Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

12.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53197

⸱

10 Ekim 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

Bu makalede

Özet

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

Özet

Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 'de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.

Giriş

Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir.

Immünofloresan bağlanmış yeşil floresan protein (GFP) teknolojisi floresan mikroskop ile omurga tespiti ve şekil ölçümü için doğru bir aracı temsil eder. Bu yaklaşım kolayca kültür nöronları için uygulanabilir. However, veriler uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) elde edilen insan nöronlar üzerinde omurga olgunlaşması ve morfoloji analizi bildirilmiştir.

Bu çalışmanın amacı, in vitro kültürlenmiş insan nöronlardan dendritik omurga görüntüleme sağlayan bir protokol, tanımlamaktır. Imaris yazılımının Filament Tracer modülü ile GFP etiketleme, konfokal mikroskopi ve 3D analiz, mevcut protokolü kullanılmıştır. II nöral kök hücrelerden IV (NSC) için katmanları kortikal nöronlar glutamaterjik elde etmek için gerekli olan kültür adımlar da burada açıklanan kısaca. İnsan MGK üretimi için tüm protokol zaten başka bir yerde 4 yayımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Nöronal Kültür

Not: pluripotent kök hücreleri yeniden programlama Fibroblast geç kortikal atalarıdır dorsal telencephalon soy, türetme, büyütme ve bankacılık bağlılık (LCP) Boissart ark 4 tarif edildi. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşma, aynı zamanda hafif değişiklikler Boissart et al 4'e göre gerçekleştirilmiştir. Diğer prosedürler nöronlar içine farklılaşma ardından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine doğrudan fibroblastların yeniden programlama için geliştirilmiştir. O piramidal Glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verir, çünkü bu protokol muhafaza edildi.

  1. Poli-ornitin (DPBS 1/6 seyreltildi, stok konsantrasyonu% 0.01) DPBS içinde üç kez yıkanması izler O / N, cam lamelleri ile 6 oyuklu kültür plakaları tedavi edin. Daha sonra bir akış hunisi altına, en az 10 saat süre ile laminin (1 mg / ml, DPBS içinde 500 defa seyreltilmiş stok konsantrasyonu) ekleyin .
  2. Plaka ve düşük yoğunlukta NSC sevk N2 ekinin (50.000 hücre / cm2), cam DMEM / F12 oluşan kültür ortamının 3 ml lamelleri (500 mi), 2 şişeler 6 oyuklu kültür plakaları içinde (her biri 5 mi), B27 ekinin 2 şişeler (10 mL) ekstrakte edildi, Pen-Streptomisin (10 ml Penisilin = ml Streptomisin = 10.000 birim / ml 10.000 ünite /), 2-merkaptoetanol, 1 ml (stok çözeltisi: 50 mM) ve laminin (1 / 500), büyüme faktörleri olmadan. KRİTİK ADIM: Hücre kümeleme azaltmak için yavaş dönen hareketlerle hücreler ekleyerek dikkatle bu adımı uygulayın.
  3. Kültür ortamı çıkarın. Cam lameller üzerine eklenmiş nöron tutmak topaklaşmayı önlemek için taze laminin çözeltisi 2 ug / ml ihtiva eden taze ortam N2B27 ekleyin. Her 3 günde orta değiştirin. Kurutma hücre önlemek için taze ortam ilave edilmeden önce kalan ortamı (200 ul) bir kısmını muhafaza edin. Alternatif olarak, daha hızlı ilerler ve toplam hacmin (3 mi) değiştirin.
e_title "> 2. lentiviral İletimi

Not: GFP lentiviral vektörler nazik Institut Pasteur Uwe Maskos Laboratory (Paris) tarafından sağlanan ve yayınlanan bir protokolün 5'e göre hazırlandı. GFP ekspresyonu fare fosfogliserat kinaz (PGK) promoteri tarafından tahrik edilir. Bu çalışma için, bir viral titresi 400 ng / ul (PBS 1x stok çözelti) oldu.

