Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme

Özet

Bu el yazması, herbisit metabolizma hızlarının, bir dikot otundan eksize edilen yapraklarla nasıl etkili bir şekilde ölçülebileceğini, böylece değişkenliği nasıl azaltabileceğini ve tipik olarak tüm bitki tahlillerinde gözlemlenen herbisit alımının veya translokasyonunun olası kafa karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırabileceğini açıklamaktadır.

Özet

Zorunlu bir dikot otu olan su kenevirinde (Amaranthus tuberculatus) herbisit metabolizması oranlarını izole etmek ve doğru bir şekilde belirlemek için, herbisit alımını normalleştirmek ve herbisite dirençli ( R ) ve duyarlı (S) su keneviri popülasyonlarında katkıda bulunan faktörler olarak translokasyonu ortadan kaldırmak için vejetatif bir klonlama stratejisi ile birleştirilmiş eksize edilmiş bir yaprak tahlili geliştirdik. Bitkilerdeki organik pestisitlerin biyokinetik analizleri tipik olarak alımın, translokasyonun (hedef bölgeye teslim), metabolik kaderin ve hedef bölge ile etkileşimlerin belirlenmesini içerir. Herbisit metabolizması, herbisite dirençli yabani otlarda ve herbisite toleranslı mahsullerde ölçülmesi gereken önemli bir parametredir ve tipik olarak radyoaktif işaretli herbisitler kullanılarak tüm bitki testleri ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, tüm bitki yöntemlerinden türetilen biyokinetik parametrelerin yorumlanmasındaki bir zorluk, translokasyonun genellikle herbisit metabolizması oranlarından etkilenmesidir, çünkü polar metabolitler genellikle herbisit detoksifikasyon reaksiyonlarını takiben bitki içinde hareketli değildir. Bu yazıda açıklanan protokolün avantajları arasında R ve S popülasyonlarında herbisit bozunma oranlarının tekrarlanabilir, doğru ve hızlı bir şekilde belirlenmesi, tüketilen radyoaktif işaretli herbisit miktarında önemli bir azalma, daha fazla işleme ve bertaraf gerektiren radyoaktif işaretli bitki materyallerinde büyük bir azalma ve sera yerine laboratuvarda veya büyüme odasında radyoaktif işaretli herbisit deneyleri gerçekleştirme yeteneği yer alır. Herbisit direnci dünya çapında dikot yabani ot popülasyonlarında gelişmeye ve yayılmaya devam ettikçe, burada geliştirilen ve açıklanan eksize edilmiş yaprak tahlili yöntemi, artan herbisit metabolizması ve detoksifikasyon oranları nedeniyle hedef olmayan bölge bazlı direnci araştırmak için paha biçilmez bir teknik sağlayacaktır.

