Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kullanımı

12.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53262

⸱

21 Ekim 2015

 , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Bu makalede

Özet

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Özet

Intrauterin organogenezi incelenmesi rahim içinde gelişmesi embriyolar nedeniyle reaktif erişilememesi plasenta memelilerde teknik olarak oldukça zor bir süreçtir. Yeni geliştirilen ex vivo dik damlacık kültür yöntemi rahimde yapılan çalışmalara cazip bir alternatif sunuyor. Ex vivo damlacık kültürü incelemek ve çeşitli engelleme ve aktive bileşiklerin kullanımı ile hücresel etkileşimleri ve çeşitli sinyal yolları işlemek için yeteneği sağlar; buna ek olarak, belirli bir organların gelişimi üzerindeki çeşitli farmakolojik reaktifler etkileri in utero sistemik ilaç verilmesi, istenmeyen yan etkiler olmadan incelenebilir. Vitro sistemler diğer karşılaştırıldığında, damlacık kültürü, memeli hücre çizgilerinde üretilemeyen, üç boyutlu morfogenez ve hücre-hücre etkileşimini incelemek için yeteneği, izin verir, ancak, aynı zamanda daha az r gerektirir sadeceex vivo ve in vitro diğerinden daha protokollerde eagents. Bu yazıda yöntemin etkinliğini göstermek için tüm organ immünofloresan ardından uygun fare fetal organı diseksiyonu ve dik damlacık kültürü teknikleri, göstermektedir. Ex vivo damlacık kültürü yöntemi benzer in vivo olarak gözlenen ve in vivo modellerde embriyon ölümlerine nedeniyle, aksi takdirde zor çalışma süreçleri incelemek için kullanılabilir ne organ mimarisi oluşumunu sağlar. Bir örnek uygulama sistemi olarak, bir küçük moleküllü inhibitör testiküler morfojenezinde damarlanma rolünü araştırmak için kullanılacaktır. Her organ yoğun olması protokole herhangi bir organ spesifik değişiklikler belirlemek için okudu gerekir, ancak bu ex vivo damlacık kültür yöntemi, akciğer ve potansiyel diğerleri gibi diğer fetal organ sistemlerinde, yükseltilebiliyor. Bu organ kültür sisteminde fetal organlar ile deney esneklik sağlar ve obtaine sonuçlarıd araştırmacılar fetal gelişim içgörüler elde etmenize yardımcı olacaktır, bu tekniği kullanarak.

Giriş

Insanlarda in vivo olarak organ yenilenmesi çok sınırlıdır; Bu nedenle, doku mühendisliği, doku ve bir ev sahibi tarafından bağışlanan bireysel hücrelerden organ gelişimi, organ değişimi için cazip bir potansiyel tedavi haline geliyor. Bu tedavi stratejisi başarılı olması için, ancak, faktörler ve organ morfolojilerinden katılan hücresel etkileşimleri iyice incelenmesi gerekir ve iyi anladım. Geleneksel yaklaşımlara belirli organların gelişimini incelemek için yetersizlik nedeniyle, araştırmacılar, alternatif bütün embriyo veya tüm organ kültürlerinde döndü. Kalaskar ve ark., 1 o ex vivo kültür yöntemleri organogenezisin çalışmaları için uygun bir alternatif düşündüren, utero geliştirme için (kültürlü embriyoların% 58'inde) o ex vivo tüm embriyogenez kültür karşılaştırılabilir sonuçlar verir göstermiştir.

Bir bireyselleştirilmiş organ kültürü sistemi gibi bu ex vivo drofarmakolojik reaktifler veya antikorların ilavesi ile, belirli bir sinyal yolu ya da hücresel etkileşimler manipülasyonu izin verirken plet kültür sistemi, sistemik etkileri tüm organ analizi bağımsız sağlar. Geleneksel olarak, fetal organ gelişimine çalışma maternal teslim farmakolojik reaktifler yanı sıra, transgenik fare ve boşaltma teknolojileri ile sınırlı olmuştur. Ancak, in vivo bu teknikleri ve tedavileri kapsayan teknik sorunlar vardır; En endişeleri genellikle embriyonik öldürücülüğü sonuçları eş zamanlı olarak çeşitli organları etkileyen etkileri etrafında döner. Fetal gelişimi manipüle çalışmaların ilave endişe farmakolojik tür reaktifler plasental bariyeri geçmek eğer (örneğin, ilacın anne metabolizma o embriyoyu ulaşmadan önce) ve intrauterin embriyonik gelişimi üzerindeki ilaçların anne etkisidir.

