Yöntem makalesi

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

DOI:

10.3791/53205

⸱

8 Aralık 2015

 ,  , 
1Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücreden hücreye transferi, nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin ilerlemesinin altında yatıyor olabilir. Burada, rekombinant veya biyolojik numunelerden tohumlama aktivitesinin spesifik ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yeni bir FRET akış sitometrisi testi açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artan kanıtlar, Alzheimer hastalığı ve ilgili tauopatiler dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin başlatılması ve ilerlemesi için bir mekanizma olarak toksik protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücre içi yayılımını desteklemektedir. Tau tohumlarının hastalığın ilerlemesindeki potansiyel olarak kritik rolü, biyolojik örneklerde tohumlama aktivitesini kolayca tespit eden hassas bir tahlil ihtiyacını güçlü bir şekilde desteklemektedir.

Floresan rezonans enerji transferinin (FRET) özgüllüğünü, akış sitometrisinin duyarlılığını ve bir monoklonal hücre hattının stabilitesini birleştirerek, ultra hassas bir tohumlama testi tasarlanmıştır ve insan ve fare beyni homojenatları dahil olmak üzere rekombinant veya biyolojik örneklerden tohum tespiti ile uyumludur. Test, protein agregasyonu üzerine bir FRET sinyali üreten CFP veya YFP'ye kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonunu barındıran tau'nun agregasyona eğilimli tekrar alanını (RD) stabil bir şekilde ifade eden monoklonal HEK 293T hücrelerini kullanır. Proteopatik tau tohumlarının (ancak diğer proteinlerin değil) biyosensör hücrelerine alımı, RD-CFP ve RD-YFP'nin agregasyonunu uyarır ve akış sitometrisi, agregasyonun neden olduğu bu FRET'i hassas ve kantitatif olarak izler. Test, rekombinant tau tohumlarının femtomolar konsantrasyonlarını (monomer eşdeğeri) tespit eder, üç büyüklük sırasını kapsayan dinamik bir aralığa sahiptir ve tauopati transgenik farelerden ve insan tauopati deneklerinden elde edilen beyin homojenatları ile uyumludur. Küçük modifikasyonlarla, tahlil, α-sinüklein gibi diğer proteopatik tohumların tohumlama aktivitesini de tespit edebilir ve ayrıca birincil nöronal kültürlerle uyumludur. FRET akış sitometrisinin kolaylığı, hassasiyeti ve geniş uygulanabilirliği, çok çeşitli protein agregasyon bozukluklarının incelenmesini yararlı kılar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre içi tau amiloid birikimi, Alzheimer hastalığı gibi tauopatıler tanımlar. Hastalığın erken evrelerinde, patoloji genellikle beynin farklı bölgelerinde lokalize, ancak hastalığın ilerlemesi ile, patoloji kaçınılmaz farklı sinir ağları 1-5 boyunca yayılır. Biriken deliller toksik protein agrega transselüler yayılımı (6-10 gözden) Bu patoloji altında yatan göstermektedir. Bu modelde, proteopathic tohumları (örneğin, tau) verici hücrelerden salınan ve şablonu konformasyonal değişiklik 11-15 ile yanlış katlanmış formda doğal tau proteini dönüşürken, komşu hücreleri girin. Burada açıklanan tahlil hassas tür tohum aktivitesini tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu rekombinant proteinin ve biyolojik numuneler ile uyumlu ve proteopathic tohumlama aktivitesi 16 dakikalık seviyelerinin ölçümü sağlar.

Stabil tau tekrar d ifade HEK 293T hücreleriCFP ya YFP da kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonu içeren OMain (RD) tohumlama aktivitesi stabil biyosensör olarak hizmet (bundan sonra tau-RD-CFP / YFP hücreleri olarak da adlandırılır). Proteopathic tohum yokluğunda, hücreler, bir çözünür bir monomer olarak tau korumak ve kayda değer bir plan FRET sahiptir. Hücrelerin içine spontan alma ya da tau tohumların lipozom-aracılı iletim Bununla birlikte, akış sitometrisi ile, tek hücreler içinde ölçüldüğü bir FRET sinyali üretir RD-CFP ve RD-YFP agregasyonu ile sonuçlanır.