Giriş

Otların herbisit direnci gıda ve lif ^1,2 küresel üretim ciddi bir tehdit sunuyor. Şu anda yüzden fazla ot türünden dayanıklı nüfus ve biyotipten dünya çapında binlerce belgelenmiş ve ³ çalışılmıştır. Bitkilerde herbisit dayanıklılığı veren önemli bir mekanizma, herbisite protein bağlama kinetikleri veya hedef site ^gen 2 amplifikasyonu etkileyen genetik mutasyonlar da dahil olmak üzere herbisit hedef sitesi genler ve proteinler, değişikliktir. Sitokrom P450 monooksigenazı (P450) ya da glutation S -Transferase (GST) enzimlerin yüksek aktiviteleri ile metabolik detoksifikasyon hedef alan bazlı mekanizmalar ² çeşitli şekillerde farklı olan bir yabani ot herbisid direnci kazandıran bir mekanizmadır. Metabolik tabanlı direnç (spor cezaları aka) bitki spor maliyetleri herbisit dayanıklılığı mekaniği kaynaklanabilecek olup önemli etkileri vardırm, hem de yabani popülasyonları ^1,2,4 bölgesindeki çapraz veya birden fazla herbisit direnci vermek için, tek bir detoksifikasyon mekanizması potansiyeli açısından. Genel olarak, bitkilere herbisid metabolizması üç ayrı ⁵ ayrılabilir. Artan polarite ve kısmi herbisit detoksifikasyon ^5,6 giden ya da O-dealkilasyon reaksiyonları - Faz I Bu aromatik halkaların ya da alkil gruplarının P450 aracılı hidroksilasyon, ya da N ile olduğu gibi, herbisit veya değiştiren aktivasyonunu içermektedir. Yeni ben GST'lerin azaltılmış glutatyon konjugasyon için bağlantı siteleri sağlayabilir veya Faz II ^5,7 UDP-bağımlı glikosiltransferazların tarafından glikoza Faz fonksiyonel gruplar tanıttı. Örneğin, mısırda primisulfuron-metil baştaki metaboliti hidroksi-primisulfuron-glukosite (Phase II) ve daha sonra metabolize uzun süreli depolama ya da daha fazla metabolik için vaküole nakledilebilir hidroksi-primisulfuron-metil ^8, olduğu profesyonelcessing ^5,6 (Phase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) Birleşik Devletler mısır üretimini (Zea mays), soya fasulyesi (Glycine max) ve pamuk (Gossypium hirsutum) engelleyen bir zor kontrol, dikot yıllık yabancı ot türüdür. Waterhemp genetik çeşitliliğin yüksek derecede onun ikievcikli biyolojisi ve uzun mesafe rüzgar tozlaşma ile kolaylaştırılır ve bir tek kadın waterhemp bitki milyon tohumlar ⁹ kadar üretebilir. Bu tohumlar doğal olarak etkili bir dağılma mekanizmasına sahip waterhemp bağışlamak, hangi küçük ve kolayca yayılırlar. Waterhemp büyüyen ^sezon 9 boyunca sürekli çimlenme görüntüler ve tohumları uyuşukluk birkaç yıl sonra filizlenmeye edebiliyoruz. Waterhemp ekilebilir kırpma sistemlerinde ¹⁰ en geniş yapraklı yabancı otların daha yüksek büyüme oranını sahip bir _C 4 bitkidir. Ayrıca, çok sayıda waterhemp popülasyonları birden fam dayanıklıdırherbisit ³ ilies.

Illinois waterhemp (MCR adlandırılır) popülasyonu 4-hidroksi-fenilpiruvat dioksigenaz (HPPD) bu tür mezotrion olarak inhibe edici herbisitler ^11, hem de atrazin ve asetolaktat sintazı (ALS) için, herbisit inhibe edici primisulfuron-metil içeren dayanıklı , hedef dışı site bazlı mekanizmalar ^12,13 nedeniyle. Ve atrazin dirençli ancak mezotrion duyarlı ve primisülfüron-metil duyarlıdır DTH ¹⁴ olarak adlandırılan bir waterhemp popülasyon (nedeniyle ALS geninin mutasyona) primisülfüron-metil-dirençli ACR ¹⁴ belirlenen waterhemp farklı bir popülasyon, mezotrion ve atrazin, bizim daha önceki araştırmalar ¹² ve mevcut deneylerde MCR ile karşılaştırıldığında kullanıldı (Tablo 1 'de özetlenmiştir). İlk çalışmalar MCR içinde, HPPD gen dizisi veya ifade düzeylerinde değişikliklere, veya azaltılmış mezotrion alımını tespit etmediNüfus zaman mezotrion duyarlı nüfus ¹² ile karşılaştırıldığında. Ancak, bütün bitkilerle metabolizma çalışmaları ^11,12 mezotrion önceki fenotipik yanıtları ile ilişkili ACR ve WCS ile karşılaştırıldığında MCR ebeveyn mezotrion herbisit anlamlı derecede düşük düzeylerde gösterdi.

Waterhemp Nüfus	Kısaltma	Mezotrion için Fenotip	Mezotrion Direnç Mekanizması	Primisülfüron için Fenotip	Primisülfüron Direnç Mekanizması
McLean İlçe Dayanıklı	MCR	Dayanıklı	Metabolizma *	Dayanıklı	Metabolizma
Adams County Dayanıklı	ACR	Sensitive	-	Dayanıklı	ALS 14 Hedef site mutasyonu
Wayne County Duyarlı	WCS	Duyarlı	-	Duyarlı	-

* Geliştirilmiş metabolizma dışında hedef olmayan site direnç mekanizmaları, aynı zamanda MCR nüfus ¹² mezotrion direnci kazandırabilmektedir.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Illinois'den waterhemp popülasyonlarının tanımlanması.

