Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

Summary

Bu protokol, Rac1 dahil olmak üzere Rho ailesi GTPazları için bağlayıcı ortakların göreli afinitelerini karşılaştırır. İn vivo, Rac1 bağlayıcı proteinler, konformasyonu bağlı bir nükleotid tarafından belirlenen tek bir bağlanma arayüzü için rekabet eder. Nükleotid, yüksek hidroliz hızı nedeniyle hem önemlidir hem de deneysel olarak kontrol edilmesi zordur.

Abstract

Bu protokolde, GTPaz bağlayıcı proteinler arasındaki rekabeti karşılaştırmak için bir yöntem gösteriyoruz. Böyle bir yaklaşım, GTPazların bağlanma yeteneklerini belirlemek için iki nedenden dolayı önemlidir: Tüm etkileşimlerin GTPazların aynı yüzünü içermesi, bağlanma olaylarının rakipler bağlamında dikkate alınması gerektiği anlamına gelir ve bağlı nükleotidin de kontrol edilmesi gerektiği gerçeği, immünopresipitasyon gibi geleneksel yaklaşımların GTPaz biyokimyası için uygun olmadığı anlamına gelir. Tahlil, saflaştırılmış proteinlerin kullanımına dayanır. Boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilen saflaştırılmış Rac1, yem proteini olarak kullanılır ve araştırılacak sinyalleme aşamasının kontrol edilebilmesi için GTP'nin hidrolize edilemeyen veya sol nükleotid içermeyen bir versiyonu olan GDP ile yüklenebilir. İncelenecek bağlayıcı proteinler, bir GFP etiketi vasıtasıyla doğru katlanmaya izin vermek için memeli hücrelerinden saflaştırılır. Her iki proteinde de aynı etiketin kullanılması önemlidir, çünkü sadece hızlı saflaştırma ve elüsyona izin vermekle kalmaz, aynı zamanda elüsyon sırasında aynı antikora sahip her iki rakibin de tespit edilmesine izin verir. Bu, iki bağlı proteinin nispi miktarlarının doğru bir şekilde belirlenebileceği anlamına gelir.

Introduction

Memeli hücrelerinin şeklini, polaritesini ve göç özelliklerini belirleyen aktin hücre iskeleti, küçük GTPazların Rho ailesi tarafından düzenlenir. Rho ailesi GTPazları, hücre iskeleti kasılmasını uyaran RhoA, aktin dallanmasını ve membran çıkıntısını uyaran Rac1 ve aktin polimerizasyonu üzerinde Rac1'e benzer etkilere sahip olan ve filopodia ^1,2 oluşumuna neden olan Cdc42'yi içerir. GTPaz sinyal aktivitesi, hem düzenleyiciler hem de efektörler ile protein-protein etkileşimlerine aracılık eden anahtar I ve anahtar II döngülerinin kasılmasını ve gevşemesini kontrol eden bir nükleotidin bağlanmasıyla belirlenir. Guanozin 5'-trifosfat (GTP) bağlı GTPazlar, aşağı akış efektörlerini aktive ederken, Guanozin 5'-difosfat (GDP) bağlı form aktif değildir. Hücrede, GTP hidrolizi ve nükleotid değişimi döngüleri, hücre iskeleti dinamikleri için gerekli olan GTPaz sinyallerinin hızlı bir şekilde devredilmesine izin verir. Nükleotid dönüşümü üç mekanizma tarafından düzenlenir. Guanin nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler), nükleotid içermeyen GTPazı stabilize eder, GTP için GSYİH değişimini katalize eder ve böylece GTPaz sinyal aktivitesini uyarır ^3,4. GTPaz aktive edici proteinler (GAP'ler), GTP'nin GSYİH'ya hidrolizini katalize eder, böylece GTPaz sinyal aktivitesini inhibe eder ⁵. Kromatin yoğunlaşması 2 (RCC2) düzenleyicisi ve guanin nükleotid ayrışma inhibitörleri (GDI'ler) gibi kenetleyici moleküller, anahtar döngülerini gizler ve GDI'lar söz konusu olduğunda, prenil kuyruğu ^6,7 ile etkileşime girerek GTPazı zardan uzaklaştırır. Üç düzenleyici molekül sınıfının her biri, aşağı akış efektörleri ve coronin-1C ⁷ gibi bazı kaçakçılık düzenleyicileri gibi anahtar döngüleri ile etkileşime girer. Bu protokolün amacı, varsayılan düzenleyiciler ve aşağı akış sinyal molekülleri arasındaki anahtar I/II bağlanma bölgesi için rekabeti ölçmektir. Rekabet tahlillerinin, paylaşılan bir bağlanma bölgesine bağlanmayı test ettiğine dikkat edilmelidir, bu nedenle bu protokol, GDI'ların prenil kuyruğuna bağlanması gibi diğer sitelerle etkileşimleri test etmek için uygun değildir.

