Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi İn Vivo: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli Candida albicans Ve Pseudomonas aeruginosa Airways

Hayvan modelleri, özellikle de fare, yoğun patojenlere karşı bağışıklık karşılıklarını keşfetmek için kullanılmıştır. Doğuştan ve edinsel bağışıklık kemirgenler ve insanlarda ⁷ arasında farklılık göstermekle birlikte, ıslah kolaylığı ve çok sayıda genler için tırnakları geliştirilmesi, bağışıklık tepkilerini ⁸ incelemek için farelere mükemmel bir model olun. Bağışıklık tepkisi karmaşıktır ve bir patojenin etkileşimi sonucu, yerleşik flora ve çeşitli immün (lenfositler, nötrofiller, makrofajlar) ve non-immün (epitel hücrelerinde, endotel hücreleri) hücre türleri ^2. İn vitro çalışmalar, gözlem izin vermez Bu karmaşık etkileşimler ve ağırlıklı olarak benzersiz hücre-patojen etkileşimleri odaklanın. Hayvan modelleri dikkatle kullanılmalıdır ve çok özel ve ilgili sorulara sınırlı olmalıdır iken, fare modelleri in vivo memeli bağışıklık tepkisi içine iyi bir fikir verir ve önemli klinik sorulara ⁷ bölümlerini hitap edebilir.

6 çok sayıda ilişkilendirme karmaşıktır. Ne bir "normal" bir hava yolu mikrobiyomları teşkil belirlenecek devam ederken, yerleşik topluluklar sık ​​sık polimikrobiyaldir, ve çeşitli ekolojik kaynaklardan. Süpüratif kronik akciğer hastalığı (kistik fibrozis, bronchectasis) olan hastalar ya da mekanik ventilasyon hastalar çevre edinilen mikroorganizmalar ⁹ ile bağlı solunum yollarının kolonizasyonu belirli bir bitki örtüsü sergilerler. Pseudomonas aeruginosa ve Candida albicans, hem sorun sık sık trakeobronşiyal örneklerinden birlikte izole, ⁵ patojenler olan ve özellikle yoğun bakım ünitesi (YBÜ) ^4, bu hastalarda şiddetli fırsatçı enfeksiyon sorumlu değildir.

P. karşı anti-mikrobiyal tedavi YBÜ sonuçlarında akut pnömoni sırasında bu mikroorganizmaların izolasyonu aeruginosa but maya genellikle bu sitede ^5'de patojenik olarak kabul edilmez. P. arasındaki In vitro etkileşimleri aeruginosa ve C. albicans yaygın bildirilen ve bu mikroorganizmaların büyümesini ve birbirlerinin yaşam süresini etkiler ancak çalışmalar sonucuna olamayacağını gösterdi olması halinde C. varlığı albicans konak ¹⁰ zararlı veya yararlı olduğunu. Fare modelleri P. bu alaka yönelik geliştirilen aeruginosa ve C. in vivo albicans, ancak mikroorganizmalar arasındaki etkileşim önemli nokta değildi. Nitekim, model C katılımını değerlendirmek için kurulmuştur konak immün yanıtın ve sonucun albicans.

Roux ve arkadaşları tarafından kurulan bir önceki model zaten C ile ilk kolonizasyon kullanılan albicans P. tarafından uyarılan akut akciğer enfeksiyonu takiben aeruginosa. Onların modeli kullanarak, yazarlar p zararlı rolünü bulunduanterior C. albicans ¹¹ kolonizasyon. Ancak Roux ve arkadaşları C'lik bir yüksek yük kullanılan 3 ardışık gün boyunca 2 x 10 ⁶ CFU / fare ile modelinde albicans arasından seçilir. Biz C'lik bir 4 günlük bir modeli kurulmuş albicans havayolu kolonizasyonu veya bu modelde C akciğer hasarı olmadan en az sebat, az albicans fare (Şekil 2B) ^12,13 başına 10 ⁵ CFU tek bir uygulamasından sonra 4 gün öncesine kadar geri alındı. 4 gün sonra, iltihaplı hücre alımı, enflamatuar sitokin üretimini ne de epitel hasarı bir kanıt gözlenmedi. C tepe varlığı, 48 saat, - 24 'de albicans, hücre ve sitokin doğal immün yanıt gözlemlendi bile, akciğer hasarı hiçbir kanıt yoktu. Şaşırtıcı bir şekilde, fareler, böylece C ile kolonize P. instilasyonunu intranazal albicans 48 saat önce aeruginosa P. ile farelere kıyasla enfeksiyonu zayıflatılmış olan yalnız aeruginosa enfeksiyonu. benndeed fareler az akciğer hasarını sergilenen ve bakteriyel yükün ^12,13 azalmıştır.