Sağlam waterhemp fide herbisid metabolizması hızlarının belirlenmesine ek olarak, farklı deneysel yaklaşım geliştirilmiştir ve kesilmiş waterhemp yaprak tahlil ¹² yanı sıra çeşitli P450 inhibitörlerinin (ör tetcyclacis malathion) kullanarak, metabolizmayı incelemek için önceki çalışmada kullanılan. Bu yöntem, bir önceki yaklaşımlardan waterhemp için özel olarak uyarlanmıştıreksize yaprak tahlili henüz bir dikot bitkide herbisit metabolizması araştırma için rapor edilmemiştir beri eksize mısırda primisulfuron-metil metabolizması lı soruşturma, ¹⁵ bırakır. Organophophosate insektisit malation sıklıkla in vivo kullanılmıştır ve in vitro herbisite metabolizması araştırma P450 tutulumu ¹⁶ gösterir. Örneğin, tolerans ve mısırdaki mezotrion ve hızlı metabolizma malation mezotrion ¹⁷ mısır duyarlılığı arttıkça doğrulanmıştır P450 katalizlenen halka hidroksilasyon, kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, malation kesilmiş mısır ALS inhibitörü primisulfuron-metil ¹⁵ yaprak metabolizmasını inhibe etti. Bitkilerde sistemik olarak, topraktan çıkma herbisidlerin metabolizmasını değerlendirirken eksize yaprak tekniğin önemli bir avantajı, üretilen veriler bütün bitki translokasyon desen bağımsız olmasıdır, önemli bir faktör dikkate. Sonuç olarak, bu yöntem, niceliksel izin verir veNitel metabolik tedavi edilen tek bir yaprak ¹² odaklanmak analizleri.

Bir bitkisel klonlama stratejisi, eksize yaprak protokolü ile kombinasyon halinde, daha önce metabolizma çalışmaları ¹² yapmak için waterhemp da kullanılmıştır. Nedeniyle waterhemp (ayrı erkek ve dişi bitkiler) ve ikievcikli amaranthus türlerinin ⁹ içindeki genetik çeşitliliğin büyük derecesi outcross doğası gereği, bu protokol genetik özdeş waterhemp fidanları zaman ders deneyler içinde analiz edildi sağlanmalıdır. Bu makalede, bir dikot ot (waterhemp) herbisid metabolizmasının oranlarını ölçmek için kesilmiş yaprak yöntemin kullanımını göstermektedir. Ana yabani ot öldürücü miktarı, (absorbe herbisitin% 50 indirgeme için zaman tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğrisi ile uygun olan doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile her bir zaman noktasında (Şekil 1) belirlendi ve geri kalan DT _50). Temsilciters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile ilgili kromatogramlar karşı ALS ve zaman-akışı çalışma sırasında ana yabani ot öldürücü ve kutupsal metabolit (ler) eşlik eden oluşumuyla kaybolması göstermektedir -duyarlı waterhemp popülasyonları (Şekil için gösterildi 2). Bizim derlemenin konusu düzgün olarak bir halka etiketli (URL- ¹⁴ ° C) herbisit kullanarak, tarif ve dikot bitkilerdeki herbisid metabolizmasının yeniden üretilebilir ve kesin hızını belirlemek için bitkisel klonlama yöntemi ile kombinasyon halinde kesilmiş yaprak testinin kullanılmasını göstermek için bunların bütün bitki yanıtlarında farklı üç waterhemp popülasyonları HPPD- ve ALS engelleyici herbisitler (Tablo 1).

Protokol

1. Bitki Malzeme Büyüme Koşullar ve Bitkisel Klonlama

Not: Üç waterhemp nüfusları bu araştırmada incelenmiştir: MCR (Adams County, IL itibaren), ACR ve WCS (McLean County, IL itibaren) (Tablo 1) (Wayne County, IL itibaren).