Bu testte çok sayıda bileşenleri duyarlılığını artırmak ve değişkenliği azaltmak için geliştirilmişti. Bir 1 monoklonal hücre çizgisi: en uygun sinyal sağlar olarak 1 RD-CFP / YFP sentezleme oranı seçildi: gürültü. Hassasiyetini artırmak için, fosfolipidler, doğrudan hücre içine tohum tanıtmak için kullanılan (uptake biyolojik mekanizmaları incelemek için, ancak bu ihmal edilebilir). Son olarak, nüfus düzeyi ve tek bir hücre de izler FRET akım sitometri seviye, diğer protein kümeleme deneyleri aksine. Nihai sonuç ölçüsü, entegre FRET yoğunluğu, yüksek kantitatif ve agregasyonu ile hücrelerin sayısında ve kümeleme her hücrede meydana geldi hangi derecede hem hesapları. Bu optimize tüm parametreler duyarlılığını artırmak ve tekrarlanabilirlik sağlamak.

Bu sistem son zamanlarda yaygın olarak kullanılan diğer tau patolojik belirteçleri temporal başlamasını ve tau tohumlama faaliyetleri göreli ilerlemesini (örneğin, MC1, AT8, PG5 ve ThioflavinS) değerlendirildi transgenik P301S tauopathy farelerde 17 kapsamlı bir çalışmada kullanılmıştır. Tohum etkinlik bugüne kadar en az 6 hafta histolojik algılama önceki değerlendirilen tau patolojisi en eski ve en güçlü işaret vardır. Tohum aktivite başlangıcı ve / veya nörodejenerasyonda 16 ilerlemesinde proteopathic tohumların nedensel rolünü düşündürmektedir 1.5 ay ve ilerleyen yaşla birlikte artar görünür.

e_content "> biyolojik örneklerden tohum malzemesi dakika seviyelerinin hassas kantitatif. Erken hastalığın ilerlemesini izlemek çalışmaları kolaylaştırabilir deneme süresinin kısaltılması ve genç hayvanların kullanılmasını sağlayarak, bu klinik öncesi hayvan deneylerinde verimliliği ve doğruluğunu artırabilir. Örneğin, P301S fare daha önce tarif edilen, kurşun bileşikleri erken 4-6 hafta kadar teslim edilebilir, ve 2-4 hafta sonra etki için izlenir. deney doğru tohumlama herhangi bir azalma ölçmek gerekir (ya da ekim aktivitesi başlangıcında hemen önce) faaliyet. sitometrisi in vitro tarama uygulamaları da. Örneğin, anti-tau reaktifler (örneğin, antikorlar, küçük moleküller, vs.) ya da rekombinant tau kullanılarak yapılmış, kültür doğrudan indüksiyon tohumlama bloke etme kapasitesi hızlı bir şekilde test edilebilir olan akış FRET bir tohum kaynağı (Şekil 5). Bu düzenleme ile, tohum malzemesi hazırlandıktan sonra, eski olarak agrega ya da beyin türevli lisatlarperiment veri analizi de dahil olmak üzere, tamamlamak için sadece üç gün sürer. Proteopathic tohumlama faaliyetinin hızla kantitatif böylece nörodejenerasyon birçok çalışma kolaylaştırabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol FRET kullanımı fare biyolojik örneklerden tohumlama aktivitesini tespit etmek için flow sitometri vurguluyor. Aynı zamanda, rekombinant fibriller ve insan biyolojik numuneler ile uyumludur. Fare ötanazi ve beyin hasat IACUC onaylı prosedürlere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Beyin Ekstraksiyon

  1. Izofluran (% 2), derin anesthetization sonra, buz soğukluğunda PBS% 0.03 heparin ihtiva eden bir fare serpmek ve Gage ve ark bilgi aşağıdaki beyin ekstrakte edin. 18
  2. Bir kriyo-şişe içinde ekstre doku yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurularak ek yerleştirilmesi. Alternatif olarak, kuru buz üzerinde doku dondurma. Bir kez gerekli ise, uzun bir süre için -80 ° C ve saklamak için doku transfer dondurulmuş.
    NOT: Bu protokol, tüm beyin homojenatlarının veya mikro kesilir beyin bölgelerinde ile uyumludur. Hagihara et al. Detaylı mikrodiseksiyon protokol 19.