Birkaç hipotezler C ile önceden kolonizasyon bu olumlu etkisi açıklayabilir P. albicans aeruginosa akut akciğer enfeksiyonu aracılı. Birincisi, her mikroorganizmaları nisabı-algılama sistemleri, homoserinelactone tabanlı P. karıştığı bir türler arası çapraz konuşma aeruginosa sistemi ve farnesol tabanlı C. albicans sistemi değerlendirildi. İkinci olarak, C. akciğer epitel hücrelerinden patojenin aktarma P. aeruginosa için "tuzak" bir hedef olarak hareket albicans çalışılmıştır. Her iki hipotez (yayınlanmamış veri) geçersiz bulundu. Üçüncü hipotez C. tarafından doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir "priming" o oldu P. karşı geliştirilmiş bir sonraki doğal tepki sorumlu albicans aeruginosa. Bu son hipotez doğrulanmıştır. Nitekim C. albicans kolonizasyon doğal bağışıklık bir prime throu yol açtıGH IL-22, özellikle artan bakteriyel boşlukla sonuçlanan, doğuştan gelen lemfoid hücreleri tarafından salgılanır ve akciğer hasarını ¹² azalttı.

Sonuç olarak, bir ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin modüle edilmesi ve farklı enflamatuar hücre tipleri kapsayan mikroorganizmalar arasındaki etkileşimde bir rol oynamaktadır. Bu karmaşık etkileşmeler bağışıklık in vitro parçalara edilebilir olsa da, ilk hipotez, sadece in vivo modeller, uygun sağlanabilir. Aşağıdaki protokol, diğerleri mikroorganizmalar adapte edilebilir konukçunun yol açtığı patojen etkileşimi üzerinde in vivo çalışmalara bir örnek sunmaktadır.

Hayvan deneylerinde bölgesel etik kurul bölgesel araştırma araştırma kılavuzlarında ulusal ve uluslararası hayvan bakımı ve kullanımı ile uygun olarak bu yöntemi onayladı.

1. Numune Toplama

1. Örnek depolama
   1. Bozulmasını önlemek için dondurucu saklama kadar 20 ° C veya buz üzerinde - en depolamak hemen tüm örnekleri toplamak ve. Bronko-alveol lavaj (BAL) performansını artırmak için buz üzerinde, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) yerleştirin.
2. Cerrahlık
   1. Bir otoklav kullanarak tüm cerrahi ekipman sterilize edin.
      NOT: Eğer mümkünse, bu çapraz bulaşmayı önlemek için karın ve göğüs adımlar için araçların iki farklı ayarlar kullanılması tavsiye edilir. Gerekli diseksiyon ekipmanları Şekil 4A ayrıntılı olarak