Tüm organ kültürü tekniği tarifBurada bütün fetal gonadlar ex vivo dik damlacık kültürleri inkübe edildiği ilk Maatouk ve ark., 2 tarafından tarif edilen protokol uyarlanmıştır. Fetal gonadlar kültürlenmesi önemli bir avantajı, küçük molekül inhibitörleri ile kolaylıkla difüzyon ile bütün bir organ erişebilir olmasıdır. . DeFalco ve arkadaşları, küçük-molekül inhibitörleri ile bağlantılı olarak, bu ex vivo damlacık kültür yöntemi kullanılarak süreçler ve gonad gelişimi sırasında meydana gelen 3 etkileşimleri sinyal incelemek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir; bu işlemler nedeniyle teknik zorlukları in vivo incelenmesi zor olacağını (örneğin, plasenta ya da genetik ya da farmakolojik yaklaşımlar kullanarak birden fazla organı etkileyen ölümcül yoluyla ilaçların geçişi).

Damlacık kültürü sadece utero deneme belirli yönleri üzerinde bir gelişmedir, ama aynı zamanda in vitro ve ex vi üzerinde bir gelişmedirvo sistemleri de. Bunlar, çok çeşitli hücre tiplerini eksikliği, organ mimarisinin oluşmasına izin kritik hücre dışı matris (ECM) bileşenleri yoksundur ve sinyal basamaklarının gölgeleri göstermemesi için morfonogenezi çalışma hücre çizgilerinin kullanımı son derece zordur. Doku mühendisliği ECM taklit iskeleleri oluştururken önemli iyileştirmeler yapılmış olmasına rağmen, sinyaller organogenezis sırasında her hücre türüne göre gerekli olan ilgili bilgi eksikliği zorlu in vitro organ sistemini oluşturmak için yapar. Diğer ex vivo sistemler daha önce, filtreler 6 ve diğer iskele matrisleri 7,8 organogenezi incelemek için kurulan ya da daha spesifik olarak morfogenez ve agar 4 fetal organların canlı görüntüleme için çok başarılı olmuştur, 5 transwells oylandı. Damlacık kültür sisteminin avantajı, o kadar az reaktifleri, kullanma olanağı sağlayarak morfogenez çalışma olanak sağlamasıdırFTEN pahalı, ama aynı zamanda büyüme ve sinyal yetenekleri 9 için önemli olan, organ yüzey gerilimi vererek.

Fare, ilk testis morfogenezisi embriyonik (E) arasında yer alan E11.5 E13.5 ve aşamaları; Bu aşamalar cinsiyete özgü farklılaşma etkileyen faktörleri incelemek için en uygun zaman penceresini içermektedir. Testis oluşumu sırasında meydana gelen önemli işlemler arasında testis kord mimarisinin üretimi ve testis özgü damar ağı oluşumu bulunmaktadır. Bu ex vivo tüm organ damlacık kültür sistemi kullanmak, bir erkek spesifik vaskülarizasyon değiştirebilir ve küçük bir molekül inhibitörü kullanmak suretiyle testis morfogenetiğine inhibe edebilir engelleyen, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) için reseptör etkinliği; VEGF-aracılı vasküler yeniden modellenme Testis gelişiminin 10-12 için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, başarılı bir diğer organlara uygulanabilir ve belirli bir zaman hedefleyebilirgelişme pencereler. Tüm montaj organı görüntüleme hayati yapıların görselleştirme yanı sıra çeşitli inhibitörlerinin uygulanmasından kaynaklanan yapısal ve hücresel değişiklikler sağlar. Önemli olarak, bu sistem, bir araştırmacı, in vivo hedefli gen stratejileri maternal ilaç uygulama ya da sistemik olarak bozulması potansiyel karıştırıcı etkilerini atlayabilir avantajlıdır. Böylece, bütün bu organın ex vivo damlacık kültürü sistemi önemli ölçüde fetal gelişim sırasında belirli organları içinde özellikle meydana gelen etkileşimleri ve sinyalizasyon anlama yeteneğini geliştirmek olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmalarda kullanılan tüm fareler Charles River Laboratories den temin edilen CD-1 fareler. Önceki kültürü deneyleri, aynı zamanda, C57BL / 6J (veriler gösterilmemiştir) gibi başka suşlar üzerinde gerçekleştirilmiştir, ancak herhangi bir suşu kullanılabilir. Hamile yetişkin kadın yaklaşık 2-3 aylık ve servikal dislokasyon ve embriyo çıkarılması öncesinde ikili torakotomi ardından CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi edildi. Fareler NIH esaslara uygun olarak muhafaza edildi ve deneysel protokoller Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

