Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Özet

Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.

Özet

Vasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri içinde ölüm yaygın bir nedenidir. Bu yazıda, damar hastalığı patolojileri doğru akış dinamikleri katkısını incelemek için bir yöntem mevcut. Duvar sertleşme, yara izi veya tüm sıvı akış oranlarını etkileyebilir kısmi stenoz ve pulsatil akım büyüklüğü, ya da pulsatilite indeksi ile sıklıkla Sağlıksız arterler. Çeşitli akış koşullarının çoğaltma kan pompasının alt bölmeyi sönümleme akış basıncını ayarlama sonucudur. Sıkıştırılabilir ortamı pompasından pulsatil basıncı emmek ve bu nedenle pulsatilite indeksi değişir için kapalı bir akış sistemi içinde hava giriş sağlar. Burada açıklanan yöntemi sadece çok kontrollü giriş ve kolayca ölçülebilir sonuçlar, yeniden üretilir. Bazı sınırlamalar ancak sistem tarafından yaklaşılır karmaşık fizyolojik nabız dalga, rekreasyon vardır. Endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, kan akışı ve thr etkilenirarteri ough. Kan akımının dinamik bileşen kalp debisi ve arter duvarı uyumu ile belirlenir. Akış dinamikleri vasküler hücre mekano-transdüksiyon sitokin salınmasını ve arter içinde hücre tipleri arasında çapraz-tetikleyebilir. Vasküler hücrelerde ko-kültür damar duvarında ve mekanik sinyal vasküler tepkisi üzerinde daha doğru bir resim yansıtan hücre-hücre etkileşim. Akışın dinamik ve ortalama (ya da sabit) bileşenlerine hücre tepkisinin de dahil olmak üzere akış dinamikleri, katkısı, bu nedenle hastalığın patoloji ve tedavi etkinliğini belirleyen önemli bir ölçümdür. Bir in vitro ko-kültür yerine getirilmiştir ve basınç simüle kardiyak çıktı üretir kan pompası alt süspansiyon ile, çeşitli patolojiler arter hastalığı araştırılabilir.