1. Toplamak ve 0.1 g ^L-1 agar içinde waterhemp tohumları askıya: çimlenmeyi artırmak için en az 30 gün süre ile 4 ° C 'de su çözeltisi. Not: Bazı waterhemp popülasyonları uykuda, ama bu adım dinlenmesi aşmak ve tohum daha muntazam çimlenme yapmak için yardımcı olur.
2. Bir serada saksı ortamı içeren 12 x 12 cm tepsilere (Tablo 1 'de olduğu gibi), her waterhemp nüfusun tohum çimlenme.
   1. Bir 16/8 saat fotoperyod ¹² içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında sera koşulları koruyun.
   2. 500 umol m minimum sağlamak için cıva halide lambaları ışık serada doğal ışık Supplement ^-2 Bitki gölgelik düzeyinde sn ^-1 foton akı.
3. Onlar 80 cm serada ³ tencere içine 2 cm boyunda olduğunda Nakli fidan ortaya çıktı.
4. 1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: kum fidanları 4 cm boyunda 950 cm 3 içeren ³ kap içine Nakli fidanları. Her tencereye yavaş salınımlı gübre granüllerinin 5 g ekleyin ve bu toprak karışımı ile karıştırın.
5. Apikal hakimiyetini ortadan kaldırmak için kesin ve 7 cm boyunda bitkilerden üç genç yaprakları içeren sürgün apikal meristemi kaldırın.
   Not: Bu adım her bitki klonlamak için yeterli 3 cm aksiller sürgünler büyüyecek olmasını sağlar.
6. Fideleri (Tablo 1 'de olduğu gibi), her waterhemp popülasyonundan boyunda yaklaşık 14 cm olan tüketim beş aksiller filizleri (uzunluğu 3 cm). Daha fazla kullanım sırasında su kaybını azaltmak için bu aksiller sürgünlerde yaprak çoğunluğu çıkarın, ancak nakli üzerine daha fazla büyümesini sağlamak için iki genç yaprakları korumak.
   Not: dikkatle tutun ve yaprakları sökerken sürgünler zarar vermemeye çalışın. Bir hissesini her bitkiyi etiketleyin.
7. Nakli Aksiller çimlenme için kullanılan aynı orta saksı ortamı içine 80 cm ³ tencere (saksı başına bir fide) içine vuruyor. Dolgu ortamı başlangıçta, doymuş bir büyüme odasında kökleri oluşana kadar, daha sonra kökleri oluşturmak için 7 gün boyunca bir büyüme odasında sabit bir nem ve yeri kaplar muhafaza edilmelidir.
   Not: Bitkiler bu noktada çok hassastır ve stresli olmamalıdır.
   1. Bir 16/8 saat fotoperyod ¹² içinde 28/22 ° C gündüz / gece sıcaklıklarında büyüme odası koşulları koruyun.
   2. Akkor ve floresan ampuller bir arada büyüme odasında ışık sağlamak için kullanılabilir ve en az 550 ľmol m ^-2 bitki gölgelik düzeyinde ¹² at sn ^-1 foton akı teslim etmelidir.
8. 950 cm ³ tencere içine tekrar Nakli (saksı başına bir fide) c1: 1: saksı karışımı 1 karışımı: Toprak: turba: 3 içeren gruptur klonlanmış bitkiler 4 cm boyunda olduğunda kum sonra tekrar seraya transfer (ayrıca 5 gr yavaş salınımlı gübre granülleri dahil).
9. Yukarıda açıklanan aynı yöntemi kullanarak bitkilere ikinci kez Clone (yani tekrar adımlar daha sonra 1.8 1.5 ve 2.1 den adıma geçin). Tipik bir zaman ders çalışması için, her waterhemp nüfus en az altı bağımsız bitkilerden klonlar oluşturmak ve çizgiler MCR _{1-6, 1-6} ve ACR WCS _1-6 olarak kaydeder.
   1. Deneyi tekrar ve yeterli her waterhemp nüfus içindeki genetik değişkenliği temsil etmek için en az altı farklı "üst" klonal hatları oluşturulması.
   2. Analiz edilecektir kaç zaman noktalarında bağlı olarak, zaman ders çalışma yürütmek için her bir "ebeveyn" klonal satırından yeterli alt klonları oluşturmak.