Aktif ve inaktif formlar arasındaki konformasyon farklılıklarının inceliği, bağlı nükleotidin kararsız doğası ile birleştiğinde, GTPaz bağlanma olaylarının incelenmesini zorlaştırmıştır. Bağlı nükleotidin rolü, immünopresipitasyon veya yüzey plazmon rezonansı gibi geleneksel bağlanma testlerinin, nükleotid kontrol edilemediği için araştırma için pek uygun olmadığı anlamına gelir. Bu engel, GEF'lerin, GAP'lerin, efektörlerin, kenetleme moleküllerinin ve kaçakçılık moleküllerinin bağlanma bölgelerindeki örtüşme ile birleşir ve bu da hücrede meydana gelecek rekabet bağlamında tek bir etkileşim için bağlanma verilerinin yorumlanmasını zorlaştırır. Özellikle immünopresipitasyon, bağlayıcı ortaklar arasındaki rekabetten ödün verir, çünkü belirli hücresel koşullar altında, bir bağlayıcı ortak diğerlerinin pahasına tanımlanabilirken, diğer koşullar altında başka bir ortak baskın olabilir. GTPase sinyallemesinin dinamik doğası, GTPase işlevi için esastır ve farklı düzenleyicilerin bağlanma etkileşimleri arasındaki ilişkileri analiz ederken dikkate alınmalıdır. Gerçekten de, yakın zamanda büyük ölçüde rekabetçi bağlamaya dayanan bir yol tanımladık. Coronin-1C'yi, GDP-Rac1 ^7'nin anahtar döngülerine bağlanan bir kaçakçılık molekülü olarak tanımladık. GEF faaliyetinin düşük olduğu alanlarda, insan ticareti baskın olacak ve Rac1'i bu bölgelerden kaldıracaktır. Bununla birlikte, Rac1, GEF aktivitesinin yüksek olduğu hücre bölgelerine verildiğinde, GEF, koronin-1C'yi geride bırakacak, böylece hem Rac1'i aktive edecek hem de Rac1'in bu bölgeden koronin-1C aracılı olarak çıkarılmasını önleyecektir. Model daha da ileri gidiyor, çünkü GEF borsalarının eylemi GSYİH'yı GTP'ye bağlıyor ve dengeyi koronin-1C'den daha da uzaklaştırıyor. Sonuç olarak, Rac1 aktivitesi tamamen rekabet ve göreceli yakınlık açısından açıklanabilir.

Bu protokolde, örnek olarak Rac1'i kullanarak, küçük GTPazlar için farklı bağlama ortaklarının göreli afinitelerini karşılaştırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Saflaştırılmış bir protein yaklaşımı kullanarak, bağlı nükleotidin yakından kontrol edilebildiği bir deneyde, çift yönlü karşılaştırma yoluyla bir sinyal olayları zincirini bir araya getirmek mümkündür.

Protocol

GST etiketli GTPaz 1. Saflaştırma

1. Kültür, bir E. örneğin 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de pGEX-Rac1 O / N ile transforme BL21 gibi E. coli soyundan, autoinduction ortam 500 ml (25 mM _Na-2 HPO _4, 25 mM KH ₂ PO _4, 50 mM _NH4CI, 5 SO ₄ mM Na _2, 2 mM MgSO _4, 2 _mM CaCl2,% 0.5 gliserol,% 0.05 Glukoz,% 0.2 laktoz, 5 g tripton, 2.5 g maya ekstresi, 100 ug / ml Ampisilin).
2. 10.000 x g'de, 4 ° C'de 10 dakika için santrifüjleme ile hasat bakteri.
3. 20 ml protein ekstre edici reaktif, 1 x proteaz inhibitörü bakteriyel pelet yeniden süspanse edin ve inversiyon ile oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
4. 30 dakika boyunca 40.000 x g'de santrifüjleme ile lizat açıklığa kavuşturulması.
5. Fosfat tamponlu tuz ile yıkandı, 2 ml glutasyon manyetik boncuklar, ekleme (PBS: 10 mM _Na-2 HPO _4, 1.8 mM KH ₂ PO _4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI).
6. 4 ° C'de ters çevirme ile karıştırılması, 2 saat süre ile inkübe edilir.
7. Her adımda boncuk çökelmesi için bir manyetik parçacık ayırıcıyla, 10 mi, PBS ile protein yüklü boncuk dört kez yıkayın.
8. Gerekli olana kadar yeniden süspanse 100 ul alikotları -80 ° C 'de 2 ml PBS içinde boncuk ve mağaza protein yüklü.

