Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Merkezi sinir sistemi (MSS) Uygun işlevi son derece düzenlenir dışı ortam gerektirir ve metabolik talepler diğer organlara ¹ ile karşılaştırıldığında çok büyük. CNS ayrıca genel olarak periferal organlara zararsız fakat buna, nörotoksik kimyasal geniş bir yelpazede, son derece duyarlıdır. Doğru çalışmasını sağlamak için, MSS 'damar çoğu endotel bariyer oluşturur; Moleküllerin ve iyonların akışını yanı sıra kan ve beyin arasındaki bağışıklık hücrelerinin geçişini kontrol eden kan-beyin bariyeri (KBB), böylece engellemekle tedavileri, böylece doğru homeostasisi ² koruyarak, aynı zamanda tedavi edici ilaçların girişini sınırlayan nörolojik bozukluklar ^3. Hücresel düzeyde, BBB ağırlıklı endotel hücreleri, akış taşıyıcıların polarize ifade ve çok düşük transsitoz oranı ⁴ arasında kapsamlı sıkı kavşaklar tarafından sürdürülür. Özellikleri ve BBB fonksiyonları çoğunlukla KD tarafından uyarılmaktadırighboring hücreler ^4. Özellikle, perisitler BBB ^5,6 uyarma ve muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Büyük damarları çevreleyen düz kas hücreleri gibi kasılma hücreleri olmak, perisitler da kan akışını ⁷ düzenler. Son olarak, astrositler, beynin başlıca glial hücreler, endfeet etrafında adlı büyük süreçlerini göndermek beynin damarsal ⁸ en BBB bütünlüğü ve bağışıklık sessizliğini ^9, nöronlar ¹⁰ metabolitlerinin transferini modüle ve nöronal aktivitenin arasındaki sıkı bağlantı neden ve kan akışı ^11,12.

Serebrovasküler sistemin moleküler ve hücresel özelliklerini incelemek için yeteneği beyin fizyolojisi ve fizyopatolojisi olan katkısını daha iyi karakterize etmek çok önemlidir. Bu soruyu çözmek için, beynin serebrovasküler sistemini izole etmek için stratejiler bozulmamış beyin damar parçalarının hazırlanması için izin veren, geliştirilmiştir. Serebral damar purification başlangıçta özellikle kemirgenler ^14, diğer türlere sığır beyinleri ¹³ kullanılarak tarif ve geliştirilmiş ve uyarlanmıştır. Bu son çalışmada, değişen büyüklükte filtrelerin kullanılması farklı çaplarda damar zenginleştirilmiş kesirler beyin damarları ayırmak için kullanılmaya başlandı. İlginçtir ki, bu terkiplerde, endotelyal hücreler metabolik özellikleri ^15, taşıyıcı işlevi ¹⁶ ve polarizasyon ¹⁷ tutulur. Burada, ayrıntılı olarak protokol açıklar ve ayrıca izole damarlar in situ yapılarda geçen ay, en çok muhafaza ettiğini göstermektedir. Endotel hücreleri sıkı kavşaklar ile bağlantılı ve sürekli bazal lamina ile çevrilidir kalır. Perisitler ve yumuşak kas hücrelerinin endotel tabaka, hem de perivasküler astrosit membranlara bağlı kalır. Ancak, astrositler, mikroglial hücreler, nöronlar ve oligodendrosit ortadan kalkar. Son olarak, biz izole beyin damarları üzerinde immün gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Şimdiye kadar serebrovasküler sistemine ilişkin moleküler ve hücresel çalışmalar çoğu tarafından ayrışmış saflaştınldı, beyin damarı hücrelerinde üzerinde gerçekleştirilmiştir hücre sıralama hücre spesifik raportör fare soyu veya immüno-bazlı prosedürler ^18,19 kullanılmıştır. Bu teknikler neredeyse saf serebrovasküler hücre popülasyonlarının izolasyonu için izin verse, izole hücreler tamamen sırayla, büyük ölçüde moleküler ve hücresel özelliklerini etkiler onların yerinde morfolojisi ve etkileşimleri, kaybedersiniz. Protokol, spesifik antikorlar veya transjenik fare lekeleri gerek kalmadan, tüm serebrovasküler fragmanlarının izolasyonu sağlayan, burada açıklanan, moleküler özellikleri üzerinde yansımaları azaltılması ve böylece, muhafaza edilir izole serebral damar genel yapı olarak iyi bir alternatif sunmaktadır. Son zamanlarda tarif edildiği gibi izole edilmiş ^20,21 damarları daha sonra BBB gen aktivitesi, protein sentezi ve düzenleme incelemek için kullanılabilecek 22,23 oranla mevcut protokol, ucuz gerçekleştirmek kolay ve herhangi bir laboratuvara hızla uyarlanabilir.

