) DIC görüntüsü. Merkezi bir konumda bulunan SİN zar penceresinde hücreleri gösteren (B) Floresan görüntü (kesik dikdörtgen ile işaretli). (C - E) A ve B dikdörtgen ile işaretlenmiş hücrelerin üç ESEM-STEM düşük büyütme görüntüleri. Bu hücre genel bakış görüntüleri sonradan kaydedilen yüksek çözünürlüklü görüntülerin kesin yerini belirlemek için hizmet vermektedir. (Şekil 2A-D gösterilmiştir), dört yüksek çözünürlüklü görüntüleri yeri beyaz dikdörtgen ile işaretlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. Yüksek çözünürlüklü ESEM-STEM görüntüleri membrana bağlı EGFR tasvir. Şekil 1B işaretli alanın 75,000X büyütme (A) Mikrografik. Birçok monomerler görebilir. Birkaç dimerleri ok uçları ile gösterilir. (B) ve sol 50,000X büyütme edinilen (C) görüntüleri, sırasıyla sağ membran alanları Şekil 1C işaretli. Düzeyde EGFR kümeleri özetlenmiştir. Şekil 1D işaretlenmiş yerde 50,000X büyütme ile kaydedilmiş (D) görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Radyal mesafenin fonksiyonu olarak Şekil 3. Pair korelasyon fonksiyonu g (x) arası partiküller için belirlenen x Şekil 2A-D tespit 210 etiket cle mesafeler. merkez-merkez QD mesafesi ag (x) = 1 rastgele şans gösterir, burada, rasgele daha ortaya çıkan çok daha yüksek bir şansa sahip olduğunu gösterir nm 25 ° C sıcaklıkta yoğun. Kesikli çizgi rasgele dağılım göz temsil eden g (x) için bir rehber niteliğindedir. Içerlek bağlanmış EGF ve biotin ile bağlanmış streptavidin kaplı QDS ile EGFR dimerinin bir yaklaşık moleküler modelini göstermektedir. Streptavidinin modelleri, EGF ve EGFR 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF) CPK modelleri elde edilmiştir, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO ve 2GS6 (EGFR) Jmol Version tarafından oluşturulan RCSB Protein Protein Databank, yapıların 12.2.15. RCSB Ligand Explorer Sürüm 1.0 çizilmiş biotin modelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/53186/53186fig4.jpg "/>
Şekil 4. Örnek teşkil COS-7 hücre EGF-QD800 ile etiketlenmiş ve karşılıklı floresan ve ESEM-KÖK ile görüntülenmiş. (A) Floresans görüntüsü, (B), düşük büyütme genel ESEM-STEM görüntüsü. (C) 150,000X büyütme b dikdörtgenin yerde kaydedilen yüksek çözünürlüklü görüntü. Monomerik, dimerik ve kümelenmiş EGFR EGF-QD655 ile etiketleme benzer algılanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bütün hücrelerde EGFR gibi membran proteinleri, uzamsal dağılım ve stokiometrinin incelenmesi işlevi ve 11-14 bunların olası değişiklikler hakkında önemli içerik bilgilerini sağlar. Doğrudan bilgi hücre veya hücreler 15 arasındaki farklılıkların protein lokalizasyonu ile ilgili kayıp olduğu için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerle bir hücre içi seviyesinin üzerinde monomerlerin, dimerlerin ve kümelerin dağılımını incelemek için zordur. Bunu stokiyometri birey, sağlam hücreler 4-7 kapsamında ele böylece burada açıklanan etiketleme ve mikroskopi yöntemleri, birkaç nanometre uzunluğu ölçekte protein kompleksleri görünümlerini verir. Bu (süper çözünürlük) ışık mikroskobu 23 çözünürlüğü bir protein kompleksi yapan moleküllerin ayırt yetersiz olduğundan mümkün değildir. Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) bir topluluk ortalama tekniği sup ve mutlaka enerji transferi 25 kısa menzilli bir sonucu olarak dimerleri ve daha yüksek mertebeden kümelerini algılamaz. Proksimite ligasyonu deneyleri 26 aslında mesafeleri ölçmek ve bundan dolayı benzer bir protein yoğunluğuna sahip bir selüler bölgeden, rasgele şansa tespit yakınlıklarına bir dizi gelen kaçınılmaz olarak, yüksek protein yoğunluğuna sahip bir selüler bölgesi arasında ayrım, ancak protein içeren yeteneğine sahip değildirler etiketler arasında belirgin mesafeler sergileyen kompleksleri. Protein kompleksleri bileşenleri görselleştirmek için gerekli olan yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile elde edilir. Bununla birlikte, bütün hücreler, geleneksel TEM plazma membranı 27 ya da plazma zarı kopyalama yoluyla dilimleme veya membranın rastgele oluşturulmuş küçük parçalar halinde elde edilen 28,29 kopma ince örnekleri / kesitlerin şartı ile sınırlıdır. Plazma membranı böylece eksikliği gelen bir bütün olarak görüntülü değildirmuhtemelen önemli hücresel kapsam bilgisi.