GTPaz bağlama proteinlerinin ekspresyonu 2.

1. Şöyle gün önce deney, yeşil flüoresan proteini (GFP) kodlayan transfekte plazmidler HEK293T ayrı bir 75-cm ² şişe içine, her GTPaz bağlayıcı proteinin sürümlerini etiketli. Nükleotid yükleme doğrulama için, transfect HEK293T üçüncü 75 cm ² balona TrioD1 GFP etiketli.
   1. 100 ul içinde 1 mg / ml steril 150 mM NaCl polyethylamine seyreltin.
   2. 223 ul azaltılmış serum medya 27 ul seyreltilmiş polyethylamine ekleyin.
   3. 250 ul düşük serum ortamı 12 ug plazmit DNA ekleyin.
   4. Oda sıcaklığında 2 dakika için her bir tüp inkübe edin.
   5. Polyethylamine birleştirin ve DNA 2 dakika boyunca tek bir tüp ve vorteks karıştırır.
   6. Oda sıcaklığında 15-20 dakika kuluçkalayın.
   7. 5 ml taze büyütme ortamı ile% 90 konfluent HEK293T üzerindeki büyüme ortamı (Dulbecco Modified Eagle Ortam,% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, antibiyotikler herhangi bir) değiştirin.
   8. Şişeye Birleştirilen polyethylamine / DNA karışımı ekleyin ve 37 ° _C'de,% 5 CO2 O / N inkübe edin.

GTPaz bağlama proteinlerinin saflaştırılması 3.

1. PBS içinde transfekte edilmiş hücrelerin şişeler durulayın ve serbest sıvı aspire, 5 dakika boyunca balon boşaltın.
2. 500 ul liziz tamponu içinde hücrelerini Scrape (50 mM Tris-HCl (pH 7.8),% 1 Nonidet P-40, 1 x proteaz inhibitörü) mikrofüj tüpüne.
3. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de ters çevirme ile karıştırılarak Hücreleri,.
4. Liziz sırasında yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 2700 x g'de 40 ul GFP-Trap boncuklar iki çok taze lizis tamponu ile üç kez, çöktürülmesi, boncuk yıkama.
5. 10 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüjleme ile lizatları açıklığa kavuşturulması.
6. Aktarım 4 ° C de ters çevirme ile karıştırılması, yıkandı, GFP-trap boncuk ayrılması ve GFP-füzyon proteinleri, 2 saat boyunca bağlamasına izin vermek için rakip proteinin her birinin lizat açıklık. Buz üzerinde GFP-TrioD1 hücrelerinden lizat tutun.
7. 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 mM NaCI içinde iki kez yüklü GFP-Trap boncuk yıkayın,% 0.7 (w / v) Nonidet P-40 ve iki kez de 50 mM Tris-HCI (pH 7.6) içinde, 20 _mM MgCl2 , yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 2700 x g'de boncuk çökeltildi.
8. 40 ul 0.2 M glisin (pH 2.5) ilave etmek ve 30 saniye süreyle aşağı ve yukarı pipetlenerek GFP füzyon proteinlerini Zehir. 4 ul 1 M Tris-HCl (pH 10.4) içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne 21.000 60 s için xg ve transfer sıvısının hemen tortu boncuklar. Saflaştırılmış protein zarar sınırlamak için hızla yapın.
9. Kantitatif Blott kullanarak göreceli verim kurmak için, bir anti-GFP antikor ile Western blot ve sonda her bir saflaştırılmış protein 1 ul analizüreticinin protokolüne uygun olarak sistemi olarak konumlandırılır. Seçenek olarak ise, bisinkoninik asit (BCA) deneyi ile protein konsantrasyonlarını belirlemek ancak proteinler, özdeş bir tarzda tahlil ile reaksiyona girmeyen ya da kirletici proteinler vardır, bu hatalar ortaya çıkarır.
10. 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 20 mM _MgCl2 ilave edilerek mol protein konsantrasyonu dengeleyin.