Giriş

Kardiyovasküler hastalıklar için morbidite oranları birçok sağlıksız damar sonuçlanan, Amerika'daki en büyük bulunmaktadır. Sağlıklı arterler bir endotel hücre (AK) tek tabaka ile kaplanmış yumuşak lümen yüzeyi ile, elastik doku oluşur. Arter akışı pozitif ortalama debi ile salınan bir dalga fonksiyonu olarak modellenmiştir olabilir. Pulsatilite indeksi (PI) salınım büyüklüğü bölüm ve ortalama debi (.. PI = (Max - Min) / Ortalama) ise, ¹ ve değişken damar elastikiyeti ile in vitro modellenmiştir ² Arter elastikiyet akışının depolanması önemlidir. Kalp kasılmaları enerji, sistolik basınç altında dilate ve kan akımı PI modüle önemli bir rol oynamaktadır. Kalp tutarlı olarak, belirli aralıklarla, hacimsel akışı muhafaza için, arteryel genleşme akım hızı, kesme stresi ve PI azaltarak akış stabilitesinin arttırılması, enine kesit alanını arttırmaktadır. Elastikiyet Sıklıkla sağlıksız arterler mevcut değişikliklerya da uyum vasküler yeniden, skar dokusu veya kireçlenme ^{3, 4} sertleşme görüntüleniyor. Ek olarak, neointimal hiperplazi (NIH), ⁵ anevrizma ve hipertansiyon ^{6 ve} vasküler fibrozların ⁴ gibi diğer damar hastalıkları, damar çapı daraltır olabilir. Ancak, mevcut ilaç tedavisi ve damar hastalıkları cihaz tedavisi genellikle sık sık damar morfolojisi ve özelliklerinde değişiklikler karmaşık bir damar hastalığında damar duvarı uyum veya kan akış dinamikleri önemini ihmal. Ne balon anjiyoplasti stent ne duvar elastisite ⁷ komplikasyon cevap. Bu nedenle, kan in vitro model arter hastalığı ve işlemlerin sonucu olan akımlarının hastalığı patolojileri ve tedavisinde gelecek etkisini araştıran önemlidir. Burada, damar hastalığı Pathol hücre yanıtını belirlemek için tasarlanmıştır fizyolojik ve patolojik kan akışını kopyalayan bir yöntem tariftakımının kontrolü. Sıvı akışı damar tüm hücreleri etkileyen damar sağlığında önemli bir mekanik sinyal olan damar duvarının kayma strese neden olur. Sıvı kesme için vasküler endotel üzerinde çeşitli mekanik algılayıcılar endotel ⁸ mechanosensing için son çalışmalarda gösterilmiştir birincil cilium dahil, tespit edilmiştir. Endotel hücre aktivitesi ve morfolojisi akış hızı, yönü ve pulsatilitesini etkilenir. Ek olarak, yumuşak kas hücresi (SMC) göçü interstisyel sıvı ^{ile 9 arasındaki} düşük hızlı akış mekano-sinyaller etkilenebilir ve akış ve sitokin ile akış sinyallerinin mekano-transdüksiyon için kendi yanıt verme yoluyla endotel hücrelerinden parakrin sinyali yoluyla olabilir ^{10 yayınlayacak.} Ortalama kesme, PI ve parakrin sinyal iletiminin "dozu" bağımlılık da birbirine olabilir. Tek tabakalı kültürü bu amaçla, çeşitli "doz" ile sıvı kesmeye vasküler hücre yanıtının belirlenmesi içinya da in vitro ko-kültür vasküler yeniden içine mekanistik anlayış sağlamak ve hastalık ve tedavi tahmini artırabilirsiniz. Bu deneyde kullanılan akış sistemi, bir kan pompası, bir yukarı akış sönümleme hava haznesi sadece deney düzeneği, bir alt hücre kültürü, paralel plaka akış odası ve ortam haznesi sırasında kullanılan bir alt-akış ölçer oluşur. Akış hızı anlamına gibi damar akım değişkenlerin kontrol dakikadaki vuruş ve PI kontrol akış hızı, darbe frekans ve basıncının esas olarak söndürme yoluyla elde edilebilir. Pulsatif kan pompalar hacimsel akış hızı ve nabız frekansı ortalama doğrudan ilgili, kontrollü inme frekansında, değişken strok deplasman mevcuttur. Akım devresi içinde bir hava rezervuarının giriş akışı salınım büyüklüğünü azaltarak, basınç sönümleme sağlar. Sönümleme odasının içindeki hava olması akış dalga aşırı basınç sağlayan, sıkıştırılabilir ise medya, sıkışmaz bir sıvıdırHava sıkıştırma tarafından emilir. Medya oranı hava çok damping nasıl oluştuğu üzerinde kontrol sağlar. Genişliğinde 50 mm uzunluğunda 75 mm Özel bir hücre kültürü akış odası akrilik oluşturuldu. Akış giriş deliğinden girer, ve akış odasının tamamen tutarlı akış sağlayan, giriş manifoldu boyunca genişler. Benzer akışı ve yapılar odası çıkışında bulunmaktadır. Hücreler, işlevselleştirilmiş slaytlar üzerine ekilmiş ve daha sonra akış odasına bağlıdır. Bu kolayca çalışma sonrasında alınan büyük nüfus için izin verir. Ortak kültür deneyleri sitokin / akım taşıma izin verirken kültürleri arasında, hücre-hücre teması ortadan kaldırmak için, gözenekli bir polikarbonat membran kullanılabilir. Bu sistem daha önce yüksek PI akışı ve endotel tek tabaka kültürü ve EC / SMC ko-kültür ^{1, 10} üzerindeki etkisini modellemek için hücre yanıtı için patolojik yüksek PI hastalığı araştırmak için kullanılır olmuştur. Bu akış con modellemek için kullanılan protokol anlataraketkiler cihazın, biz yanıtı hücre akım sinyali katkısını belirlemek başkalarına yardım etmek istiyoruz.