  1. % 70 etanol çözeltisi hazırlayın. (Nemlendirilmiş odaları yapmak için ve / seyreltilmesi çözüm yapmak için) Otoklav deiyonize su. % 70 etanol ile aşağı püskürtülerek diseksiyon araçları (forseps, makas ve 27 G iğne şırınga) sterilize edin.
  2. HazırlamakMl 1 M MgCl2 CaCl2, 3,75 1 M PO 4, 6.75 mi, kalsiyum ve magnezyum (80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 g 2 Na HPO 4, 2.4 g KH 2 içeren 10X fosfat tamponlu tuz (PBS) ). 1 L steril otoklava su içinde çözülür ve daha sonra filtre kağıdı ile filtre karıştırın. 1X PBS yapmak için, su ile 10 kat seyreltilir.
  3. Isı 30 dakika boyunca 55 ° C 'de cenin sığır serumu (FBS) inaktive ve filtre, bir 0.22 mikron bir şırınga filtresi ile sterilize edin.
  4. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 'den oluşan, (tam bir DMEM, cDMEM adlandırılır) 38 mi 1X komple kültür ortamı hazırlayın,% 10 penisilin-streptomisin stokunun ısı ile inaktive edilmiş FBS ile 1/100 seyreltme filtre edilmiştir. Bu genellikle taze kullanılabilir, ama 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  5. 5 mg / ml'lik bir stok konsantrasyonu için DMSO içinde VEGFR Tirosin kinaz önleyici II (TK II) sulandırın ve bir çalışma çözeltisinin yapılması için cDMEM ile stok seyreltin. Nihai conBu çalışma için sentrasyonu cDMEM içinde 1,875 ng / ml 'dir. Şirketin tavsiyelerine göre, stok çözeltileri -20 ° C'de en fazla 6 ay süreyle stabildir. Çalışma çözümleri gibi taze yapmak ve aynı gün kullanın.
    Not: çalışma çözeltisi içinde, bu, ilacın konsantrasyonunun (bu damlacık iki kat seyreltilmiş olacaktır çünkü) arzu edilen son konsantrasyona göre iki kat daha yüksek olması gerekir. Aynı zamanda, "kontrol" tedavi için DMSO aynı hacimde içeren cDMEM aynı hacimde hazırlar.
  6. Damıtılmış su ayrı ayrı kuyruk sindirim reaktifler (50 mM NaOH ve 1 M Tris-HCI [pH 8.0]) hazırlayın.
  7. XY PCR primerleri, bir 25 uM stok olun (XY ileri 5'-TGA TGG AGC TTT CTT TGA G-3 've 5'-in XY Arka CCG CCA CTG AAT TCT TTG G-3') birlikte nükleaz içermeyen su içinde.
  8. 50X TAE tamponu (242 g Trizma Baz, 57.1 ml buzlu asetik asit Hazırlama, 100 mi 0,5 M EDTA, pH 8.5 ve ek su, 1 L final hacim). 1X TAE çalıştırma tamponu hazırlayın (20 mi 50X TAE 1 L toplam hacim, su ile sulandırılmış).
  9. Kaynar kadar mikrodalga% 2.5 agaroz çözeltisi (0.625 gr agaroz, 0.5 ml 50X TAE tamponu, 24.5 ml su) ısı agaroz çözüm oluşturmak için, daha sonra soğumaya bırakın yaklaşık 55-65 ° C (dokunabilmek) kadar. Soğuduktan sonra,% 1 etidyum bromür çözeltisi 2 ul ve jel dökün.
    DİKKAT! Etidyum bromür mutajen ve teratojen olduğu; nitril eldiven ve uygun güvenlik protokolü taşıma kullanın. Seçenek olarak ise, diğer potansiyel olarak daha az toksik jel çözme maddeleri ya da boyalar kullanılabilir.
  10. Imüno (% 0.1 Triton X-100,% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve% 3 sığır serum albümini [BSA] PBS) Bloklama çözeltisi hazırlayın.
  11. Immünofloresans için yıkama Solüsyonu (% 0.1 Triton X-100 PBS ile,% 1 FBS ve% 3 BSA) hazırlayın.
  12. Imüno (% 0.1 Triton X-100 ile PBS) PBTx hazırlayın.
  13. Cu kuluçka odaları hazırlayınlture. Su otoklavlanmış 35 ml büyük (100 mm çapında) petri kaplarına doldurulur. Diseksiyon ve kültürler yapılacaktır yere yakın yerleştirin.