GTPaz 4. nükleotid yükleme

1. Aşama 1 'de hazırlanan GST-Rac1 manyetik boncuk, bir kısım çözülme.
2. Her adımda boncuk çökelmesi için bir manyetik parçacık ayırıcıyla GST-Rac1 boncuk 90 ul alın ve 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCI, 0.1 mM DTT, 4 mM EDTA ile üç kez yıkayın.
3. Aspire boncuklardan tamponu ve 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCI, 0.1 mM DTT, 4 mM EDTA ekleyin.
4. GDP, GTP veya nükleotid yükleme rekabet deneyinde için gerekli olup olmadığını göre, 12 ul 100 mM GDP, 12 ul 10 mM gu eklemeanosine 5 '- [γ-tiyo] trifosfat (GTP yS) ya da 60 ul GST-Rac1 boncuklar için bir nükleotid.
5. Nükleotid yükleme kontrolleri, üç 10-ul kısma kalan boncuk bölünmüş ve 2 ul 100 mM GSYİH, 2 ul 10 mM GTPtS veya her tüpe hiçbir nükleotid ekleyin.
6. Çalkalama ile 30 ° C 'de 30 dakika boyunca damla karışımları inkübe edin.
7. Deney karışımı 3 ul (aşama 4,4), kontrol karışımları (adım 4.5) her bir 0.5 ul: 1 M _MgCl2 ilave edilerek nükleotid bağlı Rac1 stabilize.

Bağlama 5. Rekabet.

1. 6 mikrofüj tüpleri kurmak, her biri:
   200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 _mM MgCl2
   (Aşama 4,7), 10 ul deney nükleotid yüklü Rac1 boncuklar
   5 ul Rac1 bağlayıcı protein A (sabit bağlayıcı protein)
2. Her bir tüpe, 0, 1, 2.5, 5, 10 veya 20 ul Rac1 bağlayıcı protein B (değişken bağlayıcı protein) ekleyin. Bu birimler bir varsayıyorumpproximately eşit hisse sabit ve değişken bağlama proteinleri konsantrasyonları ve ayarlanması gerekebilir.
   1. Orada iki proteinin bağlama yakınlıkları büyük farklılıklar vardır ve bu deneysel tekrarlar yoluyla ampirik olarak tespit edilmelidir eğer bağlayıcı proteinler A hacimleri ve B ayarlayın. 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 20 mM _MgCl2 ilave edilerek 235 ul bağlanma karışımın toplam hacmini hazırlayın.
3. Içeren bir mikrofuge'de tüp ayarlayın:
   200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 _mM MgCl2
   (Aşama 4,7), 10 ul deney nükleotid yüklü Rac1 boncuklar
   10 ul Rac1 bağlayıcı protein A (sabit bağlayıcı protein)
4. GSYİH, GTPtS ve hiçbir nükleotid kontrol tüpleri ayarlayın:
   200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 _mM MgCl2
   10 ul kontrol Rac1 boncuk GSYİH, GTPtS veya nükleotid ile adım 4.5 yüklü ve adım 4.7 stabilize.
   180 ul HAşama 3.6 gibi hazırlanmıştır EK293T GFP-TrioD1 lizatı,
   4 ul 1 M _MgCI2
5. 4 ° C'de ters çevirme ile karıştırılması, 2 saat süre ile inkübe karışımı.
6. 50 mM Tris-HCI (pH 7.6), 20 mM _MgCl2 ile boncuk üç kez yıkayın.
7. Elute indirgeyici örnek tamponu 20 ul bağlı proteinleri (50 mM Tris-HCI (pH 7),% 5 SDS,% 20 gliserol, 0.02 mg / ml bromofenol mavi,% 5 β-merkaptoetanol).

Yarışmanın 6. Analizi

1. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Western blot ile bağlı protein (aşama 5,6) 10 ul giderin.
2. 4 ° CO de membran inkübe / N anti-GFP antikorda Bloklama Tamponu içinde 1/1000 oranında seyreltilmiş PBS'de 1x seyreltilmiş,% 0.1 Tween-20 isim levhası GTPaz bağlama proteinlerinin her ikisi de tespit etmek.
3. PBS ile 10 dakika,% 0.1 Tween-20, membran üç kez yıkayın.
4. 800 konjuge edilmiş anti-tavşan sek DyLight içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca zarın inkübesekonder antikor Bloklama Tamponunda 1 / 10,000 seyreltilen,% 0.1 Tween-20, PBS içinde 1 x seyreltilmiştir.
5. PBS ile 10 dakika,% 0.1 Tween-20, membran üç kez yıkayın.
6. Üreticinin protokolüne göre, bant yoğunluğu ölçmek için yazılımını kullanarak, kızılötesi görüntüleme sistemi kullanılarak zar tarama.
7. Değişken rakip (Protein B) birim karşı her proteinin bant yoğunluğunu çiziniz.
8. Çizgiler, denge elde edildiği rakip oranının saptanması için sabit bir rakip (Protein A, 5 ul) hacimce kesiştiği noktada değişken yarışmacının hacmi bölün.
9. Adımda 6,1-6,6 tarif edildiği gibi p21-aktive edilmiş kinaz 1 (PAK1) (bir efektör) ve GFP-TrioD1 (GEF), nükleotid yükleme durumu, prob membran geçerli olabilmesi için.

