Yöntem makalesi

ALS SOD1-G93A Fare Modeli hastalığın ilerlemesine değerlendirilmesi için Hızlı Fenotipik Nörolojik Puanlama Sistemi

DOI:

10.3791/53257

⸱

6 Ekim 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1ALS Therapy Development Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video protokolü, amyotrofik lateral sklerozun transgenik fare modelindeki nöromüsküler eksiklikleri değerlendirmek için hassas, güvenilir ve hızlı bir yöntemi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SOD1-G93A transgenik fare, amyotrofik lateral sklerozun (ALS) en yaygın kullanılan hayvan modelidir. ALS TDI'da, SOD1-G93A farelerinin nöromüsküler fonksiyonunu hızlı bir şekilde güvenilir bir şekilde değerlendiren, buradaki videoda gösterilen fenotipik bir tarama protokolü geliştirdik. Bu protokol, arka bacak fonksiyonunu değerlendirmek için tasarlanmış basit bir nörolojik skorlama sistemini (NeuroScore) kapsar. NeuroScore, arka bacak fonksiyonuna odaklanır, çünkü arka bacak eksiklikleri SOD1-G93A farelerinde bildirilen en erken nörolojik hastalık belirtisidir. ALS TDI tarafından geliştirilen protokol, parezi başlangıcının (hafif veya kısmi felç), felcin ilerlemesi ve şiddetinin tarafsız bir değerlendirmesini sağlar ve hastalığın ilerlemesinde ilaca bağlı değişiklikleri tanımlayacak kadar hassastır. Bu raporda, ayrıntılı bir makalenin video ile kombinasyonu, puanlama belirsizliklerini ve deneyciler arası değişkenliği en aza indirgeyerek protokolün diğer laboratuvarlar tarafından benimsenmesine ve farklı ortamlarda gerçekleşen çalışmalar arasında karşılaştırmalara olanak tanır. Bu video protokolünün mevcut ve gelecekteki ALS araştırmacıları için mükemmel bir eğitim aracı olarak hizmet edebileceğine inanıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1990'ların ortalarında, kalkınma SOD1-G93A transgenik fare modeli Amyotrofik lateral skleroz (ALS) 1 en yaygın olarak kullanılan hayvan modeli olmuştur beri. Bu transjenik fare modeli, genetik olarak amino asit 93 (G93A) alanin mutasyona ALS ilişkili glisin barındıran insan Cu / Zn süperoksit dismutaz 1 (SOD1) geni, bir mutant formu aşın ifade etmek üzere geliştirilmiş. G93A mutasyonu topluca makyaj ailesel ALS vakalarının 2 yaklaşık beşte biri SOD1 genindeki mutasyonlar biridir.

SOD1-G93A modeli, bu nihai birlikte, bu tür motor nöron kaybı, ilerleyici kas güçsüzlüğü ve atrofi gibi insanlarda ALS patolojik özellikleri birçok özetlediği çünkü ALS onun bariz genetik bağlantıya ek olarak ALS ilaç geliştirme araştırma beygir haline gelmiştir felç ve ölüm 3. Genellikle transjenik hayvan modellerinde olduğu gibi olsa da, doğal bir iki oradaSOD1-G93A fareler ile bağlantılı rahatsızlık derecesinde değişkenliğin. Scott ve ark. En az 24 çöp eşleştirilmiş cinsiyet dengeli farelerin Kusaklara 4 biyolojik değişkenlik yarattığı gürültüyü aşmak için uyuşturucu etkinlik çalışması tasarımlarda gerekli olduğunu tespit ettik. Agresif hastalığın ilerlemesi ve günlük izleme ihtiyacı ile birlikte bu çalışmalarda gerekli hayvanların çok sayıda nöromusküler gücünü ve işlevini ölçmek için mükellef, zaman alıcı ve potansiyel stresli tekniklerin kullanılmasını yasaklayan (örneğin, elektromiyografi, kavrama kuvveti, rotorod , vs.). Bunun yerine, güvenilir hızlı bir şekilde SOD1-G93A farelerin kas fonksiyonunu değerlendirir in vivo tarama aracı ihtiyacını vurgulamaktadır.