Mus musculus kaynaklı Fetal TESTİSLERİN 2. izolasyonu

  1. Her sabah vajinal fişler için dişi fare kontrol edin. Vajinal fişi tespit edildiği gün öğle E0.5 olarak kabul edilir. Onaylı hayvan protokolleri ile uyumlu bir şekilde, E11.5 hamile kadın fare Euthanize.
  2. % 70 etanol ile fare karın aşağı Sprey.
  3. Ince makas kullanarak bir V-şekilli kesi ile karın deri ve periton açın ve iç organları maruz doku kapağı geri çekin.
  4. Uterin horn iki ucunda yumurtalık bulun. Makas kullanarak, annenin vücudundan embriyoları içeren rahim ayırmak için yumurtalığın ve bağ dokusu kesilir.
  5. Yavaşça, plasenta karşı tarafında kesme sarısı kesesi teşhir ederek rahim duvarına açın. Pu dikkatli olun değilncture yolk kesesi zarar veya kaybetme embriyolar önlemek için.
  6. Embriyo içeren sarısı keseler çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum ile PBS içeren bir çanak içine yerleştirmek için plasenta yakınındaki kesin. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının varlığı desteği hücre adhezyon molekülleri mimari dokusu korumak ve diseksiyon araçları yapışmasını doku önlemeye yardımcı olacaktır.
  7. Forseps ile dikkatlice embriyo dışarı kayabileceği bir delik oluşturmak için sarısı kesesi batırılarak embriyo sarısı kesesi ve amniyon çıkarın. Embriyo yumurta sarısının dışında sonra, göbek kordonu kesti.
  8. Bu noktadan sonra, steril doku kültürü kaputu bulunan bir mikroskop kullanılır. Embriyonun kafasını çıkartın ve boyun her iki tarafında forseps ile kısma atın.
  9. Kuyruk çıkarın ve embriyo cinsiyeti belirlemek için XY PCR analizi için yeni mikrosantrifüj tüpe koyun.
    Not: Hasattan sonra en kısa sürede kültür gonadlar optimal iken, aynı zamanda pos olduğunusible kuyruk DNA'sının çıkarın ve her bir embriyonun cinsiyeti bilinir ve sadece arzu edilen cinsiyet kültürlenmiş olması gerekmektedir, böylece, kültür önceden XX / XY genotipleme gerçekleştirmek için. Genotipleme yapılmaktadır birlikte kültür için hazır olana kadar 4 ° C de veya buz üzerinde (bunlar izlenebilir ve böylece), embriyolar ayrıldı tutulabilir. Bir ihtar utero veya kültür koşulları dışında bu dönem potansiyel kültür sırasında kültüre ya da sonraki gelişimi için canlılığı etkileyebilir olmasıdır.
  10. (Genelde zayıf elinde tuttuğu forseps) forseps bir çift embriyo koltukaltı iğneleyerek kültür çanak alt karşı yatar pozisyonda embriyo sabitleyin. Tüm diseksiyon sürecinde hala embriyo tutmak için yerinde bu forseps koruyun.
  11. Forseps diğer çifti, cilt kaplayan karın kaldırmak ve yavaşça vücut duvarı geri maruz karaciğer, bağırsak, ve diğer organları çıkarın.
  12. Gonadlar dorsal aort iki tarafında arka vücut duvarında bulunan gibi,Vücudun orta hat boyunca uzanan büyük bir kan damarı, kapalı forseps ile ürogenital sırtı altına kepçe ve forseps açılması ve yukarı kaldırarak ürogenital sırtı çıkarın. Gonadlar gevşek duvara iliştirilmiş gibi, bu bağlantıları çıkarmadan çok hızlı yukarı çekin ya da gonadlar organlara zarar, streç olabilir dikkatli olun.
  13. Medyaya doku acclimate bir çanak cDMEM içine ürogenital sırtı taşıyın.
  14. 27 G iğneler kullanarak ürogenital sırtın geri kalanından gonad-mezonefron kompleksi ayırın. Optimal ayrılması izin bastırarak kesti ve doğru dokuyu yönlendirmek için diğer kullanılacak bir iğne kullanın. Keskin iğneler dokuya sopa plastik kırıkları yaratacak şekilde, çanak alt karşı testere hareketi kullanmaktan kaçının. Tamamen gonad bağlı mesonephrosun tutmak için emin olun.