2. Fareler, Bakteriyel ve Maya Türler

1. Yeniden hayvanların yerel kullanım uygun Ev farelerinedeniyle biyogüvenlik düzeyi 2 mikro organizmaların kullanımına bir biyogüvenlik düzeyi 2 konut tesisi, gıda ve suyla birlikte, kafes başına 5 fare aşmadan havalandırılan bir rafa arama komitesi kuralları: P. aeruginosa ve C. albicans arasından seçilir.
2. 40% gliserol ortamında -80 ° C sıcaklıkta bakteriyel suşlar tutun.
   1. 10 ul aşılama döngü kullanarak steril Luria-Bertani suyu 3 ml içeren kültür tüpüne donmuş stoktan doğrudan bakteri ekleyin. Orbital çalkalama (400 rpm) 37 ° C'de uygulanmasından önce gün O / N bırakın.
   2. Santrifüj Hasat bakteri 5 dakika boyunca 2.000 xg'de.
   3. Uygun bir kapalı biyolojik tehlikeli atık bertaraf içine süpernatant aspire. Kültür tüpünün dibinde beyaz yapışık pelet gözlemleyin.
   4. Yıkayın ve 5 ml PBS ile pelet askıya.
   5. Tekrarlayın ikinci yıkama gerçekleştirmek için ikinci kez 2.2.3 için 2.2.2 adımlar.
   6. 1 ml PBS ile yeniden süspanse edin topak haline bakterive kısa vorteksleme.
   7. Optik yoğunluk ölçer kullanılarak 600 nm'de optik dansitometresi kullanılarak aşı yoğunluğunun belirlenmesi. 0.9 bir yoğunlukta PAO1 10 ⁹ CFU / ml sine tekabül eder, buna bağlı olarak seyreltilir.
      NOT: Bu sonuç, kalibre edilmiş bir aşı ardışık seyreltiler yoğunluğunu belirlemek her kullanılan bir suş için elde edilmelidir.
   8. Seri logaritmik seyreltme inokülumu doğrulayın ve bromokrezol mor ağar (BCP) plakaları ve O / N kültürü üzerine her seyreltme 100 ul plaka. Her fareye, ml başına 1 x 10 ^{8 8} x 10 ila 2 CFU (fare başına 5 x 10 ^{6 7} x10 1 CFU) içeren çözeltinin intranazal 50 ul uygulayın.
3. Kullanım C. Bir referans suş olarak albicans SC5314. -80 ° C'de 40% gliserol ortamında suşu koruyun.
   1. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve daha fazla saymak kolaylaştırmak için% 0.015 amikasin ile Maya-Pepton-Dekstroz suyu Supplement.
   2. & 10 ile mayayı ekleyin# 181; 37 ° C 'de amikasin O / N ile takviye hazırlanmıştır YPD-suyu içine l aşılama döngü.
   3. 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj ile hasat maya.
   4. Uygun bir bioharzard atık bertarafı içine süpernatantı. Beyaz yapışık pelet kültür tüpünün dibinde dikkat edilmelidir.
   5. Yıkama PBS ve kısa vorteks 5 ml kullanılarak topak haline bakteri askıya alma ve.
   6. Tekrarlayın ikinci yıkama gerçekleştirmek için ikinci kez 2.2.3 için 2.2.2 adımlar.
   7. PBS ve kısa karıştırın 1 ml kullanılarak pelletini.
   8. 40x büyütme standart bir mikroskop kullanılarak bir Mallassez hematositometre üzerinde sayılarak inokulum boyutunu belirler.
      Not: (maya sayısı x 10 ⁵⁾ / (Mallassez hematositometre ile sayılmıştır ızgara dikdörtgenler sayısı): Konsantrasyon (CFU / ml) aşağıdaki formül kullanılarak elde edilir.
   9. Bu çözüm içeren onaylamak için 10 ^-5 ve 10 ^-6 seri logaritmik seyreltme ile doğrulayın 2 x 10 ⁶ CFU / ml.
   10. YPD agar plakaları üzerinde Plaka% 0.015 amikasin ile desteklenmiş.

C. 3. Airways Kolonizasyon albicans

Not: çevreye uyum sonra, farelere günde iki kez tartılmıştır.

1. Davlumbaz altında, 4 cm x 4 cm gazlı bez (açık-drop tekniği) ¹⁴ üzerine Sevofluran mevduat 500 ul.
   1. Hemen yaklaşık 750 ml indüksiyon odasının zemininde gazlı bez yerleştirin. Hemen hayvan ve gazlı bez arasında doğrudan temasını önlemek için gazlı bez üzerinde bir örgü kaldırdı bir platform yerleştirin.
   2. Hava geçirmez Kapağı kapatın ve odasında Sevofluran yayılmasına imkan 1 dk 2 bekleyin.
   3. Platformu ve yakın kapak mesh kafes fare aktarın. Korunmuş spontan solunum Işık anestezi 30 ila 45 sn sağlanmalıdır.
   4. Fare f çıkarılabilir bu noktada refleksi kaybı gözlemleyerek hipotoni için izlemekutu ve telkin rom.
2. İntranazal instilasyon (eğitimli bir operatör 10 saniye içinde) yapılabilir.
   1. Dik tutulan Sırtında (Şekil 4B) sokuldu tek elli fareyi tutun.
   2. Işaret parmağı kullanarak, baş desteklemek ve çeneyi tutmak için başparmak kullanın balgam (Şekil 4C) önlemek için kapalı.
   3. Aşama 2.3.8 de tarif edildiği gibi, hazırlanan C sağlamak albicans çözüm hacmini telkin bir 50 ul için ml başına 2 x10 ⁶ CFU içermektedir.
      NOT: İkinci kritik nokta aşılanan birimdir. Daha düşük 50 ul yetersiz kolonizasyon veya havayolu homojen olmayan damlatma neden olabilir bir hacim, daha geniş bir hacim boğulma / boğulma ve ölüme neden olabilir.
   4. Burun delikleri için pipet yaklaşarak içi nazal fareyi aşılamak.
   5. Burun deliklerinde çözeltisi içeren bir kabarcık oluşturan bir 50 ul damla Pipet daha sonra spontaneousl tarafından teneffüsy nefes fare.
   6. Bir kurtarma alanında yerleştirin Fare (örneğin, bir havai ısıtma lambası ile büyük, iyi havalandırılmış çıplak kafes). Fareler tam uyanış kadar izlenmesi gerekir. O sternum yatma ve doğrulma refleksi sürdürmek için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Bu noktada, bir fare normal muhafaza kafesine geri döndürülebilir.