ALS TDI bir protokol ortalama fare başına en az 30 sn SOD1-G93A farelerin kas fonksiyonlarının değerlendirilmesi güvenilir sağlar geliştirildi. Bu protokol, encompabasında ve video Bu raporda açıklanan basit bir nörolojik skorlama sistemi (NeuroScore) kullanarak hindlimb fonksiyonun günlük değerlendirmesini de kapsar. Hindlimb açıkları erken SOD1-G93A farelerin 5,6 hastalığın nörolojik belirtisi bildirdi çünkü NeuroScore hindlimb fonksiyonu odaklanmıştır. Dahası, ALS TDI tarafından geliştirilen protokol parezi (hafif veya kısmi felç), ilerlemesi ve felç şiddetinin başlangıç ​​tarafsız bir değerlendirme sağlar ve hastalığın ilerlemesinde ilaca bağlı değişiklikleri belirlemek için yeterli hassastır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler Hayvanların Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından açıklanan protokollere uygun olarak yürütülmektedir ve ALS TDI kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar, Konut ve Araştırma Tasarımı

Not:. SOD1-G93A fare koloni başlangıçta Gumey ve diğerleri 7 tarafından üretilen yüksek kopya B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur suşundan elde edilmiştir. Koloni şu anda vahşi tip C57BL / 6-SJL F1 dişilerle transgenik C57BL / 6-SJL erkek kapısı tarafından muhafaza ediliyor. F1 hayvanlar B6 dişilerle SJL erkek geçerek üretilir. Fareler yaş 35-45 günde ALS TDI haftalık sevk edilir.

  1. Farenin en az bir hafta bir çalışmaya vermeden önce (18-23 ° C ve% 40-60 nem arasındaki bir sıcaklıkta 12 saat ışık / karanlık döngüsü) hayvan tesisine alıştırıldı izin verir.
  2. Ev erkek SOD1-G93A mikrofongrup erkek savaşmak eğilimi ev sahipliği beri kafes başına e bir fare. Kafes başına iki adede kadar Evi dişi SOD1-G93A fareler. Plastik kulübe şeklinde çevresel zenginleştirme sağlar. Fareler su / gıda, içme ilaç yönetimini gerektiren bir çalışmanın parçası olmadıkça, yiyecek ve su ad libitum sağlayın. Bu gibi durumlarda, oranı ve kayıt gıda ve su.
  3. Yaş gününde 50 civarında bir ilaç etkinlik çalışmaya başlamak ve 64 çöp eşleştirilmiş cinsiyet dengeli fareler (kohort başına 32) içerir. Son olarak, çalışmalar yürüten araştırmacılar deneysel koşullara kör olduğundan emin olun.
    Not: Bu tipik bir ilaç etkinlik çalışması ancak önce ya da sonra çalışmaya başlamak için tercih olabilir terapötik müdahale türüne göre yaş gününde 50 başlar önerilir.
    Not: kohort başına 32 fare cinsiyete özgü ilaç etkilerini tespit etmek güç olan bir çalışma. Cinsiyete özgü karşılaştırmalar gerekiyorsa, kohort başına 24 fare, genel ilaç etkisini tespit etmek için yeterli olacaktır.

2. Vücut Ağırlığı

  1. Günlük gram onda biri bir hassasiyetle çalışmalarda tüm fareler için rekor vücut ağırlıkları. Not: Vücut ağırlığı hastalığın ilerlemesi ve kronik ilaç tedavisinin doğabilecek halsizlik hassas bir göstergesidir.
  2. Fare vücut ağırlıkları dolayısıyla, sabahları daha yüksek olması, bir gün süresince önemli ölçüde değişebilir, her gün aynı zamanda etrafında onları kaydedin.