Küçük moleküllü inhibitör ile gonadın 3. Kültürleme

  1. Iki adet 20 mikron ayarlayın15 ul her l pipetler. Diğer pipet ilaçla tedavi cDMEM yalnızca kullanılacak ise, gonadlar ve kontrol cDMEM eklenmesi transferi için temiz, steril jilet kullanarak bariyer pipet uçları kapalı bir yaklaşık 1-2 mm kesti.
  2. Kolayca kesme ucu kullanılarak pipetlenebilir böylece pipet onların uzun eksen paralel gonadlar hizaya. Pipet içine yapışmasını gonadlar dikkatli olun.
  3. Bir kontrol damlacık olarak yan ve ilaç içeren damlacık gibi diğer etiketleyin. Sadece iki damlacıkları 35 mm çanak kapağı üzerinde sığabilir. Kapaklarındaki etiketler kuyruk doku içeren mikrosantrifüj tüpler üzerindeki etiketleri uygun olduğundan emin olun.
  4. Küçük (35 mm) kültür çanak kapağı bir damlacık içine tek bir gonad içeren cDMEM Pipet 15 ul (dipleri nemlendirilmiş petri odasına sığacak kadar uzun olduğu gibi, sadece kapaklar kullanın). Çanak her iki yanı üzerinde iki ayrı gonad ihtiva eden damlacıkları yerleştirin, iyi ayrılmış from Birbirinizi. Gonadlar damlacıklar devredilmiştir emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
  5. Kontrol olarak belirlenmiş damlacık için, 30 ul toplam hacim bir damlacık yapmak için (adım 1.5) yapılan DMSO içeren cDMEM ek bir 15 ul ekle. Ilaç temas olmayacak sadece "kontrol" pipet kullanın.
  6. Diğer damlacık (ilaçla tedavi örnek) için, 30 ul toplam hacmi olan bir damlacık yapmak için TKİ-II içeren cDMEM 15 ul ekleyin. Ilaçla işleme tabi tutulmuş numuneler için tasarlanmış tek pipet kullanın.
  7. Onlar çapı yaklaşık 15-18 mm ve gonad kabaca ortasında yer alır kadar pipet kullanarak, genişleyen dairesel desen damlacıklar yayılır. Onun yan yatıyor ve gonad ve mezonefron kolayca ayırt böylece gonad Orient. İki lobu düz koymak, böylece akciğer Orient.
    1. Damlacık çapı biraz farklı olabilir, ancak gonadlar uçuşan değildir sağlamakg ve yüzey gerilimi ile yerinde tutulur. Damlacıklar birbirleri veya kapağın yan dokunmayın emin olun. Yüzey gerilimi olmadan, organlar, organ ve böylece morfolojisi bozan, kültür sırasında kapağın üzerine büyür ve dümdüz olacak.
  8. Dikkatle dik büyük (100 mm) nemlendirici çanak su yüzeyi üzerine damlacıklar içeren kültür çanağı kapağı yerleştirin. Kapağın altındaki altında sıkışıp hiçbir kabarcıkları vardır emin olun ve su yüzeyinde düz yalan. Kapağı ters ve herhangi bir su damlacıkları bulunan kapağın üst dokunmasına izin vermemek için dikkatli olmayın.
  9. Küçük, nemlendirilmiş odasına oluşturmak için, hemen gonad kültürleri içine daha büyük nemlendirici çanak kapak ile kapatın. Medya herhangi buharlaşmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk hareket ederler. Daha küçük tabak serbestçe hareket etmek o ve daha büyük çanak kapak arasında oda olduğundan emin olun; Aksi takdirde, yoğuşma mühür ve b yapabilirdokuya kilidi hava değişimi.
  10. Iki küçük kapaklar odasına yerleştirilir hemen sonra, inkübatör içine odasına yerleştirin. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca damla kültürleri inkübe edin.