1. Çözüm ve Malzeme

1. Izolasyon kabı çözümleri hazırlayın: B1, HBSS 150 ml HEPES 1 M, 1.5 ml ekleyin; B2, 20 B1 ml dekstran 3,6 g ekleyin; B3, B1, 100 ml BSA 1 g ekleyin.
2. Üst vidalama kısmı kapalı altını keserek filtre yuvasını değiştirin.
3. Immüno-çözümleri hazırlayın: sabitleme çözeltisi, PBS pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit; Permeabilization / bloke etme çözeltisi,% 5 keçi serumu sulandırarak PBS pH 7.4 içinde% 0.25 Triton X100 ile.
   Not: Sabitleme kullanılan birincil antikor tipine bağlıdır.

2. Diseksiyon

Not: gemiler hücre kültürü amacıyla kullanılır sürece Steril koşullar gerekli değildir.

1. B1, 20 ml bir 150 ml'lik beher hazırlayın. Buz üzerinde tutun ve hava kirliliğini önlemek için parafilm ile kaplayın.
2. Derinden int eklenir saf İsofluranın 1 ml batırılmış küçük bir kağıt havlu ile bir başlık altında fare uyutmakKafesi o. Anestezi bir ayak tutam tepki eksikliği tarafından doğrulanmadı. Servikal dislokasyon ile fareyi öldürmek.
   Not: Bu adımlar, ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilir.
3. İsteğe bağlı: Kan içeriği ²⁴ ortadan kaldırmak için, PBS 1x 20 ml intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
4. Bölüm burun boyun bir neşter ile cilt ve uzak çekin. PBS 1x tüm kirletici tüyleri temizleyin.
5. Kafatası açmak için, öncelikle koku ampul öne makas yerleştirin ve iki bölümden kafatası yırtılması için makas açın.
6. Dikkatle beyin spatula ile beyin kaldırmak. Onlar kan damarı hazırlık ³⁸ kontamine gibi lateral ventriküllerin koroid pleksus parçalara ayır.
   NOT: İsteğe bağlı: son hazırlık parankimal ve meninks damarları içerecektir. İstenen değilse, beyin zarları ³⁸ tarafından tarif edilen prosedür takip soyulabilir olabilir.
7. TrBuz üzerinde B1 çözeltisi içeren beher içine beyin ansfer. 8 adede kadar beyinleri bir araya tedavi edilebilir.

3. Beyin Dokusu Homojenizasyon

1. İki neşter kullanarak elle ve şiddetle ardından yaklaşık 2 mm küçük parçalar elde B1 çözeltisi içinde beyin yendi.
2. 400 rpm'de 20 vuruş gerçekleştiren, bir otomatize Dounce homojenleştirici ile hazırlık homojenize. Cam tüp buz ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, yukarı ve aşağı hareket olduğunda douncer üst kısmı çözelti içinde olduğu muhafaza emin olun. Birkaç örnekler hazırlanır, her homojenizasyon ile iyonize su ile douncer yıkayın.