  1. Kültür başına GFP lentiviral vektör de (6-yuvalı plakalar), 40 ng ihtiva eden stok çözeltisi 1 ul ekleyerek viral partiküllerin yolu ile olgunlaştırma herhangi bir aşamasında, insan iPSC türetilmiş nöronlar transdüksiyonu ve taze kültür ortamı içinde 48 saat süreyle inkübe edilir. Not: Bu protokol için inkübasyon süresi omurga yapılarının iyi bir etiketleme verir.

3. İmmünofloresan

Not: Bütün omurga morfolojisinin etiketleme geliştirmek için, immüno-floresan etiketlemesini permeabilize koşullarında bir anti-GFP antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde lamelleri transduse hücreleri kültür ortamı çıkarın ve gidermek ve ardından 1 x PBS içinde (10 dk) 3 kez yıkayın.
  2. PBS içinde Immerge mistery lamelleri% 0.05 Triton (100x) ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 10 at serumu ile desteklenmiş, daha sonra 1 x PBS içinde 3 kez yıkayın.
  3. 1x PBS 100 ul% 4 at serumu ve primer antikor (1/1000), GFP karşı ortaya her lamel 1000 kat seyreltildi ile takviye ekleyin. Bir karanlık kutu O inkübe / N 4 ° C'de, daha sonra 1 x 3 defa PBS ile yıkayın.
  4. PBS Tween 20% 0.5 ile takviye edilmiş olarak ve Alexa Fluor 488-konjuge antikor (1/200) seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Sonra 1x PBS içinde 3 kere yıkayın ve floresan mikroskobu için montaj orta ile cam slaytlar lamelleri monte edin.

4. Dendritik Omurga Görüntüleme

  1. Konfokal lazer tarama mikroskobu ile konfokal Görüntüleme gerçekleştirin.
  2. Piramidal morfoloji a ile sağlıklı nöronlar seçinnd tam dendritik arborization ve ayrı deneylerden elde edilen durumda en az 10 nöronlar ölçmek. Dendritin başına 100 mikron - 60 ölçmek.
  3. 20 uW etrafında örnek düzeyinde tipik bir zirve gücü ile NA objektif 1.3 = 40X yağ ve GFP uyarma için 488 nm lazer hattı kullanarak görüntüleri edinin. 80 nm çapında belirle piksel boyutu düzgün dendritik dikenler örnek.
    Not: Gürültü dendritler ve dikenler doğru segmentasyon taviz vermeyen hangi bir görüntü için daha sonra analiz çağrısı. Yukarıda belirtilen mekansal örnekleme ve güç ayarları ile, 3.15 ms'den piksel bekleme zamanı böyle bir görüntü oluşturmak için yeterli fotonları toplamak için yeterli olduğu görülmektedir. Loş numuneler için, görüntü kalitesi 2 ila 4 tarama ortalama geliştirilebilir. Birkaç XY çini satın alma daha sonra birlikte işlemeden önce dikişli gereken ilgi bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli olabilir.
  4. Ile, Z-yığını elde, tüm nöron hacmi örnekZ 20 30 Z dilimleri, sonuçta 150 nm ila 300 nm arasında değişen aralığı.
    Not: Bu ayarlarla elde yanal uzaysal çözünürlüğü 234 nm ve eksenel çözünürlük 591 nm. Burada seçilen örnekleme yeterli olduğunu, ancak eksenel çözünürlük yansıması için dikenler küçük boyutundan büyük olduğu için, analiz dendritler yana doğru uzanan dikenleri yanadır.

Dendritik Spine 5. 3D Niceleme

Not: Aşağıdaki bölümlerde özel analiz için Imaris yazılım kullanımını tarif eder. Alternatif uygulamalar benzer sonuçlar sağlayabilir NeuronStudio 15 veya Metamorph 8 de dahil olmak üzere, mevcuttur.