4. P. aeruginosa -kaynaklı Akut Akciğer Enfeksiyonu

NOT: Fareler dört Aşağıdaki günlerde tartılır. Normalde, fareler C. sırasında kilo albicans aracılı havayolu kolonizasyonu (Şekil 2A).

1. P ihtiva eden bir süspansiyon hazırlayın aeruginosa O / N büyüme (bölüm 2.2) sonra instilasyonunun gün.
2. (Bölüm 3.1) yukarıda tarif edildiği gibi kısa bir süre anestezi sevofluran inhale kullanılarak.
   NOT: Akut akciğer enfeksiyonu gerçekleştirmek için, önerilen bakteriyel yükü önerilenTablo 1.
3. Post-instillation kurtarma özel dikkat (bölüm 3.2) yukarıda tarif edildiği gibi fareyi aşılamak.

Akciğer Hasarı Endeksi 5. ölçün

1. FITC-işaretli albümin ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. Hayvan ötenazi önce bu çözelti 2 saat enjekte edilir.
   1. Uygun ekipman ile albümin-FITC 0.2 mg tartılır.
   2. 1 ml PBS içinde 0.2 mg ekleyin. Kısaca vorteks. Derhal kullanılmadığı takdirde, ortam ışığına maruz kalmasını önlemek için folyo çözüm yerleştirin.
   3. Her bir fare FITC-işaretli albumin çözeltisi intraperitoneal olarak 200 ul enjekte edilir.
2. Ötenazi
   1. Geçen ağırlık verileri için fareler tartılır.
   2. % 5.47 pentobarbital 300 ul: pentobarbitalin letal doz aşımı bir intra-peritonal enjeksiyon kullanılarak araştırma komitesi kurallarda hayvanlarda lokal kullanımı ile uygun olarak, tek fare öldürülür.
   3. Kafesinden fareyi çıkarın ve l alıroperatör tarafından Ethal enjeksiyon.
   4. Enjeksiyonu takiben, herhangi bir diğer hayvanlardan gizli bir kafes, tek başına fare aktarmak. Hareketin yokluğunda kadar fareyi gözlemleyin. Onay ölüm hareketi, özellikle de solunum hareketi, nabız eksikliği olmaması gereğidir.
   5. Bu nedenle anestezik ne analjezikler olmadan, ölü hayvanlar üzerinde numunelerin cerrahi koleksiyon gerçekleştirin.
3. Cerrahi numune toplama: Göğüs aşama.
   NOT: steril koşullar oluşturmak için, her cerrahi biyo-güvenlik seviyesi 2 ortamında, steril ekipmanı ile ifa edilir.
   1. Cilde etanol uygulayın. Makasla orta karın için sternum orta hat cilt kesisi yapın. Her iki tarafta göğüs kafesi boyunca orta hat insizyon itibaren. Göğüs kafesi görselleştirmek için toraks iki tarafında cilt geri katlayın.
   2. Sırayla clavicles yukarı doğru gidiyor her iki tarafta göğüs kafesi dikey bir kesi yapın kıç ile tüm göğüs ön duvarı dayamak için muktedirum kalp ve akciğerler (Şekil 5A, 5B) mükemmel görselleştirme sağlıyor.
   3. Interventriküler arter yanındaki kalbi delinmesiyle ön heparined şırınga kullanarak kan toplayın. Plazmanın en az 100 ul elde etmek için 500 ul en az çekin. Buz üzerinde kan örneğini yerleştirin.
   4. Trakea (Şekil 5B ve 5C) görselleştirmek için bir orta hat servikal insizyon gerçekleştirin. Dikkatle trakea etrafında fasya teşrih. Trakea (Şekil 5C ve 5D) arkasında bir dikiş yerleştirin. Ardından dikiş doğru lavajı sağlamak için cannulating iğnenin etrafına kapalı olacaktır.
   5. 20-G modifiye gavaj iğne (Şekil 5D ve 4A) ile trakea boşaltın. Önceden yerleştirilen sütür ile kanüle trakea etrafında bir cerrahi düğüm.
   6. Bronkoalveolar lavajlar (BAL) gerçekleştirmek için, yavaşça ve kademeli olarak enjekte ve akciğer / 'içine buz gibi soğuk PBS 500 ul çizin. I üzerinde örnek yerleştirince hücresel lizis önlemek için.
   7. Adımı yineleyin 5.3.6, 3 kez 2 ml santrifüj tüpüne (Şekil 5E) içine 1500 ul BAL sıvısı ve havuz lavaj örneklerinin toplam elde etmek.