3. Nörolojik Puanlama Sistemi (NeuroScore)

  1. Günlük olarak, aşağıdaki üç koşullar altında fare gözlemleyerek her bir fare için değerlendirilmesi nörolojik puanları (NS) bir sekans dahilinde gerçekleştirilebilir: b) fare) yürümeye bırakıldı ve parezi c başlamasından sonra a), fare kuyruk tarafından askıya Fare yan yerleştirilir.
    1. Kuyruk süspansiyon testi için, gıda havzası uzak, 1-2 sn evlerine kafes tel üstünden kuyruk tabanından fareyi yaklaşık 1.5 "tutun atıl ikenarka ayaklarında Erving. Süspansiyon testi 3 kez tekrarlayın ve en tutarlı sonucu kaydedin.
    2. Yürüme testi, bazı çekiş ve 25 cm yürüme mesafesi sağlayan temiz bir yüzeye üzerinde fare koyun (örn., Bir kağıt havlu kaymasını önlemek için aşağı bantlanmış). Onun yürüyüşü izlerken fare 75 cm toplam (kağıt havlu 3X uzunluğu) yürümek için izin verin.
    3. "Doğrulma refleksi" test için sol veya sağ tarafına fare koyun ve bir kronometreler her iki taraftan yardımsız kendini yukarı sağa süresini ölçmek kullanarak. Not: Bu testin sadece bir deneme gereklidir.
  2. 0'dan 4. Not bağımsız bir ölçekte (sol veya sağ) Her hindlimb of NS belirleyin: Sağ hindlimb NS 1 iken Örneğin 0 puan, 1, sol hindlimb NS 0 olduğunu gösterir.
  3. (Tablo 1'de verilmiştir özet) gözlem aşağıdaki kümesine karşılık gelen nörolojik puanları (0-4) atayın:
    1. Aşağıdaki gözlenmesi halinde NS 0 (Ön-semptomatik) atayın: fare kuyruğu tarafından askıya alındığında, hindlimb normal yayvan yani sunar, tam uzakta yanal orta hatta uzanan ve 2 saniye bu pozisyonda kalır veya uzun. Fare yürümeye izin, normal yürüyüş görülmektedir.
    2. Fare kuyruğu tarafından askıya alındığında, hindlimb anormal yayvan, yani sunar, bu çökmüş veya kısmen yanal orta hatta doğru çöktü YA o kuyruk süspansiyon sırasında titreyen VEYA o geri çekilir edilir: gözlenmektedir aşağıdaki eğer NS 1 (İlk semptomlar) atama / sıktı. Fare yürümeye izin verildiğinde normal VEYA biraz yavaş yürüme görülmektedir.
    3. Aşağıdaki gözlenmesi halinde NS 2 (parezi başlangıcı) atayın: fare kuyruğu tarafından askıya alındığında, hindlimb çok uzanan değil, kısmen ya da tamamen yıkılmış olduğunu. (Hala ortak hareket olabilir). Fare yürümeye izin verildiğinde, hindlimb ileri mot için kullanılıriyon ancak ayak 90 cm yürüyüş sırasında en az iki kez aşağı doğru kıvrılıp VEYA ayak herhangi bir parçası kafes alt / masa boyunca sürükleyerek. Fare sol VE sağ tarafına yerleştirilmiş olduğunda, İKİ taraftan 10 saniye içinde kendini sağa yapabiliyor.
    4. Aşağıdaki gözlenmesi halinde NS 3 (Felç) atayın: fare kuyruğu tarafından askıya alındığında, hindlimb VEYA minimal eklem hareket içinde sert felç var. Fare yürümeye izin verildiğinde öne Ancak hindlimb ileri hareket için kullanılan DEĞİLDİR hareket vardır. Fare sol VE sağ tarafına yerleştirilmiş olduğunda, İKİ taraftan 10 saniye içinde kendini sağa yapabiliyor. Not: Nadiren, felç başlangıcından sonra, idrar nem arka ayaklarında görünebilir. Tedavi edilmeyen idrar nem idrar "yanık" ve deri lezyonları neden olabilir. Saç kırpma yoluyla idrar nem davranın, ılık su idrar çıkarmak ıslatırken uygulamak ve yavaşça kuru kurulayın. Cilt lezyonları varsa Antibiyotik uygulanırtic merhem.
    5. Aşağıdaki gözlenmesi halinde NS 4 (İnsanca son nokta) atayın: fare kuyruğu tarafından askıya alındığında, arka ayaklarında sert felç var. Fare yürümeye izin verildiğinde, hiçbir ileri hareket yoktur. Fare sol VE sağ tarafına yerleştirilmiş edildiğinde, YA taraftan 10 saniye içinde kendini sağa mümkün değildir. Yani, refleksi yokluğu.