4. Gemi saflaştırma

1. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2000 g'da santrifüj bir 50 ml plastik tüp içine Homojenat aktarın ve devam edin. Hiçbir perfüzyon yapıldı eğer bir büyük beyaz bir arayüz (çoğunlukla miyelin) damar pellet (kırmızı üstünde oluşturacak).
2. Süpernatantı atın. Damar pelet ve beyaz arayüz birlikte takılı kalacaktır. Buz soğukluğunda B2 çözeltisi 20 ml ilave edilir ve 1 dakika boyunca elle ve kuvvetlice tüp sallayın.
3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4400 g'de ikinci bir santrifüj işleminden geçin. Miyelin artık süpernatan yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacak.
4. Dikkatle tüpü tutarak ve yavaşça süpernatant duvarları boyunca geçmesine izin çevirerek tüp duvarlarından miyelin tabakası ayırın. Süpernatant ile miyelini atın. Damarları ihtiva eden topak tüpün altındaki bağlı kalır.
5. 5 ml'lik plastik pipet etrafına sarılmış bir emici kağıt ile tüpün iç duvarını kurulayın ve kalan tüm sıvılar kaldırmak, damar pelet dokunmaktan kaçının. Kalan sıvıyı boşaltmak için emici kağıt üzerinde tüp ters tutun.
6. Düşük bağlayıcı uçları, hesabı ve hesap ile pipetleme aşağı buz soğukluğunda B3 çözeltisi 1 ml pelet Askıdabuz tüpü ng sonra B3 çözeltisi başka bir 5 ml ekleyin. Gemiler mümkün olduğu kadar disperse edilir ve agregatları oluşturmaz emin olun.

5. Filtrasyon

1. Buz soğukluğunda B3 çözeltisi 30 ml buz üzerinde bir beher hazırlayın. Hava kirlenmesini önlemek için parafilm ile kaplayın.
2. Bir Becker şişenin üstüne bir tadil edilmiş filtre tutucusu üzerinde 20 mikron gözenekli bir filtre yerleştirin ve buz soğukluğunda B3 çözeltisi 10 ml uygulayarak denge.
3. Filtre üzerinde damar hazırlanmasını dökün ve buz soğukluğunda B3 çözeltisi 40 ml damarları yıkayın.
4. Temiz forseps kullanarak filtreyi kurtarma ve hemen B3 solüsyon içeren beher içinde bırakın. Hafifçe sallayarak filtreden gemileri ayırın.
5. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 2000 g'de 50 ml plastik tüp ve santrifüj kabı içeriği dökün.
6. Not: Alternatif olarak, aşama 4,6 beyin gemilerinin süspansiyon 100 mikron mesh filtre üzerine filtre edilebilir.Akış daha sonra, yukarıdaki gibi bir 20 um-gözenekli filtre üzerinde filtre edilmektedir mikrodamarlar (özellikle kılcal damarlar), içerir ise, bu durumda, daha büyük bir gemi, tercihen filtre üzerinde tutulur.
7. Buz soğukluğunda B3 çözeltisi 1 ml mikrodamarlar pelet yeniden süspanse edin ve 1.5 ml Eppendorf tüp içine pipetleme aktarın. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 2000 g'de santrifüjleyin.

6. Sabitleme, Permeabilization ve Engelleme

1. 1.0 ml düşük bağlanma ucunu kullanarak PBS içeren 0.2 ml PCR tüpleri içine pipetleme Transferi gemiler. Onlar ucu dış kısmına bağlı olabilir damarları dokunmadan dikkatli olun. Binoküler mikroskop altında aşağıdaki adımları uygulayın.
2. Aşağıdaki orta değişikliklerin her biri için, gemiler dibe ulaşana kadar buz üzerinde tüpler bırakın ve uzun ve bir şey jel yükleme pipet ipuçlarını kullanarak sıvıların çoğu pipetle.
3. PBS en çıkarın ve tespit edici çözeltisi 200 ul ilave edin.Sallanarak damarları askıya alma ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
4. Sabitleştirici çözüm pipet ve 1x PBS (ilk yıkama) 200 ul ile değiştirin, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ve bu adımı 3 kez tekrarlayın. Her zaman, gemiler doğru gemiler dokunulmaz değil sağlanması, 1x PBS üzerinden boru ve pipet dibine battı doğrulayın.
5. Son yıkamadan sonra, zaman zaman hafifçe sallayarak damarları resuspending, permeabilizasyon / bloke çözümü ile 1x PBS yerine ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.