Hücrelerde protein stoikiometrinin çalışma için diğer deneysel zorluklar uygulamalı protein etiketleme kaynaklanmaktadır. Yaygın olarak kullanılan immün reseptörü ve etiket arasındaki bire bir stoikiometri yalnızca monovalent sonda ile elde edilebilir zorluk taşımaktadır; birincil ve ikincil antikorlar gerekmektedir, bu durum böyle değildir. Protein stokiyometri ile ilgili bilgiler elde etmek için, bir prob reseptörü üzerindeki bir epitopa bağlanır ve benzersiz bir flüoresan sonda veya diğer tarafta bir yüksek atomik sayılı, nano bir bağlanma sahasına sahiptir gerekmektedir. Komşu bir protein, homodimerler ya da daha büyük kümeler arasında bir ayrım mümkün değildir, böylece İkinci olarak, antikor etiketleme ile elde hassas en azından EGFR ailesi reseptörleri için, 30 nm büyük boyutları 30 nedeniyle sınırlıdır. Çok küçük spesifik etiketleri edebiyat ve ca bilinmektedirn, hücre içi etiketleme 31 için daha uygulanabilir, ancak bu genel olarak kullanılmamaktadır. Bütün etiket (EGF-biyotin-streptavidin QD) uzunluğu EGFR gibi benzer bir boyuta sahiptir ve yeterince küçük bir dimeri tespit edebilecektir. Ayrıca, tarif edilen iki adımlı etiketleme prosedürü markalama uyarılmış reseptör kümeleme önler.

Önerilen yöntem, çok zordur, fazla etiketli proteinlerin floresan mikroskobu daha fazla değildir. Adım sayısı kadar ekler ve aşamalarından birinde bir hata deneyde bir arızaya yol açabilir Bununla birlikte, bir deney, büyük bir dikkatle yürütülen gerekmektedir. Mikroçipler İşleme tavsiye edilir TEM ızgaraları ancak bazı eğitim, boş cips işleme daha sıkıcı değil. Bütün sulu hücrelerin ESEM-STEM muhtemelen en zor olan ve QDS görselleştirmek için gerektiği gibi 3 nm civarında bir çözüme ulaşmak için, en azından bir uzman operatör ve uygulama birkaç gün gerektirir. Radyasyon barajSoruşturma kapsamında numune yaşı bir risk sunar. Basınç ve sıcaklık dikkatli bir şekilde bir su tabakasının muhafaza edilmesi dikkat edilmelidir. Ayrıca, su tabakasının kalınlığı, hücreler arasında değişebilir. Başka bir yerde tarif edildiği gibi, 6 Bu örnek yukarıdaki gaz halindeki elektron dedektörü ile su tabakasının varlığını tespit için tavsiye edilir. Hücresel bölgeler sadece zarar görmemesi için bir veya iki kez görüntülü olmalıdır.

Yöntemin bir önemli sınırlaması ultrastrüktürü ile ilgili yüksek çözünürlüklü bilgi yoktur olmasıdır. Diğer teknikler, örneğin, kriyo TEM için, protein yapısı ve hücresel ultrastrüktürel 15 çalışma için ihtiyaç vardır. İkincisi, zaman atlamalı mikroskobu canlı hücrede protein katları dinamik etkileşimi okuyan radyasyon hasarı nedeniyle mümkün değildir ve state-of-the-art ışık mikroskobu 23 gerektirir. Şu anda, bizim yöntemi l yana dimerlerin mutlak seviyesinin belirlenmesi yeteneğine sahip değildirAbeling verimliliği bilinmiyor ancak gelecekte bu tür veri eklemek için bekliyoruz. Bu dimerleri mevcut veya değilse söylemek yine de mümkün. Literatürde itibaren% 15 civarında hatta bir etiketleme verimliliği yeterli istatistiksel anlamlılık 32 dimerlerini algılamak için yeterli olduğunu bilinmektedir.