Results

Bu protokol, rakip hassas konsantrasyonunu bilinmesi gereken (Şekil 1) olmadan Rac1 için bağlayıcı ortaklar nispi afiniteler hesaplamak için tasarlanmıştır. Protein konsantrasyonunun saptanması hatalar oluşturan bir sinyal yolunun, moleküller arasındaki rekabeti söz konusu olduğunda gerekli değildir. Ancak, iki yarışmacı tahlil farklı hacimleri eklerken basit oranları hesaplandı izin vermek için stok solüsyonları aynı molar konsantrasyona sahip olduğunu bilmek önemlidir. GFP-Trap boncuk 40 ul 300 pmol yani birleşik 75 cm yüksek iki farklı bağlama proteinleri preparatları düzenlenmesinden önce benzer olacaktır ve bunun sonucunda, boncuk doyuracak olan ifade eden hücrelerin ² şişeler ~ bir bağlama kapasitesine sahip (Şekil 2A). Proteinlerin bir zor ifade ederse, bu sorun, hücrelerin birden çok şişeden bu proteinin saflaştırılması ile aşılabilir.

8 (Şekil 2B) ile tespit edilebilir. Geçiş durumunu stabilize etmek GTPaz ücretsiz nükleotid tercihen bağlamak GEFS. GEFS genellikle inaktif düşük bolluk, vardır ve sık sık kötü leke gibi, deney nükleotid serbest GTPaz bir GEF veya GEF fragmanı aşın daha iyidir. Biz sık sık Trio'nun ilk İKO benzerlik kullanmak, bir GFP füzyon (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (Şekil 2B) olarak ifade ancak herhangi GEF çalışmaya devam eder. GSYİH yüklü GTPaz bağlanan proteinler nadirdir. Bindi basitçe valide edilebilir böyle bir protein ^{7 veya} GSYİH yükleme gibi Biz son zamanlarda RCC2 bildirdiNe GEF'ten de efektör ng.

Deney çıkış GTPaz bağlanan iki GFP etiketli bağlama partnerleri gösteren bir Western blot olacaktır. Her iki proteini tespit etmek için, tek bir antikor kullanarak, her iki rakip içindeki miktarlarda bağlanan hangi konsantrasyonları belirlenebilir ve bu nedenle göreceli afıniteleri anlaşılmaktadır. Rac1 kaçakçılığı protein pervane etki alanı arasındaki bu örnek yarışmada, Koronin-1C (protein A Rac1-bağlama) ve Rac1-ayırıcı protein, RCC2 (protein B Rac1-bağlama), (Şekil 3A) gösterilmiştir. Koronin-1C pervane (5 ul) sabit bir hacim kullanılarak ve RCC2 artan miktarlarda ekleyerek, RCC2 güçlü olduğunu gösteren, GFP arasından bu denge RCC2 (yıldız) 1,25-2,5 ul ulaşılır leke görebilir Koronin-1C daha Rac1 için afinite. Her competito için ortalama değerler kantitatif Batı lekelenmesi kullanılarak bantların yoğunluğunu ölçen ve komplo iler, denge noktası hacimleri hangi eğrileri (Şekil 3B) kesişir belirleyerek doğru hesaplanabilir.

Bağlanma eşleri birbirine olarak Rac1 bağlanma ile bağlanması halinde başarılı bir rekabet deneyinde mümkün engellerden biri. Şekil 3A + B biz oldukça tam uzunlukta Koronin-1C daha RCC2 ve Koronin-1C pervane etki alanı arasındaki rekabeti, gösterir. Kesik Koronin kullanılmasının nedeni Koronin-1C, aynı zamanda kuyruk alanı üzerinden RCC2 bağlanması anlamına gelir. Tam uzunlukta Koronin-1C RCC2 karşı titre edildiğinde, her iki proteinin bağlanması nedeniyle üçlü kompleks oluşumu yerine rekabet (Şekil 3C) için tespit edilir. Yarışma oluşup ise, bir proteininin diğer düşüşler olurken artacak ve toplam bağlı GFP-füzyon sabit kalacaktır. Durumlarda üçlü bir kompleksi, GTPaz bağlayıcı proteinin bir kesecek için gerekli olan formları burada böylece competitors artık etkileşim.