7. immün

1. Permeabilizasyon / engelleme çözümü seyreltilmiş primer antikorlar (Malzeme şablon tablo burada ve seyreltiler kullanılan antikorların referanslara bakın) karışımı ile permeabilization / engelleme çözümü değiştirin ve 4 ° CO / N inkübe.
2. Oda sıcaklığında PBS içinde 3 yıkamadan sonra, 2 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor karışımı ile gemiler inkübeoda sıcaklığında karıştırıldı.
3. Not: Mikroskop altında tüyleri veya tozları kontamine mümkün gelen gemiler ayırt etmek için: (2000 1) veya DAPI: biz şiddetle Hoechst (2000 1) nükleer boyama yapmanızı tavsiye ederiz.
4. PBS içinde 3 yıkamadan sonra, PBS'de 50 ul damarları tekrar süspansiyon.

8. Montaj ve Gözlem

1. Bir silikonlu cam kapiller ile bir ipucu hazırlayın: Bir neşter kullanılarak bir P200 pipet kesip içindeki kılcal ayarlayın. Kılcal yaklaşık hacmi 40 ul olduğunu.
2. Silikonize cam kılcal kullanarak bir bardak slayt damarları aktarın ve dikkatle emici bir kağıt parçası ile sıvı çıkarın.
3. Gemiler üzerine montaj orta tek bir damla uygulayın ve açılan kayma kenarında yaymak için izin 45º bir lamel tutun. Lamel kapalı gidelim ve orta yavaş yavaş yayılmaya izin verir. Kuru O / N oda sıcaklığında ışıktan korunarak olsun. Kaplar, bir fluoresc altında görülebilirent konfokal mikroskop.

Burada, biz. Beyin damarlarında 14 mekanik izolasyonu sağlayan bir protokol açıklar 1 Bu tekniğin temel adımları özetlemektedir Şekil. Beyin damarlarının mimarisidir karmaşıktır ve çeşitli hücre tipleri içerir yani, endotelyal hücreler sıkı bırleşme ile kapatılır, perisit, yumuşak kas hücreleri ve astrosit ayak işlemlerinin 9 ile çevrilidir. Bu nedenle, beyin damar izole edildikten sonra, bizim protokolü ikinci bölümünde tarif edildiği gibi imüno-boyama ile saflaştırılmış damarlarının yapısını karakterize etmek için amaçlanmıştır. Agrin, endotel bazal katmanın bir parçası sürekli ve homojen olarak endotel yüzeyi (Şekil 2A) olarak etiketlenmiştir. Zona occludens-1 (ZO-1), endotelyal sıkı kavşaklar bileşenlerinden biri endotelyal sıkı kavşaklar (Şekil 2B) korundu düşündüren, hiçbir belirgin devamsızlık ile boyanmış edildi. Perisit endotel kapsamı, etiketDaha önce 25 (Şekil 2C) için açıklanan yöntemle NG2 tarafından ifa, neredeyse sürekli ortaya çıktı. Son olarak, yumuşak kas aktin markalama büyük saflaştırılmış damarları (Şekil 2D) yüzeylerinde yoğun bir yumuşak kas hücresi tabakası varlığını ortaya çıkarmıştır. Bu sonuçlar, in situ, beyin damar yapısının genel izole damar parçaları muhafaza edildiğini göstermiştir.

Astrositler neredeyse tamamen serebrovasküler sistem 8 gömleklenmesi, damarlarının yüzeyi büyük işlemleri ya da 'endfeet' göndermek için gösterilmiştir. Gemiler ile onların sıkı etkileşim ve bakımını ve çeşitli serebrovasküler fonksiyonları düzenleyen rolleri, nörovasküler biriminin 9 önemli bir parçası olarak belirlenmiş. Biz daha izole beyin damarlarının astrosit damar kapsama analiz. Normal olarak tüm astrosit GFAP, bu ara madde astrositik filamanın immüno (Şekil 3A), wasadece kısmen mevcut endotel yüzeyinde (Şekil 3B-C) bazı kısa liflerin gösteren saflaştırılmış damarları s. Bunun aksine, Konneksin 43, yüksek perivasküler astroglial membranlar 26 zenginleştirilmiş bir boşluk bağlantı proteini, yüksek oranda saf büyük gemiler (Şekil 3D) ve kılcal (Şekil 3E) yüzeyinde tespit edilmiştir. Benzer şekilde, Aquaporin-4 (AQP4) bir immüno, su kanalı ailesinin bir üyesi olan büyük ölçüde izole edilmiş bir damarları (Şekil 3F-G) duvarlarını özetleyen damarları 27, 26 karşı karşıya astrosit membran seviye açığa çıkar. Astrocytes gemileri ile birlikte saflaştırılmış değildi rağmen, perivasküler endfeet membranlar, beyin damar izolasyonu mekanik işlem sırasında takılı kaldı.