   8. Göğüs akciğerleri çıkarın. 80 ° C - 1,5 ml santrifüj tüpüne (boyut, bir akciğer ya da lob yarısına karşılık gelmelidir) ve en hızlı bir şekilde saklamak akciğer segmenti yerleştirin.
   9. Bakteriyel yük tespit ve buz üzerine yerleştirin PBS içeren bir önceden tartılmış hemoliz tüpü bir akciğer segmentleri yerleştirin.
4. Cerrahi numune toplama: Karın aşama.
   1. Karnın sol tarafında başka bir kesi yapın. Periton yoluyla dalak gözlemleyin.
   2. Dalak çıkarın ve buz üzerinde ikinci bir hemoliz 1 ml PBS içeren tüp ve yerine koyun.
5. Akciğer hasarı indeksi
   Not: Alveoler kapiler membran geçirgenliği ölçülerek değerlendirilir FITC etiketli albumin sızıntısını vasküler bölmeden alveoler-interstitial bölmesi.
   1. Santrifüj kan örneği ve 1500 x g'de 10 dakika boyunca BAL sıvısı. Yeni santrifüj tüplerine süpernatantlar toplayın. Peletler işe plazma veya BAL hucrelere karşılık gelır ve buz üzerine yerleştirilir.
   2. 96 çukurlu bir saydam plaka (300 | il kuyu) her bir kan yüzer (plazma, sarı) veya BAL süpernatanın 100 ul ekle. Hemen kullanılmadığı takdirde plaka üzerinde bir folyo koyun.
   3. Floresan plazmada düzeyleri ve floresan mikroplaka okuyucu (; emisyon, 520 nm uyarma, 487 nm) kullanılarak BAL süpernatantlar ölçün.
   4. Floresan oranı hesaplayarak akciğer hasarı indeksi belirleyin [(BAL süpernatanı / kan süpernatant) x 100].
6. Bronkoalveoler lavaj (BAL) diferansiyel hücre sayımı.
   Not: Adım 5.5.1 BAL sıvısının santrifüj elde edilen hücre pelletini kullanın.
   1. Gerekirse, kırmızı hücre lisis tampon kullanın. Cel ihtiva eden bir santrifüj tüpüne kırmızı hücre lisis tampon 500 ul eklel pelet. Kısaca vorteks ve buz üzerinde 10 dakika bekletin. Kırmızı-hücre parçalama durdurmak için 500 ul PBS ekleyin.
   2. 1,500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile hasat hücreleri. Süpernatantı ve steril PBS 1 ml hücre pelet askıya. Hücreleri Count bir Hemasitometre kullanarak. Bir Mallassez hematositometre üzerinde hücreleri numaralandırmak. Bir Sitospin bir slayt hücreleri konsantre.
   3. Hücre tanımlama ve sayımı (makrofajlar, lenfositler, nötrofiller) izin renklenme kiti kullanılarak leke hücreleri.
7. Akciğer bakteriyel yükü ve bakteriyel yayma
   Not: Akciğer bakteriyel yükün ve bakteriyel yayma, akciğer ve dalak değerlendirmek için, sırasıyla toplanmış ve PBS (aşama 5.3.9) 1 ml ihtiva eden önceden tartılmış hemoliz tüpleri içine depolanmıştır.
   1. 1 ml PBS ve akciğer veya dalak birini içeren hemoliz tüpleri tartılır. Akciğer homojenatları ve dalak homojenatları elde etmek için bir doku homojenleştirici ile örnekleri homojenize.
   2. Doku homo 100 ul yatırınSeri seyreltiler logaritmik elde etmek için steril PBS 900 ul ihtiva eden santrifüj tüplerine genates.
   3. P. BCP-agar ya da üzerinde son iki uygun seyreltilmiş örnekleri (10 ^-3 ve 10 ^-2) Plakalı aeruginosa veya C için agar YPD-amikasin-desteklenmiş albicans akciğer ve dalak yükü tayini.
   4. 37 ° C'de plakaları O / N inkübe edin. Ertesi gün, plakalar üzerinde koloniler numaralandırmak.
   5. Ana akciğer ağırlığı sonucu akciğer gramı başına CFU elde edildi. Akciğer örneklem büyüklükleri sonuçları akciğer gram başına CFU olarak ifade edilmelidir, aynı değildir.
      Dizin için formül şöyledir: [CFU] x [hemoliz tüpü ağırlığı ve akciğer] - [hemoliz tüpü ağırlığı].