Şekil 1. İş Akışı. Yarışma analizleri kullanılarak GTPaz-bağlayıcı proteinlerin afinite belirlemek için iş akışı şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Saflaştırılmış proteinlerin Şekil 2. Doğrulama. (A) saflaştınldı GFP etiketli iki proteinin nispi verimi belirlemek için, anti-GFP ile sondalama Western blot ile analiz bağlayıcı proteinlerin Rac1. Deney sırasında dengeleme Bu tür da bağlanma deneyinde eşleşecek şekilde iki protein konsantrasyonu ayarlanmasına olanak tanır. (B) GDP, GTPtS ve hiçbir nükleotid yüklü GST-Rac1 endojen PAK1 veya aşırı GFP-TrioD1 için komplo tespit proteinleri GFP-TrioD1 ifade HEK293T gelen lizat ile inkübe ve bağlıydı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Görece protein Şekil 3. Western Blot analizi ile yapışma. Örnek çıktıları yarışması bağlayıcı tahlillerinden. (A) Rac1 5 ul GFP Koronin-1C pervaneli alanı ile karıştırılmış ve titre edildi GFP-RCC2, gittikçe artan miktarlarda edildi GDP-yüklendi. Tarafından GFP için Western blotting bağlanmış proteinler, iki proteinin diferansiyel tayinle belirlenmesine ile ilgili sorunlar önlenir ve GFP sinyali iki füzyon proteinleri arasındaki molar oranı bildirir. Yıldız eithe rekabet oranlarını gösterirdenge noktasının r tarafında. (B), üç bağımsız deneyin ilişkili bağlantı GFP füzyon proteinlerinin Bant yoğunlukları, dengeye ulaşmak için gerekli olan fluorofor-konjuge sekonder antikor ve ortalamalar RCC2 miktarını hesaplamak için çizilen kullanılarak niceliksel Western blot ile ölçüldü. (Cı Rac1 bağlayıcı proteinler rekabet etmek yerine birbirine bağlanan ve üçlü bir kompleks oluşturur bir deney) Örnek çıktı. GDP-yüklü Rac1 5 ul GFP RCC2 ile karıştırıldı ve GFP-Koronin-1C tam boyda, gittikçe artan miktarlarda edildi titre edilmiştir. Bağlanmış GFP Koronin-1C'de artış bağlanmış GFP RCC2 kaybı olmadan üçlü kompleks oluşumunu gösterir. Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, küçük GTPaz bağlayıcı protein çiftlerinin nispi afinitelerini karşılaştırmak için bir yöntemi açıklar. Anahtar adımlar, saflaştırılmış GTPaz bağlayıcı proteinlerin hazırlanması ve GTPazın nükleotid yüklenmesidir. Aynı GFP etiketine sahip GTPaz bağlayıcı proteinlerin kullanılması, her bir rakibin benzer miktarlarının bağlandığı konsantrasyonların doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar. Rekombinant nükleotid yüklü GTPaz'ın kullanımı, belirli aktivite koşulları altında GTPaz'ın bağlanma özelliklerinin sorgulanmasına izin verir. Bu adım aynı zamanda en hassas olanıdır, çünkü magnezyum koşulları tam olarak korunmazsa nükleotidler hem hidrolize olur hem de GTPaz'dan ayrılır.

Hücrede, hızlı nükleotid döngüsü ile birlikte çok sayıda GTPaz bağlayıcı protein, bu tür yolların yorumlanmasını zorlaştırır. Bu yöntemin yalnızca bağlayıcı protein çiftlerini karşılaştırmadaki ve dikkatle kontrol edilen nükleotid yükleme koşullarını kullanmadaki basitliği, sinyal yollarının aydınlatılmasına izin verir. Bununla birlikte, protokolün en büyük gücü, in vivo durumun basitleştirilmesi olduğu için aynı zamanda en büyük zayıflığıdır. Rekabet tahlilleri, sağlam bir hipotez oluşturmak için kullanılabilir, ancak bu daha sonra hücrelerde yıkım deneyleri ile test edilmelidir.