Biyolojik Tohum Materyali 2. Hazırlık

  1. 1 x TBS (10 ml için 1 tablet) halinde proteaz inhibitörleri (serbest EDTA) içinde çözerek homojenizasyon tamponu hazırlayın. Buz üzerinde şiddetle Vortex, ve mağaza. Proteaz inhibitörleri biyosensör hücre canlılığını korumak için EDTA arındırılmalıdır.
  2. Tek kullanımlık tartmak tekne dondurulmuş beyin dokusu tartılır ve 5 ml konik tüp transfer. Nihai çözelti,% 10 ağırlık / hacim olduğu şekilde buz soğukluğunda homojenizasyon tamponu ekleyin. Geçici buz üzerinde saklayın. Doku kitlesi ve daha sonra homojenizasyon tampon maddesi hacmi kullanılan beyin boyut ve / veya bölgeye bağlı olarak değişecektir. Burada, 0,2 g ağırlığındaki bir yetişkin farenin hemibrain% 10 ağırlık / hacim solüsyonu 2 ml içinde süspanse edilir.
  3. Transferi soğuk odaya örnekler ve uygun ayarları bir prob sonikatör ayarlayın. (Burada gösterilen) bir Omni Ruptor ile prob sonication için numuneler ov değil emin olmak için yaklaşık 75 W. kullanın darbe modu karşılık% 20, gücü ayarlayınsonication sırasında er-ısıtmalı. Yaklaşık 500 ms tekabül eden,% 30 Pulser ayarlayın.
  4. Yine, su, izopropanol ve su ile durulanır, her çözeltisi arasında probu silinmesi ile prob sonikatör ucu temizleyin. Durulama ve taraf ve laboratuar mendil ile prob alt hem de silmek için emin olun.
  5. Bir seferde bir numune ile çalışma, homojenizasyon tamponu içine prob ucu daldırın ve sonikatör başlatın. Yukarıda açıklanan güç ve üreteci ayarlarını kullanma, 25 toplam bakliyat teslim. Doku süspansiyon tamamen olduğundan emin olun. Bu adımı sırasında numunenin köpüklenmesini önlemek için dikkatli olun.
    NOT: a) toplam hacim düşük olduğu veya b) Homojenat ısıtır eğer numuneler köpüklenme duyarlıdır. Bu özel cihaz sayesinde, 250 ul daha az hacimli ses dalgalarına maruz yoktur. Numuneler, soğutulmuş durmalarını sağlamak için, borular bu aşama esnasında buz üzerinde depolanabilir.
  6. Artık lizat uzakta silerek temizleyin prob, daha sonra bir bardak o içine 10 bakliyat teslimf temiz su. Her bir adım arasında silinerek kurutulmuş (adım 2.4 gibi) yan kenarlarına ve tekrar su, izopropanol ve su ile prob alt durulayın. Kontaminasyonu önlemek için, iyice örnekler arasında probu durulayın.
    NOT: tau agrega ile, daha sıkı temizleme yöntemleri örnek-örnek kirlenmesini önlemek için gerekli olduğunu bulamadı. Diğer amiloid Bununla birlikte, literatürde geniş 20,21 tarif edilmiştir, ek bakım gerektirir.
  7. Tüm numuneler işlendikten kadar mağaza buz üzerinde homojenatlarında.
  8. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 21.300 x g'de homojenatları dönerler.
  9. Pelet rahatsız etmemek için özen, temiz bir tüpe süpernatant aktarın. Pelet atın. Daha fazla kullanım için -80 ° C'de süpernatan ve mağaza lizatları alikotu. Bu tohumlama verimini azaltır, ancak homojenatlarının donma / çözülme döngüleri kaçının.