Protokol

1. Silanizasyon ve Slide biyomoleküler Functionalization veya Polikarbonat Membran

Not: Bu protokol kapsamında kimyasalların ve çözümleri çoğu yüksek buharlaşma oranları (etanol (EtOH), aseton, vb) var. Diğer adımlar düşük buharlaşma oranları için uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Parafin Film kapları mühür önerilir. Dikkat: (içerir: sülfürik asit, aseton, (3-aminopropil) trietoksisilan, glutaraldehid, EtOH) bulunan kimyasalların bir çoğu tehlikeli ya da uçucu kabul edilir. Kullanmadan önce uygun depolama, taşıma ve bertaraf için her malzemenin malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) başvurun.

1. Tam daldırma sağlanması yönüne bakılmaksızın temiz, cam slayt boyama çanak 1 mm 50 mm 75 mm ölçülerindeki yeni cam slayt, yerleştirin. Adımlarla 1,1-1,12 için kap kullanın.
   Not: Tüm takip eden ste için, 50 mm 75 mm boyutlarında kesilir 0,4 mikron gözenek boyutu ile ko-kültür için polikarbonat dahil (PC) zarPC işlevsellik ve AK tohumlama için PS.
2. Sülfürik asit (% 20), O / N slayt bırakın.
   Dikkat: Kullanmadan önce sülfürik asit için MSDS danışın.
3. , 5 dakikada, üç kez iyonu giderilmiş su içinde (DI) daldırma her DI değiştirerek slayt yıkayın.
4. 30 dakika boyunca aseton içinde slayt bırakın.
   Dikkat: Kullanmadan önce aseton MSDS'ye danışın.
5. % 6 (3-aminopropil) trietoksisilan / aseton çözeltisi O / N slayt bırakın.
   Dikkat: Kullanmadan önce (3-aminopropil) trietoksisilan ve aseton için MSDS danışın.
6. Aseton her zaman değişen, 5 dakika, üç kez aseton slayt daldırın.
   Dikkat: Kullanmadan önce aseton MSDS'ye danışın.
7. 5 dakika, üç kez DI daldırma her zaman DI değiştirerek slayt yıkayın.
8. 60 dakika boyunca% 1.5 glutaraldehid / DI çözeltide slayt daldırın.
   Dikkat: Kullanmadan önce glutaraldehit için MSDS danışın.
9. 5 dakika, iki kez DI daldırma her zaman DI değiştirerek slayt yıkayın.
10. Yer slaytSteril, laminar akış başlığı içinde 30 dakika boyunca% 70 etanol (EtOH) içinde s.
11. EtOH çıkarın ve buharlaştırılması için bir tortu geri kalan izin verir. Slaytlar rehydrate amacıyla steril DI ve drenaj slaytlar bırakın.
    Not: Slaytlar veya PC zar bir haftaya kadar 4 ° C'de cam slayt tutucu mühürlü ve saklanabilir. Hücre kültürü için kullanılması üzerine, tekrar 1.10 ve 1.11 adımları.
12. Slayt tutucudan slayt çıkarın ve laminer akış kaputu 100 mm kare petri tarafından 100 mm içine yerleştirin.
    Not: Bu kap, kalan tüm adımlar için kullanılacaktır.
    1. Monokültür deney için endotel hücre tohumlama için slayt veya PC hazırlayın.
       1. Coat fonksiyonalize kayar ya da PC, bir tarafta 1 mi fibronektin çözeltisi (25 ug / ml) ile (aşama 1,11), hücre kültür odası maruz yaklaşık alanı kapsayan.
       2. 1-2 saat boyunca 37 ° C'ye ayarlanmış, steril inkübatör slaytlar veya PC inkübe edin.
       3. İnkübasyondan sonra, GLA kullanarak kalan çözelti aspireBir vakum bağlı ss aspiratör pipet.
          Not: Slaytlar hemen ileride kullanılmak üzere 4 ° C sıcaklıkta O / N depolanabilir.
    2. Sadece EC / SMC ko-kültür hazırlanması için 1.12.2 adımları izleyin. Hazırlama ve ortak kültürlenme deney için yumuşak kas hücresi (SMC) kültür tohum.
       1. Akış odası, vakum ile uyum 50 mm dış çaplı, 30 mm, 50 mm iç çapı, 0.5 mm kalınlığında 75 mm boyutlarında, ve delikleri olan sürgünün (aşama 1,11) üstünde yer silikon conta.
       2. % 10 FBS / DMEM süspansiyon içinde 1 mi SMC hazırlayın. 7,% NaHCO ₃ ve 7.4 arasında pH 0.1 M NaOH çözeltisi ile 2 mg / ml kolajen tip-I 1 ml solüsyon nötralize ve 2 x 10 ⁶ hücre / ml nihai hücre yoğunluğu ile SMC süspansiyonu ile karıştırılır.
       3. Conta içindeki SMC çözeltisi yayılır ve 30 dakika boyunca _CO2 37 ° C'de inkübe slaytlar ve% 5.
       4. Kuluçkadan sonra, Modifiye Dulbecco karıştırılır, 25 ml% 0.1 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte slayt kapağı72 saat süre ile Eagle Ortamı (DMEM).
13. Cam slayt / polikarbonat membran üzerine Kültür endotel hücreleri (EC).
    1. Tohum cam slayt veya polikarbonat membran fibronektin yüzeylerinde 6,0 x 10 ⁵ hücre / ml başlangıç ​​konsantrasyonunda,% 10 FBS / DMEM içerisinde 1 ml EC.
    2. 37 ° C'de,% 5 _CO2 'de bir kuluçka hücreleri inkübe ve% 10 FBS 120 dakika karıştırıldı.
    3. 37 ° C kuluçka makinesi içinde ilave% 10 FBS / DMEM ile hücreleri ve yer ihtiva eden kapak slaytlar, _5% CO2 O / N, 70% -80% konfluent kadar.