Deneyde kullanılacak GFP etiketli GTPaz bağlayıcı proteinleri seçerken dikkate alınması gereken üç özellik vardır. İlk olarak, füzyon proteinleri, HEK293T gibi memeli hücrelerinde iyi eksprese edilmelidir, çünkü rekabet tahlilleri makul miktarda protein gerektirir. İkincisi, rekombinant proteini önemli bir bozulma olmadan saflaştırmak mümkün olmalı ve bunun mümkün olmadığı durumlarda, bir GTPaz bağlayıcı fragmanın klonlanması düşünülmelidir. Üçüncüsü, iki GTPaz bağlayıcı protein, bölüm 6'da analize izin vermek için SDS-PAGE üzerinde birbirinden çözülmelidir.

Deneyde dikkate alınması ve muhtemelen ele alınması gereken bir dizi potansiyel uyarı vardır:

Asit elüsyon adımı sırasında saflaştırılmış GTPaz bağlayıcı proteinlerin olası denatürasyonu veya GFP etiketi tarafından sterik engel. Bizim elimizde bunlar bir sorun olmadı, ancak test edilmesi gerekiyor. Saflaştırılmış proteinler, fonksiyonel tahlillerde ¹⁰ test edilebilir. Artık izotop etiketli nükleotidlere ihtiyaç duymadan GEF'lerin veya GAP'lerin aktivitesini test etmek için ticari kitler mevcuttur. Sekestre edici proteinler, doğaları gereği GTPazları GEF veya GAP aktivitesinden korur, bu nedenle son yayınımızda ⁷ yaptığımız gibi ticari GEF veya GAP deneylerinde rekabetçi inhibitörler olarak kullanılabilir. GTPaz'ı trafiğe çıkaran proteinlerin ilgili özelliği, GTPaz'ı bağlama kapasitesidir ve bu, aşağı çekmeli bir tahlilde kolayca test edilebilir. Tüm bağlayıcı proteinler için geçerli olan protein bütünlüğünü test etmek için alternatif bir yaklaşım, GFP-tuzak boncuklarından ayrıştırılan proteini, enzimatik bölünme ile GFP-tuzak boncuklarından çıkarılan aynı protein ile glisin ile titre etmektir. Deney, hem GFP etiketli hem de parçalanmış proteinin, proteinin kendisine karşı bir antikorla araştırılmasıyla analiz edilecektir. Protein elüsyondan zarar görmemişse, denge 1:1 oranında sağlanmalıdır. Bu yaklaşım aynı zamanda, GFP etiketinin varlığının aday proteinin bağlanma özelliklerini tehlikeye atıp atmadığını da gösterecektir, ancak bu, etiket ile bağlayıcı protein arasında enzimatik bir bölünme bölgesine sahip bir yapının üretilmesini gerektirir. Protein, etiket veya elüsyon adımı tarafından tehlikeye atılmış olsun, sorun, alternatif bir saflaştırma yöntemi kullanmak için protokolü değiştirerek çözülebilir. GFP yerine, bağlayıcı proteinler His etiketli olabilir, Ni-NTA kullanılarak saflaştırılabilir ve His-etiketine karşı bir antikor kullanılarak analiz edilebilir. Önemli özellik, her iki bağlayıcı proteinin de ortak bir etiketi paylaşması gerektiğidir, ancak gerekirse bir proteine biri saflaştırma ve diğeri tespit için olmak üzere iki etiket eklenebilir.

Protokol, anahtar I/II alanlarıyla etkileşimler arasındaki rekabeti araştırmak için tasarlanmıştır. GTPaz etkileşimlerinin çoğuna bu motif aracılık etse de, bazı istisnalar vardır, en önemlisi prenil kuyruğuna bağlanan ve ayrıca anahtar alanlarını gizleyen GDI'ların etkileşimleri. Prensip olarak, protokol, memeli hücrelerinden saflaştırılmış GTPaz'ı kullanacak şekilde uyarlanabilir, böylece GTPaz prenile edilir, ancak çoklu bağlanma bölgelerinin veya allosterik etkilerin varlığı, rekabet bağlama verilerinin yorumlanmasını zorlaştırır. Böyle bir modifikasyonla ilişkili diğer problemler, GDI'lerin memeli hücrelerinden GTPaz ile birlikte saflaştırılması, izole edilmiş proteinlerin saflığından ve prenil gruplarının hidrofobik doğasından ödün vermesi, prenile edilmiş GTPazların GDI veya lipid membran ile ilişkili olduğu anlamına gelir ve bu tür faktörlerin deneyde dikkate alınması gerekir.