3. şarjı Biyosensör Hücreler

NOT:Bu deney için, dört hücre çizgileri kullanın: HEK 293T (hücre çizgisi # 1), RD-P301S-CFP (hücre çizgisi # 2), RD-P301S-YFP (3 hücre çizgisi #) ve RD-P301S-CFP / YFP ( hücre çizgisi # 4). Tahlile her hücre hattının katkılarından dolayı Tablo 1 başvurun.

  1. Steril bir ortamda, aspirat kültür ortamı. Sıcak PBS ve aspirat ile hücreleri durulayın. Hücreleri tripsinize edin 3 dakika boyunca (tripsin-EDTA (% 0.05), 3 ml), sıcak bir kültür ortamında (DMEM 9 ml,% 10 FBS,% 1 pen / strep,% 1 glutamax) ile söndürün ve hemen hücreleri aktarmak konik tüp.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüje hücreleri. Orta aspire ve sıcak kültür ortamında tekrar süspansiyon hücre pelet.
  3. Hemasitometre kullanılarak, her hücre hattı için hücre yoğunluğu belirlemek. Hücre yoğunluğu, toplama ve yeniden süspansiye etme hacminin zamanda konfluansa bağlı olarak değişecektir. Hücre yoğunluğu, 10 mi ortam içinde% 90 konfluent bir 10 cm'lik bir tabak hasat hücreleri tekrar yaklaşık 1.000.000 hücre / ml olarak.
  4. Makehücrelerin bir ana karışımı + ortam bir 96 çukurlu bir levhanın her bir oyuğa 130 ul ortam içinde 35,000 hücre içerecek (100 kuyu için bir ana karışımı yapmak için, örneğin, 13 mi ortam içinde 3.500.000 hücreleri tekrar süspansiyon). Bireysel deneysel tasarımlar ve zaman çizelgeleri sığdırmak için hücre numarasını değiştirin. Hücre tedavisi için ~ sonra kaplama 18 saat, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 35.000 hücre ekleyin.
  5. Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaş yavaş düz taban kısmının her bir kuyunun içine ana karışım hücre süspansiyonu 130 ul pipet doku 96 plaka kültür işlemden geçirildi. Kaplama birlikte, plakanın alt temas etmeyen, kuyunun merkezinde pipet ucu yerleştirin.
    Not: kaplama biçimi değiştirilebilir olmasına rağmen, hücre çizgileri plaka başına 1-3 her biri için n = 4 kuyu yapımında tavsiye edilir. Plaka (n = 84), geri kalan hücre çizgisi # 4 (biyosensör hücreleri) için ayrılmıştır.
  6. Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden plaka bırakarak oturmasına izin verin. 37 ° C'de,% 5 CO2 ve ve O / N inkübe# 8805;% 80 bağıl nem.

4. tedavi edilmesi Hücreler

NOT: ertesi gün, tau biyosensör hücreleri aşağıdaki gibi tohum iletim kompleksleri hazırlamak,% 60-65 konfluent:

  1. Bir tüp içinde, bir ana karışımı yapmak için, örneğin Opti-MEM olarak indirgenmiş serum ortamı ile, örneğin Lipofectamine gibi transfeksiyon reaktifi birleştirir. Başına iyi 1.25 ul transfeksiyon reaktif ve 8.75 ul indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Flick tüpü hafifçe kısaca karıştırın aşağı doğru döndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe.
  2. Başka bir tüp içinde, indirgenmiş serum medya ile tohum malzemesi (adım 2.9 den lizatın kısım) birleştirir.
    Not: Çekirdek malzemenin hacmi, bireysel deneye bağlı olarak değişir. Tohum hacmi seçerken, dikkate almak: bir numune ve potansiyel toksisite tohum bolluğu. Ham homojenatları hücrelerine toksik olabilir. Bunun gibi, istediğiniz etkiyi izlemek için mümkün olan en düşük hacim kullanın. Lizat / kuyu aralık fr Önceden test hacimleri5-20 ug toplam proteine ​​karşılık gelen om 1-5 ul. Gözenek başına toplam hacim (tohum + indirgenmiş serum ortamı) 10 ul olduğundan emin olun.
  3. En az 20 dakika süreyle ve 2 saat kadar oda sıcaklığında kısaca hafifçe karıştırın 4.1 ve 4.2, fiske açıklanan iki tüp içeriğini birleştirin (1000 xg, 5 sn) aşağı spin ve kuluçkaya yatmaktadır.
  4. Yavaşça bireysel biyosensör kuyularının yanında transdüksiyon kompleksinin 20 ul pipetle. Üç teknik çoğaltır, mümkünse kullanın. 24-48 saat boyunca inkübatör tedavi hücreleri dönün. Aşama 3.6 de tarif edildiği gibi aynı şartlar altında inkübe edilir.
    Not: fosfolipidlerin uygulanmasının lipozom reaktifi maruz kalmayan hücrelerin Biosensor için floresan profili nispeten hafif bir kayma getirmektedir, çünkü bu yerleşim için uygun negatif kontrol koşulu boş lipozomlar (örneğin, lipozom reaktifi + indirgenmiş serum ortamı) ile muamele biyosensör hücreleridir.

FRET Akım Sitometrisi 5. Hasat Hücreleri

NOT: hücrelerini-genel hasat önce 24-48 saat tedavi sonrası-standart bir ters floresan mikroskop GFP filtresi kullanılarak tohumlama faaliyetinin ön okuma almak mümkündür. Tohum malzeme ile tedavi edilen hücreler yoğun noktasal ve retiküler hücre içi kapanımlar (- B Şekil 1A) gösterecektir oysa tohum malzemesi (yani, boş lipozomlar) olmadan tedavi hücreler, yaygın floresan gösterecektir.

  1. Bir çok kanallı pipet kullanarak, tüm hücre ortamı (150 ul) aspire. Tripsinize (50 ul), 5 dakika boyunca hücreler ve 150 ul soğuk kültür ortamı ile söndürün. Hücre kaldırma ve sonraki hücre kaybına neden olabilir, bu aşamada trypsinization öncesinde PBS durulama dahil etmeyin. Yolluk stratejileri yoluyla akım sitometri sırasında herhangi kirlenmesine ölü hücreleri ve enkaz dışlamak.
  2. Hemen 5 ml 1000 xg'de, transferi 96 gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın hücreleri, ve santrifüj söndürme işleminden sonraoda sıcaklığında n.
  3. Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, orta atmak ve.
  4. Yavaşça fakat iyice 50 ul% 2 paraformaldehid hücre pelletini ve 10 dakika inkübe edilir. Sabitleme daha temiz ve tutarlı sonuçlar sağlar rağmen Alternatif olarak, koşmak hücreler, canlı.
  5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüje hücreleri. Aspire hücre pelet rahatsız etmemek için özen, paraformaldehid atmak ve.
  6. Yavaşça, ama iyice, 200 ul tamponla sitometri soğutulmuş akışı hücre pelletini tekrar süspansiyon (HBSS,% 1 FBS, 1 mM EDTA) ve hücre topaklanma önlemek için en kısa sürede plaka çalıştırın.

6. FRET Akım Sitometri

Not: Lazer hattı ve filtre setleri (Tablo 2) ile uyumlu bir FRET donatılmıştır MACSQuant VYB, gibi bir akış sitometrisi kullanın. Bu bölümde her adım için, yazılımın 96 kuyu şablonu kullanarak ilgi kuyusunu tıklatın ve tıklatın"Play" örnek alımı ve akışını başlatmak için. 'Yeni analiz pencere' simgesini tıklayarak araziler ya da istatistik tabloları yapın. X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde eksen parametrelerini değiştirin. Hücre popülasyonlarının veya floresan sinyalleri kaydırmaya artırmak veya uygun filtreler ile ilgili gerilimleri azaltmak. Bu alet sayesinde, doğru tek hücreli izlenmesini sağlamak için <1,000 olay / sn çalıştırın.