Sıvı Viskozite ve hacimsel Akış Oranının Belirlenmesi 2.

Not: Döner viskometreler hassas ekipmanlar ve viskozimetre kullanım kılavuzu, kalibre sıfırlama ya da ölçümler gerçekleştirmeden önce danışılmalıdır.

1. Denemenin hedeflenen damar literatürde istenen sıvı kesme (τ) belirleyin.
2. KuvBir döner viskometre kullanılarak e,% 1 FBS / (μ) DMEM viskozitesi.
3. Poiseuille denklemi gerekli hacimsel akış hızı (Q) belirleyin:
   ,
   burada τ = sıvı kayma, μ = viskozite, Q = vol. akış hızı, w = bölme genişliği ve h = odası yükseklik).
4. Set pompa adımında 2.3 türetilmiş akış hızı ve sonraki tüm adımlar için kullanın.

Pulsatilite İndeksi 3. Belirlenmesi

Not: Sistemin içindeki tüm bağlantı portları uygun büyüklükte kilit halkası to-barb veya dişi luer-to-barb bağlantıları ile bağlanmış olması gerekir. Bağlama PVC boru daha sonra diken parçaları bağlanabilir ve devre tamamladı.

1. Doğru akış yönünde bölme (Şekil 3) ve ultrasonik akış ölçer süspansiyon, Şekil 2'de olduğu gibi akım devresine bağlayın.
   Ultrasonik debimetre ekipman hassas bir parçasıdır ve Not:Kullanım kılavuzu Kullanmadan önce danışılmalıdır.
2. Rezervuar hacmi içinde batık (pompa) rezervuar çıkış borusunu sağlayarak, DI su akış devresi ve haznesini doldurun. Bir akış ölçer kullanılarak akış dalga formu gözünüzde canlandırın.
3. Sönümleme odasının açık hava tahliye valfi sıvı / hava hacmi oranını değiştirmek için. Kapat farklı sıvı seviyesi aralıklarında hava tahliye vanası ve hesaplamak pulsatilite indeksi (PI = (V _Max - V _Min) / V _Ortalama) akış dalga tepe (V _Max), çukur (V _Min) kullanarak ve ortalama (V _Ortalama). Notebook Tutanak PI değerleri.
4. Mark ileride kullanmak üzere uçlu keçeyi, kalıcı mürekkep kalem kullanarak, sönümleme odasının sıvı seviyesini ve PI sonuçlanır. Patoloji literatüründe ¹¹ istenen PI düzeylerinin belirlenmesi.
5. Silikon Tüp Formation- İsteğe bağlı, kontrol pulsatilitesini daha gelişmiş bir yöntem
   1. Örneğin (a bas değişik oranlarda silikon elastomer tabanı ve kür ajanı karıştırın1 ila 36'dan: 10: e-to-çapraz bağlayıcı oranı. 1) değişik hedef elastik modülünün için, daha önce açıklandığı gibi ²
   2. Kısa bir süre önceden tespit edilmiş bir baz ile çapraz bağlayıcı oranına sahip silikon ön-polimer karışımı içine çelikten bir kanül (14 g), daldırma, tekrar daldırma tedavisi işlemi ile silikon tüp imal.