4. Veri Girişi ve Analizi

  1. Bir ilaç etkinlik çalışması sırasında, bir Laboratuar Bilgi Yönetim Sistemi (LIMS) her bir fare için veya ticari olarak satılan elektronik tablo yazılımı içine toplanan verileri girin.
    Not: ALS TDI geliştirilen LIMS yazılım dahili çalışmalardan toplanan tüm veriler için merkezi bir depo, ALS TDI müfettişler için zamanla bu veriler elverişli erişilebilir hale getirmek. LIMS, tüm çalışma günlerinde geri soyu, vücut ağırlığı veya nörolojik skoru, eşsiz kimliği ile, herhangi bir bireysel fare izlerve ömrü boyunca kaydetti başka gözlemleriniz içerir. LIMS sonuçta daha sonraki analizler için kullanılan bir elektronik tablo oluşturur.
  2. Bir ilaç etkinlik çalışmasında, yani tüm fareler insancıl uç noktasına ulaştığında, kullanım tablosu programı (Malzeme Tabloya bakınız) Sol ve sağ hindlimb NS ortalamasını alarak her gün için, her bir fare için kombine NS hesaplamak tamamlanmasının ardından . Sonra, her fare ve her bir fare, belirli bir NS geçirdiği gün sayısı her NS ortanca yaşı hesaplamak.
  3. İstatistiksel yazılımı elektronik tablo yazılımı veri alma yoluyla zaman içinde NS genel değişimleri analiz (Malzeme Tablo). Regresyon etkileri gibi medyan NS yaşı ve uyuşturucu tedavi ile, beklenen NS tahmin sıralı lojistik regresyon modeli kullanılarak bu verileri takınız. Log-rank ki-kare testi kullanılarak etkisi olabilirlik olasılığını tahmin ve NS ilerlemesi üzerine uyuşturucu tedavi etkisi istatistiksel olup olmadığını belirlemekly anlamlı (adım-adım talimatlar için İletişim Kod Dosyası bakınız).
    Not: Bir p-değeri <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmektedir.
    Not: İstatistiksel analiz yöntemi NS veri ve bireysel fareler için NS yörüngeleri değişken doğası sıralı doğasını saygılıdır. Bireysel NS yörüngeleri yeterli NS tepkilerin yansıtıcı olmayan NS zaman ilişkili grup ortalamaları sonuçlanan belirgin farklı olabilir, çünkü tercih edilir. Buna ek olarak, bazı durumlarda, NS özellikle sıfır-bir aralığında değişebilir.
  4. Son olarak, kullanım grafik yazılımı ilaç ile tedavi edilen ve kontrol hayvanları için grafikler "Ordinal NS Medyan Yaş vs NS Beklenen" oluşturmak için (Malzeme Tabloya bakınız) (Şekil 2; Yan Kod adım adım talimatlar için Dosya bakınız). Uygun y-ekseninden hastalığın başlangıcından (i ortalama yaşı enterpolasyonlayarak ilaç ile tedavi edilen ve kontrol grupları arasında vardiya tahmin etmek bu grafikleri kullanabilirsiniz.e., x-ekseninde NS 2).
    Not: İki grup arasında ortalama yaş farkı ilaca bağlı değişimi temsil ve etkinin büyüklüğü pratik bir önlem olarak kabul edilir.
    Not: Semptomatik hastalığın ilerlemesini yavaşlattı göstermektedir beklenen NS vs ortanca yaş eğrisi sağa kaymalar. Tersine, beklenen NS vs ortanca yaş eğrisi sola kaymalar semptomatik hastalığın ilerlemesini hızlandırılmış göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2014 değerlendirildi sırasında 90 erkek ve 94 dişi olmayan tedavi SOD1-G93A fareler için nörolojik puanı verileri ALS TDI okudu. Sonuçlar kadınlara oranla NS 1 de yaşamlarının büyük bir oranda kanıtladığı gibi erkek fareler genellikle, dişi farelere göre daha agresif bir hastalık ilerlemesini sahip olduğunu göstermektedir. NS 2 ve NS 3 cinsiyetler arasında neredeyse eşit sıklıkta görülür. O "normal" bir fenotip olarak kabul edilir, çünkü NS 0 analize dahil edilmiştir. NS 4 de sadece bir SOD1-G93A farenin ömrü (T...