2. eksize Waterhem ile Metabolizma Çalışması yürütmekp Yapraklar

1. Klonlanmış waterhemp bitkiler herbisit metabolizması ve DT ₅₀ analiz için uzun boylu 10 ila 12 cm ne üçüncü en genç yaprakları (ekli petiole 0.5 cm dahil uzunluğu 2 ila 3 cm) tüketim.
2. Her waterhemp bitkiden Kesme yaprak sapı ikinci kez su altında (yaprak sapı 0,3 cm kalmasını sağlayarak) ve Bu kesme 1,5 ml'lik plastik tüplere (şişe başına bir yaprak) ¹⁵ içine sona yerleştirin.
   Not: su altında bir kez kesme biçimlendirilmiş ve odunsu doku damarları takmayı hava kabarcıkları önler.
   1. İlk olarak, kısmi olarak 1 saat süre ile 0.1 M Tris-HCl (pH 6) ile ön inkübasyon tampon maddesi (200 ul) kesme Petiol ile birlikte eksize yaprakları bırakın.
   2. İkinci olarak, yeni bir 1.5 ml'lik bir şişe, 0.1 M Tris-HCl (pH 6) artı 150 uM [URL- ^14C] herbisitin (200 ul), bir inkübasyon tampon içeren, her bir yaprak getirin ve 1 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin yaprak bitkilerine herbisit emme için izin verir.
      Not: Her iki ¹⁴ C-mezotrion ve 14 C-primisulfuron-metil yaklaşık 20 mCi mmol belirli etkinlikler bizim çalışmalarda kullanılan ^-1. Ksilem transpirasyon akışı ile her ikisi de difüzyon ve alımı yaprak başına alınan herbisit miktarı katkıda bulunur.
      Not: herbisit metabolizması metabolik inhibitörlerinin etkisi, adım 2.2.1 yukarıda 2.2.2 değiştirerek belirlenebilir. Ön kuluçka tamponu inhibitörün 100 uM ekleyin ve sonra herbisit ile kuluçkalama tamponuna aktarma ve yeniden 100 uM inhibitörü ekleyin, 2 saat süre ile inkübe edin. Örneğin, malation ve tetcyclacis bitkiler ^15-17 belirli sitokrom P450 aktivitelerini inhibe eder.
   3. Deiyonize su ile eksize yaprakları dalmış kısmını yıkayın ve çeyrek gücü Murashige ve Skoog (MS) tuzları solüsyonu (500 ul), sırasıyla 0 saat, 5 saat, 11 saat, 23 saat veya 35 saat için eksize yaprakları transfer zaman akışı metabolizması çalışma için bir büyütme odasında.
3. Izin kaldırarak HasatEl ile inkübasyon, uygun bir zaman noktasında çözeltisi ve S, bir polipropilen tüp (15 mi) ve cam havan tokmağı kullanarak sıvı azot içinde, her bir yaprak dokusu öğütün.
4. Radyo-etiketli herbisit ve yukarıdaki gibi aynı polipropilen tüp içinde laboratuar doku homojenizörü ile% 90 aseton 7 ml her yaprağın onun metabolitleri ekstrakte edin. % 90 aseton ek 7 ml doku homojenleştirici durulayın ve doku iyice (genellikle yaklaşık 2 dakika) toz haline gelene kadar homojenize devam eder. Not:% 90 aseton bitki dokularında en herbisitlerin ekstraksiyonu için de kullanılabilir. Bu yöntem emilen radyo-etiketli bileşikler% 90'dan daha fazla elde etmek için mümkün olan, ancak, daha sonra% 90 metanol veya% 90 asetonitril özütleme çözücüsü gibi ikame edilebilir.
5. Ek çıkarma oluşması için Etiket% 90 aseton ekstreleri (14 ml toplam) ve mağaza da -4 16 saat C izin °.
   Not: işlenmiş yaprakların bu çekimi sonrasında, özütlenebilir rad miktarıioactivity işlenmiş yaprak tarafından emilen radyo-etiketli bileşiklerden en az% 98, tipik olarak. Eksize yapraklarda olmayan ekstrakte radyoaktivite (bağlanmış artıklar) daha önceki çalışmada ¹² tüm zaman noktaları arasında sadece% 0.3 ortalama, fakat bu miktar incelenmiştir kullanılan herbisitin ve zaman noktasına göre değişebilir.
6. 0.5 ml'lik bir nihai hacme kadar santrifüj 10 dakika boyunca 5000 x g'de örnekler ve bir döner buharlaştırıcı ile 40 ° C 'de konsantre süpernatanlar elde edilir. 2.0 ml bir plastik tüpe Bu hacim aktarın.
7. Tesisinin son hacmi 1.25 ml özler ayarlayın ve yeniden santrifüj 10,000 x g'de 10 dakika boyunca herhangi bir partikülleri ortadan kaldırmak için: (1 hacim itibarı ile, 1) su: asetonitril ekleyin.
8. (Dpm ul ^-1), sıvı sintilasyon spektroskopisi (LSS) ¹² ile her bir örnek alınan bir alikot toplam radyoaktivite ölçülür ve miktarlarını normalize (örneğin HPLC analizi için enjekte bileşikler, 10,00 ^{[14C-etiketli]}Sonuçları grafik zaman 0 toplam dpm / numune / run) yani y-eksenleri örnekleri arasında muntazam olacaktır.