   3. Sertleştirme işlemi ortasında yön değiştirme, kanül polimer kaplamayı sertleştirmek üzere 4 saat boyunca 60 ° C'ye ayarlanmış bir fırın içine ön-polimer ile kaplanmış bir kanül yerleştirin.
   4. Aynı silikon elastomer karışımı ile daldırma işlemi tekrarlayın ve 0.3 ~ in mm kalınlığında borular sonuçları ek 4 saat, geri fırında koyun.
   5. Paslanmaz çelik kanül gelen ultra ince silikon tüp çıkarın.
   6. 3.3 Her yerine odasına sönümleme devresi ve test PI akış tüpleri bağlayın.

4. Pompa Sterilizasyon

1. 1 akış bölmesini (Şekil 2), PVC boru ve contalar daldırın0% hidrojen peroksit _{(H2O 2).} 4. adımda önce steril DI ile yıkayın.
2. Yedek inkübatör rafta kan pompasını yerleştirin.
   Not: Kuluçka raflar paslanmaz çelik olmalı ve tüm akım devresi ağırlığını taşıyabilecek gerekir.
3. Rezervuar hacmi içinde batık rezervuar çıkış borusu (pompa) sağlayarak% 10 _H 2 O 2 ile akış devresi ve haznesini doldurun. UV ışığı ile laminer akış başlığı içinde 20 dakika boyunca devre üzerinden pompalanarak O ₂ H ₂ sirküle.
4. Aspire Tüm _H2O borudan ₂ ve akım devresi üzerinden pompalanarak steril PBS ile yıkayın.

5. Akış Odası Meclisi

Not: Akış odacıklı vakum portu ve giriş ve çıkış akış bağlantı noktası (Şekil 2 ye bakınız) ile birlikte, bir akrilik, özel yapılmış levha oluşur. Chamber montaj kültür slaytlar üstüne akış odası ve contaları yerleştirme oluşur proPerly, hizalı ve aşağıda tarif edilmiştir.

1. 37 ° C su banyosunda% 1 FBS / DMEM Isınma ve akış odası hazırlayın.
   1. Hücre tarafı yukarı üstünde ve yer conta (adım 1.13) medya üzerinden AK slayt atın.
   2. (İsteğe bağlı) medya üzerinden PC zarı atın hücre tarafı yukarı üstünde ve yer conta (adım 1.13). PC zarının altında seribaşı SMC (adım 1.12.2) ile birlikte kültür slayt yerleştirin.
2. Conta deliklerden (Şekil 2) ile akış odasının vakum kanalını hizalayın.
3. Vakum hiçbir ortam sızıntı sağlanması vakum portu (Şekil 2) Vakum tüp takın.
4. Bahar kelepçeler, akış odasının her tarafında (Şekil 2 ve 5) üzerinde biriyle cam slayt ve kelepçe akış odası tertibatının altındaki yerleştirin polikarbonat levha.
5. Talep akışı 37 ° C'de inkübatör içinde sistemi _ve% 5 CO2 ve düşük pulsatilitesini doldurulur hazneden pompalayarak ortam ile devre doldurun.Hücrelerin önceden hazırlamak için 4 saat boyunca bu akış koruyun.
6. İstediğiniz zaman sıvı belirgin PI seviyesine odasına sönümleme hacim ve kültür ayarlayın.

