Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme
Bu makalede
Özet
Özet
Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 'de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.
Giriş
Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Nöronal Kültür
Not: pluripotent kök hücreleri yeniden programlama Fibroblast geç kortikal atalarıdır dorsal telencephalon soy, türetme, büyütme ve bankacılık bağlılık (LCP) Boissart ark 4 tarif edildi. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşma, aynı zamanda hafif değişiklikler Boissart et al 4'e göre gerçekleştirilmiştir. Diğer prosedürler nöronlar içine farklılaşma ardından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine doğrudan fibroblastların yeniden programlama için geliştirilmiştir. O piramidal Glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verir, çünkü bu protokol muhafaza edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada IPSC türetilen piramidal nöronların kültür dendritlerin omurga ölçümü için standart bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, insan omurga nöronlar üzerinde olgunlaşma ve standart kemirgen nöronal kültürlerinde dikenler olgunlaşması ve in vivo hayvan modellerinde ile olası karşılaştırma analizine izin verir.
Şekil 1A kortikal piramidal nöronlar üretimine izin veren farklı kültür adımların bir düzeni temsil etmektedir. Böyle şematik temsili daha i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı.
Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşılaştırıldı. Yoğunlukları tüm vakalard.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Institut Pasteur, Bettencourt-Schueller vakfı, Centre National de la Recherche Scientifique, Paris Diderot Üniversitesi, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva Yardım Vakfı, Cognacq Jay Vakfı, Orange Vakfı ve Fondamental Vakfı. LG, Sağlık Bakanlığı'ndan bir lisans bursu ile desteklenmektedir. Bu çalışmanın ilk aşamasında BitPlane'in, özellikle de Georgia Golfis'in yardımına teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| D-PBS (1x), sans Kalsiyum, Magnezyum ve Fenol Kırmızı | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | 14190169 | |
| Poli-L-Ornitin Çözeltisi Biyoreaktif | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Fare laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Takviyesi | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| A Vitamini Olmadan B-27 Takviyesi (50 kat) | Gibco / Yaşam Teknolojileri | 12587010 | |
| DMEM / NUT. KARIŞIM F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | 31331028 | |
| Nörobazal Med SFM | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | 21103049 | |
| 2-merkaptoetanol | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | 31350-010 | |
| Penisilin-Steptomisin | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | |
| GFP Tavşan Serumu Poliklonal Antikoru | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | A-6455 | |
| At serumu | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan | Gibco/ Yaşam Teknolojileri | A11034 | |
| Poliklonal Anti-betaIII tübülin Antikor | Kırlangıç | AB9354 | |
| Kapak Camı 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Gibco/ Life Technologies | ile Uzatılmış Altın Antifade Reaktifi | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viskoz Sıvı | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| İnsan Fibroblastları | Coriell Hücre Hattı Biyodeposu | GM 4603 ve GM 1869 | Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Camden, NJ, ABD |
| Konfokal lazer tarama mikroskobu | Zeiss (Almanya) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zürih | 6.4.0 versiyonu | Filament Tracer ve Imaris XT modülleri gereklidir |
| Huygens Yazılımı | Huygens yazılımı, SVI, Hollanda | Pro sürümü | İsteğe bağlı (evrişim giderme testi için) |
Kaynaklar
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