  1. Hücre popülasyonu sol alt kadranda kadar bir Side Scatter-Alan Forward Scatter-Alan (FSC-A) iki değişkenli arsa vs (SSC-A) ve hücre hattı 1. çalışırken, SSC ve FSC voltajlarını ayarlamak emin olun. Çokgen aracını tıklatın ve hücre popülasyonu (Gate P1) tanımlar. Tüm yolluk parametreleri için bakınız Şekil 2.
  2. Bir FSC-H (yükseklik) FSC-A değişkenli arsa vs yapın ve arsa üzerinde "canlı" tıklayarak, ve P1 seçerek bu arsa Gate P1 uygulanır. Hücre hattı # 1çalışan, çokgen aracını tıklatın ve tek hücreleri (Gate P2) tanımlar.
  3. CFP, YFP ve FRET: 3 histogram araziler, ilgi filtrelerin her biri için biri yapmak. Araziler üzerinde "canlı" tıklayarak, ve P2 seçerek bu araziler tüm Kapısı P2 uygulayın. Hücre hattı 1. çalışırken, gerilimleri ayarlamak şekilde CFP, YFP medyan hücre popülasyonu ve histogramlar 405 nm lazer ile hücreleri uyarmak, CFP ve FRET ölçmek ve birlikte yakalama floresan için her 0 ile 1. olan FRET sırasıyla, 450/50 nm ve 525/50 nm filtre. YFP ölçmek için, bir 525/50 nm filtreli 488 nm lazer ve yakalama floresan ile hücreler heyecanlandırmak. Lazer ve filtre ayarları daha Tablo 2'de açıklanmıştır.
  4. FRET ve YFP kanal içine CFP yayılma için tazminat gerçekleştirin.
    NOT: Tazminat floresan dağıtma düzeltme işlemidir. Tek florokrom floresan emisyonu bir filtre desi içinde algılandığında floresan yayılma oluşurBaşka bir florokrom sinyali ölçmek için yapması- nın doğrudan. Uygun tazminat ile CFP yayılma floresans FRET ve YFP kanallarından çıkarılabilir.
    NOT: Tazminat hem floresan pozitif ve negatif hücrelerin varlığını gerektirir. Bu nedenle, CFP-pozitif hücreleri üzerindeki (hücre çizgisi # 2), çalışma öncesinde numuneye eklenmesi gerekir negatif hücreler (1 hücre çizgisi #) telafi etmek için.
    1. De hücre çizgisi # 2 süspansiyon 200 ul içine tek bir hücre hattı 1. süspansiyonu 30 ul başak telafi hemen önce.
    2. "Çalgı Settings" simgesine, daha sonra 'tazminat' sekmesini tıklayın ve tazminat tablosunu açmak için 'matris' kontrol edin.
    3. Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs FRET-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Hücre hatları 1 + 2 çalışırken, 'Quadrant' simgesini tıklayın ve floresan -negatif ve pozitif popülasyonlar düşük iki kadran ayrılır ki (Gates, LL3 a kadran çizmeknd LR3 sırasıyla).
    4. LL3 ve LR3 kapıları için FRET medyan floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. FRET sinyal MFI LL3 ve LR3 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde FRET parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, FRET sinyali MFI FRET kanalının içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir.
    5. Aşama 6.3 açıklandığı gibi, CFP-A değişkenli arsa vs YFP-A yapın ve kapı P2 uygulayın. Adım 6.4.3 yapılan benzer kadranlar (LL4 ve LR4) çizin.
    6. LL4 ve LR4 için YFP MFI görüntüleyen bir istatistik tablo oluşturun. YFP sinyal MFI LL4 ve LR4 arasında eşit olana kadar tazminat matris içinde YFP parametresini ayarlayın. Bu etaptan sonra, bir YFP sinyal MFI YFP kanal içine CFP yayılma yokluğunu gösteren, boyanmamış hücreler ve CFP-pozitif hücreleri arasında eşittir.
  5. FollKapı kurulum ve tazminat nedeniyle, faiz kuyu vurgulamak ve plaka kalanını çalıştırın.
  6. Tüm numuneler 'dosyası', ardından 'kopya' tıklayarak, ihracat verileri dosyaları çalıştırmak edildikten sonra. 'Veri dosyaları' sekmesini seçin deneme klasörünü vurgulayın ve 'kopya' tıklayın.