Embriyolar Seks Belirleme 4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp dibine embriyonik kuyrukları ekleyin.
  2. Her tüpe 50 mM NaOH 200 ul ekle.
  3. 15 dakika boyunca ya da doku tamamen eriyene kadar 95 ° C'de yerleştirin.
  4. Hafif ve kısaca 50 1M Tris-HCI ul ve vorteks ekleyin.
  5. 0.5 ul 25 uM Primer çözelti, 2.5 ul 10X Taq tamponu, 0.5 ul 10 mM dNTP (nükleotit), 19,3 ul nuclease-: 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, örneklerin toplam sayısı her hacim çarpılarak taze PCR ana karışımı yapmak serbest su, 0.2 ul DNA Taq polimerazı. İyice karıştır.
  6. 23 EklePCR master karışımı ul sindirilmiş kuyrukları 3 ul lizatı içeren tüpler PCR için.
  7. Flick tüpler daha sonra tüpün dibine örnekleri getirmek için kısa bir sıkma gerçekleştirin, bunları karıştırın.
  8. XY (Kısa) PCR programı (Tablo 1) çalıştırın.
  9. 1X TAE tamponu içinde% 2.5 agaroz jeli içinde merdiveni (5x boyayla) örnekleri yerleştirin.
  10. XX ve XY bantları çözülebilir kadar agaroz jel elektroforezi çalıştırın.
  11. Görüntü UV ışığı ve yakalama görüntüsü ile jel.
  12. Y kromozomu özgü bantlar vs özgü X-kromozomu-(X kromozomu = 331 baz çifti [bp] ve XY = 302 bp) analiz 13; XY (erkek) numuneleri, 331 iki bant ve 302 bp olacak XX ise (kadın) numuneler tek 331 bp bandı olarak görünecektir.

5. Tüm Dağı Organ İmmünofloresan

1.gün:

  1. Bir kesme ucu ile 1000 ul pipet kullanılarak kültürden gonadlar çıkarın. Eğer arzu edilirse, bunlar olabilirortam ve reaktifleri yıkamak için bir PBS tabağına yerleştirilir. 0.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde PBS içine yerleştirin. Daha küçük tüp boyutu reaktifleri korumak ve daha kolay tüp numune takip etmek için yapacaktır.
    1. Potansiyel ilaç kirlenmesini önlemek için ayrı ayrı tüplerde, kontrol ve tedavi örnekleri yanı sıra, XX ve XY örnekleri tutmak ve pipetler ayrı setleri ile kültürden bunları kaldırmak için emin olun.
  2. PBS ile iki kez gonadlar yıkayın. Bu noktada andan itibaren, bu protokol kalsiyum ve magnezyum eksik 1X PBS kullanabilirsiniz. Onları yıkamak için, gonadlar (yerçekimi) tarafından tüpün dibine çöker ve daha sonra yukarıda sıvı kaldırmak için izin verir. Onlara çok yakın pipetleme gonadlar kaybetmek değil dikkatli olun.
  3. Tüpten mümkün olduğunca PBS çıkarın. PBS,% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden içinde% 4 paraformaldehit 250 ul ekleyin ve bir rocker 4 ° C 'de O / N inkübe edin. Seçenek olarak ise, bu tespit bir rocker 4 ° C 'de 2 saat süre ile yapılabilir. DİKKAT! ParaforFormaldehit işlerken bu nedenle güvenlik protokolünü takip toksik bir maddedir.

2. Gün:

  1. Oda sıcaklığında 250 ul PBTx iki kez gonadlar durulayın.
  2. Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 250 ul PBTx ile gonadlar 3 kez yıkayın.
  3. Bir rocker oda sıcaklığında çözüm Engelleme 250 ul gonadlar en az 1 saat engelleyin.
  4. Çözüm Engelleme içinde seyreltilmiş 250 ul primer antikor bir rocker 4 ° C 'de gonadlar O / N Leke.