Son olarak, diğer nöral hücre tipleri tarafından eden preparasyonlar bulaşma olasılığını incelenmiştir. Nöronal ara fılamanların immüno (NFM) (Hornun, 1999) g ve arkadaşları, birkaç nöronal terminallerin muhtemel bir ko-saflaştırma (Şekil 4A-B) gösteren kaplara bağlanmış az kalan liflerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Olig2 (Şekil 4E-F) ile etiketlenmiş Iba1 (Şekil 4C-D) ve oligodendrosit, etiketli Mikroglia, izole damarlarda tespit edilmemiştir. Böylece nöronlar, mikroglia ve oligodendrositler beyin damarlarında ile birlikte saflaştırılmış değildi.

Birlikte, bu sonuçları açıklanan protokol perivasküler astrositik membranlar bağlı kalır bunun üzerine yapısal korunmuş beyin damar parçaları, saflaştırılması izin verdiğini göstermektedir.

Beyin Damar Arıtma Protokolün Şekil 1. Özet Şeması. Başlıca adımlar sunulmaktadır. Bu kroki fi bağlı elde edilebilir üç olası damar kesirler gösterir kullanılan ltreleri (20 ya da 100 mikron gözenekli). S1: mikrodamarlar ve büyük gemiler, S2: Büyük gemiler ve S3:. Mikrodamarlar bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. İzole Gemiler Yerinde yapısındaki çoğu saklayın. Immunosteyn izole fare beyin damarlarının Konfokal görüntü projeksiyonları. (A) Agrin (kırmızı) için imüno Bazal lamina. (B) Endotel hücre sıkı kavşaklar zonula occludens (ZO-1 için imüno ) (kırmızı). (C) perisitler NG2 (kırmızı). (D) düz kas aktin (SMA) için imüno düz kas hücreleri (kırmızı) için imüno. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı.pg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. Astrosit Endfeet Membranes Saf Damarlar bağlı kalır. Konfokal görüntü projeksiyonlar. (A) endotel PECAM (beyaz) için immunohistokimyasal bir kortikal gemi gösteren bir beyin bölümünde, astrositik GFAP (kırmızı) ve Konneksin 43 (Cx43) (yeşil görüntü ). Isolectin b4 (beyaz etiketli izole bir kılcal yüzeyinde (B, C) ​​GFAP immüno (yeşil)) (B) veya düz kas aktini (SMA) (kırmızı) (C) işaretli büyük geminin. (C) Isolectin b4 (beyaz) (D) ile işaretlenmiş izole bir kılcal yüzeyinde 20 (D, E) Cx43 immüno (yeşil) izni ile bir Re-print olduğunu ya da düz kas aktini (SMA) için etiketlenmiş büyük geminin (kırmızı) (F, G) Isolectin b4 (beyaz) (F) etiketli izole bir kılcal yüzeyinde Aquaporin 4 (AQP4) immüno (yeşil) ya da düz kas aktin (SMA) için etiketlenmiş büyük geminin (kırmızı) (G). Çekirdekler Hoechst (mavi) ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:.. Nöronlar, Mikroglia ve Oligodentrositler Beyin Gemileri ile arıtılmış CO olan Konfokal görüntü projeksiyonları (A, B) nörofilaman (NFM) 20 mikron kalınlığında hipokampal dilim (kırmızı) (A) ve saflaştırılmış beyin damarlarında üzerinde immün ( B). (C, B), bir 20 um-kalınlıkta kortikal dilim Mikroglial Iba1 immün (red) (C) ve saflaştırılmış beyin damarlarında (D). (E, F), 20 mikron kalınlığında kortikal dilim (kırmızı üzerine Oligodendrosit olig2 immün) (E) ve saflaştırılmış beyin damarları (K). Çekirdekler Hoechst tarafından boyanır (beyaz ), Isolectine b4 (Ib4) (yeşil) ile endotel. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.