Kesilen Leaves Herbisit Metabolizma 3. HPLC Analizi

Not: Aşağıdaki RP-HPLC koşulları ¹² ile ana herbisit ve herbisit metabolitleri içine toplam ekstrakte radyoaktivite giderin.

1. 1 ml dk bir akış oranında _bir C18 kolonu (4.6 x 250 mm, analitik HPLC için 5 um parçacık boyutu) olan, RP-HPLC gerçekleştirme ^-1 en polar olmayan herbisit.
   Not: C _{4 ya da} Cı ₁₂ RP-HPLC sütunları da onun metabolitleri ile ilgili ana yabani ot öldürücü ayrılmasını optimize etmek için kullanılabilir. Ön sütun filtresi ve / ya da koruyucu sütunu korunması ve RP kolonuna ömrünü uzatmak için kullanılabilmektedir.
   1. Eluent A, su içinde% 0.1 formik asit (hac / hac) ve Taşıyıcı B% 100 HPLC-grade asetonitril: RP-HPLC için aşağıdaki mobil faz kullanın.
      Not: HPLC-dereceli metanol El olarak kullanılabiliruent daha polar bileşikleri ve metabolitleri çözülmesi için B, ama tutma süreleri de değişebilir unutmayın.
      Not: araştırmamızda ¹² kendi polar metabolitlerden mezotrion ya primisulfuron-metil çözmek için kullanılan elüsyon profili: Adım 1, A: B (4: 1, hac / hac): B (3: 2, hac / hac ) doğrusal gradyanı (12 dakika); B: A: (2, hac / hac 3): Aşama 2, bir B (3: 7, v / v) bir doğrusal gradyan (5 dakika); Aşama 3, A: B: A: (7, hac / hac 3) B: 2 dakika boyunca lineer gradyanı (9: 1, v / v) (19 dakika toplam içeren) karıştırılır.
      Not: Degradeler ve İzokratik adımlar çözünürlüğünü optimize etmek için ana malzemenin fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerekebilir.
   2. B (4: 1, v / v) bir doğrusal gradyan (3 dakika) ve a: A: (9, h / h 1) B: A, yukarıda doğrusal gradyan adımları B (4: 1, v / h) en az 2 dakika izokratik aşama () aşağıdaki özü ¹² enjekte etmeden önce RP sütunu yeniden dengelemek için.
2. Algılama ve Akış sintigrafisinde ile radyoaktif işaretli bileşikler görselleştirmekllation Analyzer. Her bir numunedeki toplam radyoaktivite yüzdesi olarak, her bir numune içinde Kalan üst herbisit miktarını kaydedin (algılanabilir ve üreticinin talimatlarına uygun olarak akış Sintilasyon Analiz cihazı ile ölçülmüştür) bir zaman boyunca, her waterhemp popülasyonda herbisit metabolizmasının oranlarını belirlemek için.

4. Statistik prosedürler

1. Bir tesadüf tasarım (ya da istatistiksel analizler için başka uygun bir düzenleme) tedavileri düzenleyin.
2. Her bir deney için üç biyolojik çoğaltır oluşan her tedavi, iki bağımsız deneyler yapın. İki bağımsız deney toplam altı biyolojik çoğaltır içerir. Deney etkisi (α = 0.05) anlamlı olmayan ise, her bir bağımsız deneyde verileri birleştirmek ve analiz. Deney etkisi önemli ise, o zaman ayrı ayrı deney analiz.
   Not: İlk üç biyolojik çoğaltır dahil in 1 Deney ve Deney 2'de önümüzdeki üç biyolojik çoğaltır Her biyolojik çoğaltmak (MCR _1-6, ACR _1-6 ve _1-6 WCS) Her nüfus türetilen klonal çizgi böylece ayrı bir "üst" temsil her zaman- Tabii analizi genetik özdeş bitkiler kullanır. Iki bağımsız deney her waterhemp nüfus için bir medyan DT ₅₀ genetik değişkenliği ve kararlılık, yeterli temsili sağlayan toplam altı biyolojik çoğaltır içerir.
3. Doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile verileri analiz ve DT ₅₀ s tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğri ile uyum. Aşağıdaki denklem modeli anlatılmaktadır:
   