Protokol açıklaması sırasında önce gördüğümüz gibi, deney (: deney çizelgesi Şekil 1) tamamlamak için 5 gün gerekiyor. Bir operatör deney tüm çalışma sırasında İstenen ve 10 fareden maksimum süreçleri işleyebilir. Daha fazla hayvan gerekiyorsa, iki kişi özellikle cerrahi numune toplama için gereklidir. Gerçekten de, tüm numuneler son farelerde FITC etiketli albümin artmış pasif alveolar kapiler sızıntıyı önlemek için 2 saat altında toplanması gerekir.

İlk adım C hazırlanmasıdır albicans aşı ve burun içi instillasyon C. havayolu kolonizasyon elde etmek için albicans arasından seçilir. A 4 gün-sebat modeli C 5 x 10 5 CFU burun damlatılması ile elde edilir fare başına albicans (Şekil 2B). Bu 4 gün boyunca fareler l indüklemez 5x10 5 CFU ağırlığı (Şekil 2A) ve damlatma kazançung yaralanma (Şekil 2C). C. rağmen Bu modelde 4 gün, 48 saat sonra yük azalır kadar albicans devam edebilir. Bu nedenle, P. aeruginosa -kaynaklı akut akciğer enfeksiyonu C 48 saatte perfomed edilir albicans kalıcılık.

Klinik akciğerin 75% 15 izole olarak P. aeruginosa'nın PAO1 önemli hastalık oluşturma faktörü, tip üç salgılama sistemi (T3SS) ihtiva eden büyük ölçüde, özelliği laboratuar suşudur. Tezler nedenlerle, PAO1 akut akciğer enfeksiyonu hayvan modellerinde ilgili bir suşudur. Akciğer hasarı akciğer hasarı indeksi olarak ifade havayolu içine damar bölmeden protein kaçağı ile ölçülen alveolo-kılcal geçirgenliği ile belirlenir. Inokulum (Şekil 3A) ile akciğer hasarı artar. Burada önceden olmayan yalnız PAO1 ırkının (5x10 6 CFU / fare) (Şekil 3B-3F) ile indüklenen eden modeli akut akciğer hasarı bileşeninin kinetiği raporC. aracılı emişli albicans-. Modelin soyu ve zaman seyrinin başlangıç ​​P. seçimine bağlı olarak aeruginosa inokulum sonraki bölümde ele alınmış ve Tablo 1'de önerilmektedir.