Bu özel antikorların biyotinile Fab fragmanları ile, bunların ligand yoluyla diğer zara bağlı reseptörleri çalışma kolaylıkla mümkündür, ya da tarif edilen iki adımlı etiketleme protokolü kullanarak diğer küçük bağlayıcılar 7 ile. Daha önce QDS iki farklı renk (boyutlar) kullanılabilir, ve altın nanoparçacık markalama önceki çalışma 6 kullanılmıştır olduğunu göstermiştir beri, aynı deneyde birden fazla protein türü etiketlemek için uygun görünmektedir. Birden fazla protein türlerinin stoykiyometrisini çalışması için temel zorluk saygı elde edilen göreli stokiyometriye bir normalleşme her iki tür için ya da en azından benzer bir etiketleme verimliliği sağlamaktıretiketleme verimliliği ive. Bununla birlikte, bu çalışmada kullanılan iki farklı QDS (Şekil 2 ve 4) işaretleme verimliliğine çok farklı görünmemektedir. QDS iki aşamalı etiketleme ve bağlaşık floresan mikroskobu ve ESEM-STEM kapsayan anlatılan yöntem bütün hücrelerin sağlam plazma zarlarında membran proteinlerinin karmaşık etkileşimi incelemek için uygulanabilir bir yöntem sunar.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

INM aracılığıyla verdiği destek için E. Arzt'a, ESEM'deki yardımı için M. Koch'a ve mikroçipleri sağladığı için DENS Solutions'a teşekkür ederiz. Araştırma kısmen 2013 Leibniz Yarışması tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ters floresan mikroskobuLeicaAF6000 + DMI6000B
ESEMFEI CompanyQuanta 400 FEG
DMEM (1x) + GlutaMax + glikoz + piruvatGibco31966-021
DPBS (1x) - Kalsiyum klorür - Magnezyum kloridGibco14190-144
Fetal sığır serumu, Performance Plus (FBS)Gibco16000-036
Hücre StriptizciMediatech, Inc.25-056 Cl
Su, HPLCSigma-Aldrich34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBSCarl Roth1058.1
Etanol, Rotisolv HPLC sınıfıCarl RothP076.2
Albümin Fraksiyonu V, biyotin içermez (BSA)Carl RothO163.2
Jelatin, soğuk su balık derisindenSigma-AldrichG7041-500G
GlisinCarl RothT873.1
Epidermal Büyüme FaktörüMoleküler ProblarE3477Biotin-XX Konjugat (biotin EGF)
Sodyum teraborat dekahidratSigma-AldrichS9640-500G
Borik asitSigma-AldrichB6768-500G
Qdot 655 streptavidin konjugeMoleküler Problar
Qdot 800 streptavidin konjugeMoleküler ProblarQ10173MP
boyutlarında silisyum nitrür membranlı silikon mikroçipler; m x 0,40 mmDENS ÇözümleriÖzel yapım
Q10121MP 50 nm kalınlığında ve 50 &

Kaynaklar

  1. Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid. ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).
  2. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).
  3. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).
  4. Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  5. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).
  6. Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy. Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).
  7. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy. Science Advances. under revision, (2015).
  8. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).
  9. Herbst, R. S. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).
  10. Normanno, N., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, 2-16 (2006).
  11. Hofman, E. G., et al. EGF induces coalescence of different lipid rafts. J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).
  12. Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib. J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).
  13. Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).
  14. Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding. FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).
  15. Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).
  16. Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).
  17. Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid. Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).
  18. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  19. Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase. Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).
  20. Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464, 783-787 (2010).
  21. Stoyan, D., Stoyan, H. Estimating pair correlation functions of planar cluster processes. Biom. J. 38, 259-271 (1996).
  22. Gao, J., et al. In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots. Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).
  23. Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).
  24. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).
  25. Warren, C. M., Landgraf, R. Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control. Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).
  26. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).
  27. Hoenger, A., McIntosh, J. R. Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).
  28. Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy. Micron. 37, 14-34 (2006).
  29. Pinto da Silva, P., Kan, F. W. Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces. J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).
  30. Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments. Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).
  31. Orlov, I., et al. Live cell immunogold labelling of RNA polymerase. II. Sci. Rep. 5, 8324(2015).
  32. Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy. Front. Immunol. 4, 427(2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Floresan Mikroskobuevresel Taramal Elektron MikroskobuTaramal Ge irimli Elektron MikroskobuKuantum Noktas EtiketlemeEGFR StokiyometrisiCOS7 H creleriMembran Resept r Da l mTek Molek l G r nt leme

İlgili makaleler