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, doğru uygulandığı takdirde, güvenilir SOD1-G93A farelerde hastalığın ilerlemesini değerlendirmek ve ilaca bağlı değişikliklerin belirlenmesi yeteneğine sahip, hızlı ve basit bir video protokol açıklar. Farklı gruplar SOD1-G93A farelerin 8-10 için fenotipik skorlama sistemleri geliştirdiler ederken, sık sık prosedürü hakkında yeterli bilgi sağlamak ve replikasyon için yetersiz kalmaktadır yok. Sonuç olarak, skorlama sistemleri nadiren onları geliştiren belirli bir grup dışında kullanılmaktadır. Bu r...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El yazmasını eleştirel bir şekilde gözden geçirdikleri için Beth Levine'e, genotipleme protokolünü geliştirdiği için Valerie Tassinari'ye ve olağanüstü hayvan bakımları için Matt Ferola ve Carlos Maya'ya teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur suşuJackson Laboratuvarı, Bar Harbor, ME002726Bu çalışmada kullanılan farelerin türü
BreedersBiomedical Research Models, Inc., Worcester, MAKoloni bakım
ölçeğiNavigator OHAUS, Parsippany, NJModel N14120Fareleri tartmak için kullanılır
Nutra-GelHBio-Serv, Flemington, NJIslak mama hasta farelere sağlanan
Işınlanmış Laboratuvar Hayvanı DiyetiHarlan, Indianapolis, IN2918-111914MChow diyeti
Laboratuvar sınıfı Sani-cipsHarlan Teklad, Indianapolis, IN7090Yatak
JMPH SAS Enstitüsü, Inc., SAS Kampüs Sürücüsü, Cary, NC  v10.0.2İstatistik yazılımı
Microsoft ExcelMicrosoft, One Microsoft Way, Redmond, WAExcel 2013 (v 15.0)Elektronik tablo yazılımı
GraphPad Prism 5GraphPad software Inc., La Jolla, CAv5.4Grafik yazılımı
Mouse HutsBio-Serv, Flemington, NJK3272Çevresel zenginleştirme için
#S4798

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  2. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  3. Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
  4. Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
  5. Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
  6. Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
  7. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  8. Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
  9. Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
  10. Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
  11. Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
  12. Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
  13. Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
  14. C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
  15. Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
  16. Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Arka Ekstremite Fonksiyon De erlendirmesiKuyruk Ask TestiY r me AnaliziYazma Refleksi TestiOrdinal Lojistik RegresyonHastal k Progresyon De erlendirmesiTerap tik M dahale TaramasFenotipik Ge i Noktalar

İlgili makaleler