Grup başına beş fareleri kullanılmıştır. Akciğer hasarı indeksi (Şekil 3B), akciğer (Şekil 3C), bakteriyel yayılmasını (Şekil 3D), BAL sellüler (Şekil 3E) ve ayırıcı hücre sayısı (Şekil 3F) yansıtıcı dalakta, bakteriyel yükü, bakteriyel yükü her 12 belirlendi hr. Akciğer hasarı 24 saat ve 36 saat sonra enfeksiyon (Şekil 3B) arasındaki maksimum olmuştur. Bakteriyel yük gösterdi 1-log her 24 saat (Şekil 3C) azaltmak ml / CFU. Dalak Homojenat kültürler tarafından değerlendirilen Toplu bakteriyel yaygınlaştırma her gün (Şekil 3D) arttı. Son olarak, enfekte edilmemiş farelerde BAL sellüler esas olarak (% 90) oluşmaktadır birlikte oEnfekte farelerin BAL f alveoler makrofajlar, nötrofiller yaygın alındı ​​ve ayırıcı hücre sayımı% 90 nötrofil ve% 10 makrofajları ve lenfositleri (Şekil 3E, 3F) gösterdi.

Akut Akciğer Yarası Modeli Şekil 1. Timeline C arasında, Host-aracılı Etkileşim Explore albicans ve P. aeruginosa.
Bütün prosedürün grafik gösterimi. İlk adım konut tesis farelerin çevreye uyum olduğunu. İkinci adım C'dir albicans havayolu kolonizasyonu aracılı. Son olarak, üçüncü aşama P. aracılık ettiği akut akciğer enfeksiyonu aeruginosa. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Akut Akciğer Hasarı Şekil 3. Model P aeruginosa Bağlı.
(A) C57BL / 6J fareleri-nazal olarak içi P. artan yüklere bulaşmış aeruginosa (fare başına 1 x 10 6 7 10 x 5 CFU den) (n = grup başına 5), hata çubukları ± SD ortalamasını temsil etmektedir. Fareler 24 saat sonra kurban edilmiştir. Akciğer hasarı indeksi bakteriyel yükü ile orantılı artar alveoler-kapiller bariyeri geçirgenliğinin tarafından değerlendirilir. Akciğer hasarı indeksi Karşılaştırılması (bronkoalveoler lavaj üst fazlar kullanılarak akciğer homojenatları süpernatanlarında (siyah çubuklar) ve yeni kombine yöntemi ile gri çubuğu eski yöntem kullanılarak elde edilens) (BF) fareler içi nazal fare başına 5 x10 6 CFU bulaşmış. Fareler akut yaralanma modeli kinetik her 12 ila 48 saat ötenazi. Akciğer hasarı (B), akciğer bakteri yükü (C), dalak bakteri yükü (D), bronkoalveoler lavaj (BAL) selülaritesi (E) ve BAL diferansiyel hücre sayımı (F) de değerlendirilir. (n = 5), grup başına, hata çubukları ± SD araçları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Cerrahi Ekipmanları ve Burun damlatma.
(A)   Cerrahi ekipmanlar akut yaralanma modeli ve bronkoalveoler lavaj gerçekleştirmek için gerekli. İşte Trakeal kanül (20G) ve iki adet 1 ml'lik şırınga bir Luer-kilit 3-yollu valfe bağlanır. Bir şırınga akciğerlerden dışarı geri bronkoalveoler sıvıyı çekmek için, akciğerlere biri su enjekte etmek. (B, C)   Elinde fare pozisyonu burun içi instilasyon gerçekleştirmek için. Bu fotoğrafta, çene altında başparmak damlatma sırasında kapalı bir ağız sağlamaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Cerrahi ve Broncho-alveol Lavaj.
Göğüs geniş (A) açılır ve göğüs kafesinin kalp (B) yaralanmasını önlemek için yanal açıldı. Kan toplama ardından, servikal bölge trakea (C) maruz disseke edilir. Diş ipi olarak kullanılan birameliyat dikiş ipliği ve nefes borusu (C, D) arkasına geçirilmektedir. Trakea sonra şırınga ve 3-yollu vana üzerine monte (D) kombine 20-G kanül ile kanüle edilir. Trakea sıkıca trakea arkasında yer sütür kullanılarak cerrahi düğüm atarak kanül etrafında güvence altına alınmalıdır. Nihayet PBS 500 ul yavaşça akciğerlerde telkin ve daha sonra BAL yavaşça dışarı çekilir. (E) Sıvı telkin akciğerler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. S. Akut Akciğer Enfeksiyonu Modellerinde Kullanılan aeruginosa inoküller.
Aşı önerilen en uygun burun konsantrasyonları suşları göre akut akciğer hasarı ikna etmek.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.