Method Article

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

DOI:

10.3791/53197

⸱

October 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, Institut Pasteur, 2CNRS URA 2182 'Genes, synapses and cognition', Institut Pasteur, 3Human Genetics and Cognitive Functions, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Plateforme d' Imagerie Dynamique, Imagopole, CiTech, Institut Pasteur, 5Neuroplasticity and Therapeutics, CECS, I-STEM, AFM, Evry

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 'de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nöronal Kültür

Not: pluripotent kök hücreleri yeniden programlama Fibroblast geç kortikal atalarıdır dorsal telencephalon soy, türetme, büyütme ve bankacılık bağlılık (LCP) Boissart ark 4 tarif edildi. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşma, aynı zamanda hafif değişiklikler Boissart et al 4'e göre gerçekleştirilmiştir. Diğer prosedürler nöronlar içine farklılaşma ardından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine doğrudan fibroblastların yeniden programlama için geliştirilmiştir. O piramidal Glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verir, çünkü bu protokol muhafaza edildi.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu çalışmada IPSC türetilen piramidal nöronların kültür dendritlerin omurga ölçümü için standart bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, insan omurga nöronlar üzerinde olgunlaşma ve standart kemirgen nöronal kültürlerinde dikenler olgunlaşması ve in vivo hayvan modellerinde ile olası karşılaştırma analizine izin verir.

    Şekil 1A kortikal piramidal nöronlar üretimine izin veren farklı kültür adımların bir düzeni temsil etmektedir. Böyle şematik temsili daha iyi dik.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı.

    Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşılaştırıldı. Yoğunlukları tüm vakalard.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu çalışma Institut Pasteur, Bettencourt-Schueller vakfı, Centre National de la Recherche Scientifique, Paris Diderot Üniversitesi, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), Conny-Maeva Yardım Vakfı, Cognacq Jay Vakfı, Orange Vakfı ve Fondamental Vakfı. LG, Sağlık Bakanlığı'ndan bir lisans bursu ile desteklenmektedir. Bu çalışmanın ilk aşamasında BitPlane'in, özellikle de Georgia Golfis'in yardımına teşekkür ederiz.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    D-PBS (1x), sans Kalsiyum, Magnezyum ve Fenol KırmızıGibco/ Yaşam Teknolojileri14190169
    Poli-L-Ornitin Çözeltisi BiyoreaktifSigma AldrichP4957
    Fare lamininDutscher Dominique354232
    N2 TakviyesiGibco/ Life Technologies17502048
    A Vitamini Olmadan B-27 Takviyesi (50 kat)Gibco / Yaşam Teknolojileri12587010
    DMEM / NUT. KARIŞIM F-12 W/GLUT-IGibco/ Yaşam Teknolojileri31331028
    Nörobazal Med SFMGibco/ Yaşam Teknolojileri21103049
    2-merkaptoetanolGibco/ Yaşam Teknolojileri31350-010
    Penisilin-SteptomisinGibco/ Yaşam Teknolojileri15140-122
    GFP Tavşan Serumu Poliklonal AntikoruGibco/ Yaşam TeknolojileriA-6455
    At serumuGibco/ Yaşam Teknolojileri16050130
    Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan Gibco/ Yaşam TeknolojileriA11034
    Poliklonal Anti-betaIII tübülin AntikorKırlangıçAB9354
    Kapak Camı 13 mmVWR631-0150
    Gibco/ Life Technologiesile Uzatılmış Altın Antifade ReaktifiP36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viskoz SıvıSigma Aldrich ChimieP7949
    Triton X-100Sigma Aldrich ChimieX100-100ML
    İnsan FibroblastlarıCoriell Hücre Hattı BiyodeposuGM 4603 ve GM 1869Coriell Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Camden, NJ, ABD
    Konfokal lazer tarama mikroskobuZeiss (Almanya)LSM 700
    Imaris SoftwareBitplane AG, Zürih6.4.0 versiyonuFilament Tracer ve Imaris XT modülleri gereklidir
    Huygens YazılımıHuygens yazılımı, SVI, HollandaPro sürümüİsteğe bağlı (evrişim giderme testi için)
    DAPI

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Dendritic Spine QuantificationHuman Induced Pluripotent Stem CellsConfocal Microscopy Imaging3D Spine AnalysisNeural Stem Cell DifferentiationGFP Lentivirus TransductionAnti GFP Antibody StainingDendritic Spine MorphologyGlutamatergic Neuron CultureSpine Density Measurement

    Related Articles