Sonuçlar

Akış koşullarında Bakım akım devresi (Şekil 1) doğru montaj güvenmek durumundadır. Çapı Boru önce ve kültür odası sonra akış direncini ve sonraki basınç düşüşünü azaltarak büyük çaplarda mecliste önemli bir seçim vardır. Amaçlanan basınç ve akış hızı sağlamak için, amaçlanan boru ile deney öncesi akış ölçer ile sisteme monte edin. Silikon conta (resim mevcut değil) üzerinde delikli kültür odacıklı vakum kanalı (Şekil 2), hizalama, akım devresi içinde mühür tutar. Sızdırmazlık sağlamak i...

Tartışma

Bu protokol, in vitro pulsatil akışını taklit için bir yöntem tarif etmektedir ve hastalık patolojilerinde akış koşullarının etkilerini belirlenmesinde etkili ilk adım olabilir. Bu protokolü kullanarak önceki çalışmalar, bu protokol deneyimli laboratuarlar için tasarlanmıştır, akış koşullarının Ayrıca vasküler inflamatuar yanıt. ^{1, 10} katkıda bulunmuştur. Bunun gibi, ne de derinliği akışkanlar mekaniği, ne de biyokimyasal analizi tarif edilmektedir. Daha gelişmiş akışkan dinamiği, ¹

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aseton	Sigma-Aldrich	34850
Sülfürik Asit	Sigma-Aldrich	320501
(3-Aminopropil)trietoksisilan	Sigma-Aldrich	440140
Glutaraldehit Çözeltisi	Sigma-Aldrich	G5882
Etanol	Sigma-Aldrich	459844
Cam Slayt (70  mm x 50 & # 160; mm)	Sigma-Aldrich	CLS294775X50
Polikarbonat Membran	Millipore A.Ş.
Silikon Conta	Grace Bio-Labs	RD 475464
Fibronektin (25 & mu; g / ml)	Sigma-Aldrich	F1141
Kollajen Tip-I	Sigma-Aldrich	C3867
NaHCO3< / sub>	Fluka	36486
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
Sönümleme Odası			Bu oda özel olarak üretilmiştir ve Şekil 3 mühendislik çizimi kullanılarak talep edilebilir.
Kan Pompası	Harvard Aparatı	529552
Poli-Vinil Karbonat Boru	ABD Plastik	65066, 65063, 65062	Çeşitli boyutlar gerekebilir
Luer Bağlantıları	Nordson Medical	Çeşitli	boyutlar gerekecektir ve değiştirme kullanımı için bir dizi parça satın alınmalıdır.
Kültür Odası	Şirket içinde işlenmiş,	Özel	Akrilik, levhalar halinde satın alınabilir ve amaçlanan kullanım için işlenebilir. Şekil 2 de gösterilen mühendislik çizimi bu odayı yeniden oluşturmak için kullanılabilir.
Kare Petri Kabı	Cole-Parmer	EW-14007-10
Cam Slayt Tutucu	Capitol Scientific	WHE-900303
Fetal Sığır Serumu	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium Mediatech	, Inc.	10-013-CV
Akış Ölçer	Sonotec, GmbH	Sonoflow co.55/060
Sylgard Elastomer Kiti	Sigma-Aldrich	761036-5EA
14 G Çelik Kanül	Genel Laboratuvar	Kaynağı S8365-1