7. Veri analizi

NOT: X veya Y ekseni ya da üzerinde başlığını tıklayarak ve uygun filtreyi seçerek bireysel değişkenli araziler üzerinde değiştirme eksen parametreleri.

  1. Analiz programı flow sitometri Open FCS dosyaları.
  2. Dağıtma özelliklerine göre, benzer şekilde, Bölüm 6'da tarif edilene boş lipozomlar ile muamele edilen hücrelerden alınan (FSC-A v FSC H) hücre popülasyonu (FSC vs SSC) ve tekli popülasyonu tanımlamak için çok köşeli bir kapı kullanın.
  3. OBP kompanzasyon kurulumu sırasında yapıldı, daha fazla CFP ayarlamak yok.
  4. YFP değişkenli arsa vs FRET oluşturun. Hücre hattı 3. Kullanılması, FRET-pozitif hücre popülasyonu yamaç boyunca uzanan bir çokgen kapısı çizerek yanlış FRET kapısı tanımlayın. Bu kapı, FRET filtre içinde bir sinyal yayar YFP tek pozitif hücreler hariç, daha önce ve arkadaşları yasaklayarak gösterilene benzer çekilmektedir. 22
  5. OBP değişkenli arsa vs FRET boş lipozom-tedavi OBP / YFP hücrelerini çizerek bir FRET kapısı tanımlayın. Yukarı doğru uzanan ve uzak nüfus sola nüfusun yamaç boyunca bir çokgen kapısı tanıtın. Bu kapı arka plan hücrelerinin ≥1% olduğu FRET gibi çoğu hücreleri (~% 99), dışarıda olmalıdır. Bu kapının vitese herhangi bir olay FRET-pozitif kabul edilir.
    Not: Yukarıdaki tarif Her bir kapak daha sonra kapıları oluşturmak önce tüm örneklere uygulanır. Analizi takiben, dört ayrı kapıları tanımlanır (Hücre popülasyonu, tekli; yanlış FRET, FRET).
  6. Yüzde FRET pozitifliği ve MFI: dahil olmak üzere ilgi Tutanak analiz parametreleri,FRET-pozitif hücre. El ile yüzde pozitifliği ve MFI ürünü ölçerek entegre FRET yoğunluğunu hesaplamak.
    Not: entegre FRET yoğunluğu sonuç ölçüsü, iki bireysel faktörler daha az olan bir ürün hesaplama önlemek için 1 'den büyük ya da eşit ve MFI (adım 7.5' de tanımlandığı gibi) ayarlanmış arka FRET olarak kullanılırsa.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET akım sitometri duyarlı, nicel ve rekombinant veya biyolojik örneklerden tohumlama faaliyetinin hızlı algılama sağlar. Deney ayarları yüzeysel olduğu: Tau-RD-CFP / YFP ifade monoklonal türetilen stabil hücre hatları 24-48 saat için kuluçkalanmıştır, tohum malzemesi ile transduse ve analizi (Şekil 1A) akış sitometrisi tabi tutulur. Tohumların yokluğunda, biyosensör hücreleri çözünür, monomerik formda (Şekil 1B) tau korumak. Tohumların varlığında ise, biyosensör hücreleri akış sitomet...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan FRET akım sitometri sistemi hızlı ve kantitatif tau tohumlama aktivitesini değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Sadece orta hücre kültürü deneyim ve FRET çalışan bir bilgi ve akım sitometri gerektirir. Beta bilanço yapısı bağlandığı zaman floresan gelişmiş sergileyen - - örneğin Thioflavin T gibi diğer ekim deneyleri, zahmetli ve saf, rekombinant protein alt tabakayı gerektirir. Ayrıca, tau için in vitro tohumlama deneyleri sadece semi-kantitatif ve tohum malzemesi 23,24 arasında s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tahlil Janssen Pharmaceuticals'a lisanslanmıştır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Tau Konsorsiyumu (M.I.D) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibesi 1R01NS071835 (MID), Savunma Bakanlığı Hibe PT110816 (MID'ye), 1F32NS087805 (JLF'ye) ve 1F31NS079039 (BBH'ye).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