3. Gün:

  1. 250 ul Yıkama Çözüm kez gonadlar durulayın.
  2. Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için gonadlar 250 ul Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın.
  3. Gonadlar bir rocker RT'de Çözüm Engelleme 250 ul 1 saat engelleyin.
  4. Işıktan, ışıltılı ikincil antikorlar korumak için alüminyum folyo ile mikrosantrifüj tüpü örtün.
  5. Ar üzerinde oda sıcaklığında gonadlar 2-4 saat bekletinOcker Alternatif olarak Hoechst 33342. ihtiva eden bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş 250 ul ikincil antikor, rocker 4 ° C 'de, ikincil antikor ve Hoechst 33342 inkübasyon O / N gerçekleştirin.
  6. 250 ul PBTx iki kez gonadlar durulayın.
  7. Bir rocker oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 250 ul PBTx içinde gonad 3 kere yıkayın.
  8. Bir kesme pipet kullanarak, en az bir sıvı, bir lam üzerine gonadlar aktarın. Pipet yardımıyla fazla sıvıyı çıkarın, ancak doku kurumasına değil emin olun.
  9. Forseps ile istenilen şekilde gonadlar yönlendirmek ve hızlı bir şekilde slayt gonadlar monte etmek montaj medya bir damla ekleyin. Montaj medya mantolar tamamen bütün numuneler emin olunuz; o örnekleri kurumasına izin kaçınmak için kritik öneme sahiptir.
  10. Uygun büyüklükte kullanılması lamelleri (sayı 1.5 tarzı) yavaşça örnekleri kapsayacak. Lamel tüm yüzeyine temas montaj medya yayılmasını edelim. Gerekirse, çok hafifçe böylece lamel köşelerinde basınhiçbir büyük hava kabarcıkları vardır.
  11. Montaj medya buharlaşmasını azaltmak için kenarlarda açık oje ile slaytlar mühür. Mağaza 4 ° C'de karanlıkta slaytlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ex vivo damlacık kültürü kimse, böyle bir gonad olarak bütün organların, işlemek için hücresel etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için. 1, bir E11.5 gonadal damlacık kültürü nasıl hazırlanacağını adım adım moda gösteriyor Şekil verir. Kültür protokolünde ilk adımlar anne fare (Şekil 1A ve 1B) gelen embriyo içeren rahim başlangıçtaki kaldırılmasını içerir. Anneden rahim çıkarılmasından sonra rahim duvarına kesilir ve embriyoların daha da d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma fetal gelişimi eğitimi için birçok potansiyel uygulamalar vardır bir ex vivo tüm organ damlacık yöntemi gösterir. Bu teknik sayesinde embriyo ve potansiyel embriyonik letalitesinin erişilememesi biyolojik in vivo kullanarak incelemek için zor sorulara yaklaşımları ele araştırmacı birden organlar için kullanılan ve izin verir edilebilir. Bu kültür yöntemi memeli hücre çizgileri gibi yaklaşımlar nitro Diğer üzerinde ek avantajları vardır: bütün organların nedenle uterus içinde mev...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar tarafından desteklendi: CancerFree KIDS Araştırma Bursu, March of Dimes Basil O'Connor Başlangıç Bursu Ödülü (#5-FY14-32), Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) Mütevelli Heyeti Hibe Ödülü; CCHMC Araştırma İnovasyonu ve Pilot Finansman Ödülü; ve CCHMC geliştirme fonları. Yazarlar ayrıca bu tekniğin ilk optimizasyonu için Capel laboratuvarına da teşekkür ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Superfrost Plus Mikroskop SlaytlarıFisherbrand12-550-15
Kapak Camları: Kareler (22 mm x 22 mm, No. 1.5)Fisherbrand12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Oje, GörünmezSally Hansen
8 Şeritli 0.2 ml PCR Tüpleri & Müstakil Düz KapaklarGeneMateT3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2LGilsonFA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 ForsepsFST91150-20
İnce MakasFST91460-11
Posi-Click 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleriDenvilleC2170
Posi-Click 0.6 ml mikrosantrifüj tüpleriDenvilleC2176
10 & mu; l SHARP Hassas Bariyer UçlarıDenvilleP1096FR
20 & mu; l SHARP Hassas Bariyer UçlarıDenvilleP1121
200 & l SHARP Hassas Bariyer UçlarıDenvilleP1122