Aşağıdaki anahtar ayarları kullanın:

  1. Bir ön işleme aşaması olarak, yazılım tarafından sunulan görüntü işleme tesisleri ile Gauss filtreleme kullanmak. Görüntü İşleme> smoo yoluyla Gauss filtreleme gerçekleştirinşey> Gauss Filtre. XY piksel boyutuna eşit olması için filtre genişliğini ayarlayın.
  2. Yazılımın Filament Tracer modülü kullanılarak, dendritler bir yarı otomatik izleme yapın.
    1. İlk olarak, yazılım Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, dendrit çapını tahmin ediyoruz.
    2. Aşan sekmesinde, Filament aracı tıklayın. Daha iyi bir sağlamlık için bu protokol yarı otomatik izleme dayanır; Atla otomatik oluşturulması tıklayın. Modül arayüzü artık Çizim sekmesini gösteriyor. Burada, bir yöntem, bir tür olarak dendrit ve giriş tahmini dendrit çapı olarak autopath seçin.
    3. Bir kutunun içine imleç dönüm işaretçi Seç modunu kullanın. Dendrit başlangıç ​​noktasında Shift-sağ tıklayın. Not: Yazılımın ilk hesaplamalar gerçekleştirir.
    4. Dendritin boyunca hareket ettirin. Başlangıç ​​noktasından (temsilmavi küre olarak ed), büyük olasılıkla dendrit yolu temsil eden bir sarı çizgi gösterilir. Dendrit uç noktası üzerinde Shift-sol tıklayın.
  3. Otomatik dikenleri segmentasyon gerçekleştirin. Not: takip dendrit üzerindeki dikenler modül arabirimi tarafından otomatik olarak rastlanmaktadır.
    1. Modül arayüzünde, Yaratılış sekmesine tıklayın. Yeniden açılan listesinde, Dendrit Çap yeniden almak ve Tut veri kutusunu işaretleyin. Ardından yeniden tıklatın.
    2. Parçalara hacmi gerçek dendrit hacmine tekabül böylece Eşik ayarlayın. Bir Algoritma olarak. Mesafe Map Kısa Mesafe seçin İleri düğmesini tıklatın.
    3. En küçük omurga baş çapı ve maksimal uzunluğunu tespit, yine yazılımın Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, sonra tekrar Aşmak sekmesine gelip parametreleri girin. Fveya bu protokol, 200 civarında değerleri - minimal çapı 300 nm ve maksimal uzunluğu 4 mikron iyi bir başlangıç ​​noktalarıdır. İzin Şube Dikenler kutusunu kontrol etmeyin. İleri düğmesini tıklatın.
    4. Dikenler temsil mavi noktalar gerçek omurga kafaları lokalize böylece Tohum Noktaları Eşik ayarlayın. İleri düğmesini tıklatın. Not: Çekirdek hesaplaması şu anda yapılıyor ve uzun olabilir.
  4. Modül arayüzü Araçlar sekmesine giderek dikenleri sınıflandırır. Sınıflandırır Spine tıklayın. İstendiğinde kullanıcı arayüzü, aşağıdaki gibi kendi morfolojisi ile tanımlanan dört sınıfları vardır emin olun: Topaç: uzunluk <1 um; Mantar: Uzunluk (omurga)> 3 ve Max genişliği (baş)> genişliği (boyun) 2 x anlamına gelir; Uzun ince: Ortalama genişlik (kafa) ≥ ortalama genişliği (boyun); Filopodia gibi: Uzunluk ≤ 4 mikron (hiç kafa).
    Not: module arayüz sınıflandırma sonuçlarını içeren dört yeni Filament nesneleri oluşturur.
  5. İhracat Istatistiksel veriler: Bu dört nesne arayüzleri herhangi İstatistikler sekmesine gidin.
    Düğmesine Dosyaya Aktar Tüm İstatistikleri tıklayın.
    Not: Diğer istatistiksel değerler dendritler için ihraç edilebilir (.. Örneğin uzunluk, alan, vb çapı, şube derinliği, dallanma açısı, hacim, ortalama), ve dikenler (örneğin, doğruluk, bağlılık, uzunluk ve farklı hacminin alan omurga parçaları, omurga çapı, yoğunluğu vb.)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada IPSC türetilen piramidal nöronların kültür dendritlerin omurga ölçümü için standart bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, insan omurga nöronlar üzerinde olgunlaşma ve standart kemirgen nöronal kültürlerinde dikenler olgunlaşması ve in vivo hayvan modellerinde ile olası karşılaştırma analizine izin verir.