Testte kullanılan GST-Rac1 miktarı. Sabit GTPaz bağlayıcı protein, Rac1'den daha yüksek bir konsantrasyonda olmalıdır, aksi takdirde rakip eklendiğinde, basitçe serbest Rac1'e bağlanacaktır. Bunun, sabit protein kaybı olmadan rakibin bağlanması, Şekil 3B'de gösterildiği gibi iki rakip proteinin birbirine bağlanmasıyla hemen aynı şekilde tespit edileceği için gerçekleşip gerçekleşmediği hemen anlaşılacaktır. Ek bir kontrol olarak (Adım 5.3), iki kat sabit bağlayıcı protein içeren ve değişken bağlayıcı protein içermeyen bir bağlanma reaksiyonu dahil edilmelidir (Adım 5.3). Titrasyon deneyindeki Rac1 doymuşsa, sabit bağlayıcı protein miktarının iki katına çıkarılmasının çıktı üzerinde hiçbir etkisi olmayacaktır. Protokolde önerilen hacimler uygun olmalıdır, ancak Rac1 miktarı kolayca azaltılabilir. Sabit bağlanma ortağını kaybetmeden rakibin bağlanması gözlemlenirse, üçlü kompleks oluşumunu önlemek için bağlanma bölgelerini haritalamaya çalışmadan önce Rac1 miktarının azaltılması denenmelidir.

GTPaz bağlayıcı proteinlerin GST veya boncuk ile ve ayrıca spesifik olarak Rac1 ile spesifik olmayan etkileşimi. Bu sorun, değişken GTPaz bağlayıcı protein yüksek konsantrasyonda bir platoya ulaştığında bile, sabit GTPaz bağlayıcı proteinin artık bağlanması ile kendini gösterecektir. Bu sorunun tanımlanmasına, sabit ve değişken GTPaz bağlayıcı proteinlerin değiştirildiği karşılıklı deneyler yapılarak yardımcı olunacaktır. Karşılıklı deneyler aynı zamanda denge noktası tahmininin doğruluğunu da büyük ölçüde artıracaktır, bu nedenle her zaman dahil edilmelidir. Spesifik olmayan bağlanma durumlarında, dengenin sağlandığı nispi konsantrasyonlar, her protein için maksimum ve minimum arasındaki bant yoğunluğunu karşılaştırarak veya GST-Rac1 yerine yem olarak GST boncukları kullanılarak spesifik olmayan bağlanmanın kapsamı ölçülerek hesaplanabilir.

Bu protokolde açıklanan rekabet tahlilini tamamlamak için farklı nükleotid yükleme koşulları kullanan aşağı çekme tahlilleri kullanılmalıdır. Ortakların nükleotid tercihini belirlemek, hem yarışma olaylarını anlamak hem de GTPaz bağlayıcı proteinin dahil olduğu sinyal yolunu anlamak için önemlidir. Şekil 2B'de , nükleotid yüklemesini doğrulamanın bir yolu olarak GTP yüklü veya nükleotidsiz GTPaz için belirlenmiş tercihe sahip proteinlerin bağlanmasını analiz ediyoruz. Bununla birlikte, nükleotid yüklemesinin rakiplerin her biri üzerindeki etkisini de araştırmak mantıklıdır. Varsayımsal rakipler farklı tercihler gösterirse, rekabet sinyal yoluna daha az katkıda bulunacaktır ve gerçekten de nükleotid devri, bağlayıcı proteinlerin değişimini yönlendiren mekanizma olabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Böcek avcısı	Novagen	70584-3
TAM proteaz inhibitörü	Roche	05 056 489 001
Glutatyon manyetik boncuklar	Pierce	88821
Polietilenim, dallı, ortalama Mw ~25.000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Yaşam Teknolojileri	31985-047
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Sığır Serumu	Yaşam Teknolojileri	10270-1-6
L-Glutamin	Yaşam Teknolojileri	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Son derece kararsız. Aliquot ve yeniden yapılanma GTP & gamma hemen sonra -80'de saklayın
; S	Sigma Aldrich	G8634	Son derece kararsız. Aliquot ve yeniden yapılanma üzerine hemen -80'de saklayın
Engelleme Tamponu	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antikoru	Canlı Renkler	632592	1/1000 seyreltmede kullanım
DyLight 800 konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikoru	Fisher Scientific	10733944
Anti-PAK1 antikoru	Hücre Sinyalizasyonu	2602S	1/1000 seyreltmede kullanım
Odyssey SA Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	Li-cor	9260-11PC