1.000 μ l SHARP Hassas Bariyer UçlarıDenvilleP1126
27 gauge iğneli 1 ml şırıngaBD PrecisionGlide309623
10 ml şırıngaBD305559
0.2 & mu; M PES şırınga filtresiVWR28145-501
Sınıf 3 Kalitatif Filtre Kağıdı Standart Sınıf, daire, 185 mmWhatman1003-185
Primaria 35 mm Kolay Kavrama Stili Hücre Kültürü KabıFalcon/Corning353801
Petri Kapları, Steril (100 mm x 15 mm)VWR25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 İnkübatörEppendorfCO14S-120-0000
Biyogüvenlik KabiniNuareNU-425-400
Minisantrifüj Fisher Scientific05-090-100
BioExpress GyroMixer Değişken XLGeneMateR-3200-1XL
Mastercycler Pro Termal Döngüleyici, kontrol panelliEppendorf950040015
SMZ445 stereomikroskopNikonSMZ445
AlphaEase Yazılımlı MultiImage Işık KabiniAlpha Innotech CorporationDurduruldu
Mutlak 200 geçirmez EtanolFisherBP2818-500
Triton X-100FisherBP151-100
Sodyum Fosfat (Dibazik MW 142) Na2< / sub>HPO4< / sub >FisherS374-1
Potasyum Fosfat (Monobazik MW 136) KH2< / sub>PO4< sub>Sigma-AldrichP5379-1KG
Sodyum Klorür (NaCl)FisherS671-3
Potasyum Klorür (KCl)Sigma-AldrichP3911-1KG
Magnezyum Klorür (MgCl2)SigmaM2393-100g
Kalsiyum Klorür (CaCl2)SigmaC5670-100g
Ambion Nükleaz İçermeyen SuÖmrü TeknolojileriAM9938 
XY PCR Astarı IDTN/A
Buzul Asetik AsitFisherA38-500
Etilendiamin Tetraasetik Asit (EDTA)FisherBP2482-1
%1 Etidyum bromür çözeltisiFisherBP1302-10Toksik
AgarozGeneMateE-3120-500
Sodyum Hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrich367176-2.5KG
Trizma BaseSigmaT1503-1KG
dNTP Seti, 100 mM ÇözümlerThermo ScientificR0182
DNA Seçimi 10x Tamponlu Taq polimerazDenvilleCB-4050-3
ParaformaldehitFisherO4042-500Toksik
FluorMount-GSouthern Biotech0100-01
Hidrojen Klorür ( HCl)FisherA144212
Sığır Serumu Albümini (BSA), toz, Fraksiyon V, Isı şoku izolasyonuBioexpress0332-100g
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) Yaşam Teknolojileri11965-092
Fetal Sığır Serumu (FBS), üçlü 100 nm filtreliFisher03-600-511
(10.000 U/ml): Yaşam Teknolojileri15140-1221: 100'de kullanın
Dimetil sülfoksit (DMSO), Hybri-max, steril filtreliSigmaD2650
VEGFR Tirozin Kinaz İnhibitörü II - CAS 269390-69-4 - CalbiochemEMD Millipore676481
Tavşan Anti-Sox9 AntikoruMilliporeAB5535Seyreltmede kullanım: 1: 4.000
Sıçan Anti-Fare PECAM1 (CD31) AntikorBD Pharmingen553370Seyreltmede kullanım: 1:250
Tavşan Parçalı Kaspaz-3 (Asp175) AntikorHücre Sinyali9661SSeyreltmede kullanım: 1:250
Sıçan E-kaderin / CDH1 Antikoru (ETGB-2)Yaşam Teknolojileri13-1900Seyreltmede kullanım: 1:500
Hoechst 3342, trihidroklorür, trihidratInvitrogen (Moleküler Problar)H13992 ug / ml'de kullanın
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L)Jackson Immunoresearch712-165-153Seyreltmede kullanım: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L)Jackson Immunoresearch712-605-153Kullanım yeri Seyreltme: 1:500
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 konjugeYaşam TeknolojileriA31572Seyreltmede kullanım: 1:500
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjugeYaşam TeknolojileriA21206Seyreltmede kullanım: 1:500
Eşek anti-sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 eşlenikYaşam TeknolojileriA21208Seyreltmede kullanım: 1:500
Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 konjugeYaşam TeknolojileriA31573Seyreltmede kullanım: 1:500
Penisilin-Streptomisin kullanmadan önce ısıyı inaktive edin

Kaynaklar

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817(2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641(2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979(2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Ex Vivo Damlacık KültürüFetal Organ DiseksiyonuDik Damlacık Tekniğiİmmünofloresan MikroskopiKüçük Molekül İnhibitörüVasküler Yeniden ŞekillenmeTestis MorfogeneziGonad Sphs KompleksiDoku Kültürü Kabini
Kullanımı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.