Şekil 1A kortikal piramidal nöronlar üretimine izin veren farklı kültür adımların bir düzeni temsil etmektedir. Böyle şematik temsili daha i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı.

Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşılaştırıldı. Yoğunlukları tüm vakalard...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Institut Pasteur, Bettencourt-Schueller vakfı, Centre National de la Recherche Scientifique, Paris Diderot Üniversitesi, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva Yardım Vakfı, Cognacq Jay Vakfı, Orange Vakfı ve Fondamental Vakfı. LG, Sağlık Bakanlığı'ndan bir lisans bursu ile desteklenmektedir. Bu çalışmanın ilk aşamasında BitPlane'in, özellikle de Georgia Golfis'in yardımına teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
D-PBS (1x), sans Kalsiyum, Magnezyum ve Fenol KırmızıGibco/ Yaşam Teknolojileri14190169
Poli-L-Ornitin Çözeltisi BiyoreaktifSigma AldrichP4957
Fare lamininDutscher Dominique354232
N2 TakviyesiGibco/ Life Technologies17502048
A Vitamini Olmadan B-27 Takviyesi (50 kat)Gibco / Yaşam Teknolojileri12587010
DMEM / NUT. KARIŞIM F-12 W/GLUT-IGibco/ Yaşam Teknolojileri31331028
Nörobazal Med SFMGibco/ Yaşam Teknolojileri21103049
2-merkaptoetanolGibco/ Yaşam Teknolojileri31350-010
Penisilin-SteptomisinGibco/ Yaşam Teknolojileri15140-122
GFP Tavşan Serumu Poliklonal AntikoruGibco/ Yaşam TeknolojileriA-6455
At serumuGibco/ Yaşam Teknolojileri16050130
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan Gibco/ Yaşam TeknolojileriA11034
Poliklonal Anti-betaIII tübülin AntikorKırlangıçAB9354
Kapak Camı 13 mmVWR631-0150
Gibco/ Life Technologiesile Uzatılmış Altın Antifade ReaktifiP36931
Tween(R) 20 Bioextra, Viskoz SıvıSigma Aldrich ChimieP7949
Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
İnsan FibroblastlarıCoriell Hücre Hattı BiyodeposuGM 4603 ve GM 1869Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Camden, NJ, ABD
Konfokal lazer tarama mikroskobuZeiss (Almanya)LSM 700
Imaris SoftwareBitplane AG, Zürih6.4.0 versiyonuFilament Tracer ve Imaris XT modülleri gereklidir
Huygens YazılımıHuygens yazılımı, SVI, HollandaPro sürümüİsteğe bağlı (evrişim giderme testi için)
DAPI

Kaynaklar

  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
  3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
  4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
  5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
  6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
  7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
  8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).
  9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
  10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
  11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
  13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dendritik Diken KantifikasyonuKonfokal Mikroskopi Görüntüleme3B Diken AnaliziNöral Kök Hücre DiferansiyasyonuGFP Lentivirüs TransdüksiyonuAnti-GFP Antikor BoyamasıDendritik Diken MorfolojisiGlutamaterjik Nöron KültürüDiken Yoğunluğu Ölçümü
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.