TBSSigmaT5912
cOmplete Proteaz İnhibitörleri (EDTA içermez)Roche4693159001
Kriyo-şişelerSarstedt72.694.006
Analitik TeraziMettler ToledoXSE 105DU
Tartı TekneleriFisher Scientific13-735-743
15 ml konik tüpABD Scientific1475-0501
Omni Sonic Ruptor Ultrasonik HomojenizatörOmni International18-000-115
Ultrasonik Homojenizatör Omni International için Mikro UçOR-T-156
2-PropanolFisher ScientificA451
Gürültü Önleyici KulaklıkFisher Scientific19-145-412
KimwipesFisher ScientificS47299
1.5 ml tüplerUSA Scientific1615-5510
mikrosantrifüj Eppendorf5424 000.215
DPBSYaşam Teknolojileri14190-136
DMEMYaşam Teknolojileri11965-084
Fetal Sığır SerumuHyCloneSH30071.03
Penisilin-StreptomisinYaşam Teknolojileri15140-122
GlutaMaxYaşam Teknolojileri35050-061
Tripsin-EDTAYaşam Teknolojileri25300-054
50 ml Konik TüplerPhoenix ResearchSS-PH15
25 ml reaktif resevoirsVWR41428-954
Çok kanallı pipetFisher ScientificTI13-690-049
96 kuyulu düz tabanlı plakalarCorning3603
Opti-MEMYaşam Teknolojileri31985-070
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
96 kuyulu yuvarlak alt plakalarCorning3788
%16 ParaformaldehitElektron Mikroskobu BilimleriRT 15710
PBSSigma-AldrichP5493
EDTASigma-AldrichED2SS
HBSSYaşam Teknolojileri14185-052
Sorvall ST 40 SantrifüjThermo Scientific75004509
BIOLiner Sallanan Kova RotoruThermo Scientific75003796
HemasitometreVWR15170-172
MACSQuant VYB Akış SitomörüMiltenyi Biotec130-096-116
Chill 96 RafMiltenyi Biotec130-094-459
Flow Jo analiz yazılımıFlow Jo
20 μ l pipet uçlarıRaininGPS-L10
200 & l pipet uçlarıRaininGPS-250
1 ml pipet uçlarıRaininGPS-1000
200 & l pipet uçlarıUSA Scientific1111-1800
5 ml serolojik pipetPhoenix ResearchSPG-606180
10 ml serolojik pipetPhoenix ResearchSPG-607180
25 ml Serolojik pipetPhoenix ResearchSPG-760180

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
  2. Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
  3. Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
  6. Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
  7. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
  8. Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
  9. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  10. Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
  11. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  12. Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
  13. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
  14. de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  15. Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302(2012).
  16. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.
  17. Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
  19. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
  20. Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
  21. McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
  22. Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344(2010).
  23. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Biochemistry. , (2013).
  24. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FRET Flow CytometryProteopathic SeedingTau AggregationBiosensor CellsFlow Cytometry AnalysisFluorescence CompensationSeeding Activity DetectionRecombinant Tau SeedsBrain HomogenatesHEK 293T Cells

İlgili makaleler