4. nerede bu model y t zamanında kalan ebeveyn herbisit yüzdesini temsil, μ _i her DT ₅₀waterhemp nüfusu i ve parametre C ₀ t = 0 ¹² de ana herbisit mevcut tahmini tutardır.

Sonuçlar

Mezotrion metabolizma oranlarında büyük farklılıklar WCS veya ACR ve MCR (Şekil 1) ya arasında tespit edildi. Her zaman noktasında, MCR daha hızlı bir şekilde daha önceki bütün bitki fenotipik yanıtların ¹¹ ile ilişkilidir, iki mezotrion-hassas grupların, WC'ler ve ACR, daha mezotrion metabolize olan. Her nüfus tek bir ebeveyn bitkiden yeterince bitkiler klonlama yoluyla, herbisit metabolizması zaman ders analizleri nedeniyle her zaman ders ¹² içindeki genetik değişkenlik eksik...

Tartışma

Burada tarif edilen kesilmiş yaprak yöntemi, mısır yaprak ¹⁵ içinde primisülfüron metabolizma araştırma, daha önce kullanılmış olan, ancak sonuçlar, bu protokol, aynı zamanda, bir dikot zararlı bitki türleri ¹² herbisid metabolizmasını ölçmek için, etkili, uygun ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bütün bitki çalışmalarla karşılaştırıldığında kesilmiş yaprak tekniğin önemli bir avantajı, bir kesilmiş yaprak bütün bitki translokasyon toprak yüzeyine çıkma sonrası kalıpları, sistemik herbisit...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tohumların ön çimlenmesi için	Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Saksı ortamı	büyümesi için	Sun Gro Bahçecilik	49040233
Nutricote	Agrivert	TOPLAM KARIŞIM 13-13-13 T100	yavaş salınan gübre
Büyüme odası E15	Kontrollü Ortamlar Limited	20207	bitki kültürü
Tris tabanı	Fisher Scientific	BP152-500	eksize edilmiş yapraklar için tampon
HCl (konsantre)	Fisher Scientific	A144500	pH'ını ayarlar
	Sigma-Aldrich	M0404	eksize edilmiş yaprakların inkübasyonu
Metanol	Fisher Scientific	A452-4	inkübasyon sonrası yaprak yıkama
Aseton	Sigma-Aldrich	179124	bitki ekstraksiyonları
Asetonitril (HPLC sınıfı)	Macron İnce Kimyasallar	MKH07610	HPLC mobil faz
Formik asit	Mallinckrodt Analitik	MK259205	asitleştirici mobil faz pH
Mikro santrifüj	Eppendorf	5417R	1.5 veya 2.0 ml tüpler
Santrifüj (sıcaklık kontrollü)	Eppendorf	5810R	15 veya 50 ml tüpler
Polipropilen santrifüj tüpü	Corning Inc.	430790	15 ml, steril
Döner buharlaştırıcı	BÜ CHI	R200	konsantre bitki örnekleri
Sıvı sintilasyon spektrometrisi (LSS)	Packard Instruments	104470	14C miktarını belirler
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi	Perkin Elmer	N2910401	herbisit metabolitlerini çözer
Akış sintilasyon analizörü ve nbsp;		14C
Hypersil Gold C18 sütununun HPLC	Termo-Bilimsel	03-050-522	Ters faz
Ultima-Flo M kokteyli	Akış sintilasyon analizörü için	Perkin Elmer	6013579
Sintilasyon Kokteyli (ScintiVerse BD)	Fisher Scientific	SX18	; biyolojik olarak parçalanabilen
Laboratuvar homojenizatörü	Kinematica	CH-6010	Yaprak örneklerini homojenize edin

Bitki tampon Murashige ve Skoog (MS) tuzlarının analizi için LabLogic System 1103303LSS için