Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Intrauterin organogenezi incelenmesi rahim içinde gelişmesi embriyolar nedeniyle reaktif erişilememesi plasenta memelilerde teknik olarak oldukça zor bir süreçtir. Yeni geliştirilen ex vivo dik damlacık kültür yöntemi rahimde yapılan çalışmalara cazip bir alternatif sunuyor. Ex vivo damlacık kültürü incelemek ve çeşitli engelleme ve aktive bileşiklerin kullanımı ile hücresel etkileşimleri ve çeşitli sinyal yolları işlemek için yeteneği sağlar; buna ek olarak, belirli bir organların gelişimi üzerindeki çeşitli farmakolojik reaktifler etkileri in utero sistemik ilaç verilmesi, istenmeyen yan etkiler olmadan incelenebilir. Vitro sistemler diğer karşılaştırıldığında, damlacık kültürü, memeli hücre çizgilerinde üretilemeyen, üç boyutlu morfogenez ve hücre-hücre etkileşimini incelemek için yeteneği, izin verir, ancak, aynı zamanda daha az r gerektirir sadeceex vivo ve in vitro diğerinden daha protokollerde eagents. Bu yazıda yöntemin etkinliğini göstermek için tüm organ immünofloresan ardından uygun fare fetal organı diseksiyonu ve dik damlacık kültürü teknikleri, göstermektedir. Ex vivo damlacık kültürü yöntemi benzer in vivo olarak gözlenen ve in vivo modellerde embriyon ölümlerine nedeniyle, aksi takdirde zor çalışma süreçleri incelemek için kullanılabilir ne organ mimarisi oluşumunu sağlar. Bir örnek uygulama sistemi olarak, bir küçük moleküllü inhibitör testiküler morfojenezinde damarlanma rolünü araştırmak için kullanılacaktır. Her organ yoğun olması protokole herhangi bir organ spesifik değişiklikler belirlemek için okudu gerekir, ancak bu ex vivo damlacık kültür yöntemi, akciğer ve potansiyel diğerleri gibi diğer fetal organ sistemlerinde, yükseltilebiliyor. Bu organ kültür sisteminde fetal organlar ile deney esneklik sağlar ve obtaine sonuçlarıd araştırmacılar fetal gelişim içgörüler elde etmenize yardımcı olacaktır, bu tekniği kullanarak.
Giriş
Insanlarda in vivo olarak organ yenilenmesi çok sınırlıdır; Bu nedenle, doku mühendisliği, doku ve bir ev sahibi tarafından bağışlanan bireysel hücrelerden organ gelişimi, organ değişimi için cazip bir potansiyel tedavi haline geliyor. Bu tedavi stratejisi başarılı olması için, ancak, faktörler ve organ morfolojilerinden katılan hücresel etkileşimleri iyice incelenmesi gerekir ve iyi anladım. Geleneksel yaklaşımlara belirli organların gelişimini incelemek için yetersizlik nedeniyle, araştırmacılar, alternatif bütün embriyo veya tüm organ kültürlerinde döndü. Kalaskar ve ark., 1 o ex vivo kültür yöntemleri organogenezisin çalışmal....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmalarda kullanılan tüm fareler Charles River Laboratories den temin edilen CD-1 fareler. Önceki kültürü deneyleri, aynı zamanda, C57BL / 6J (veriler gösterilmemiştir) gibi başka suşlar üzerinde gerçekleştirilmiştir, ancak herhangi bir suşu kullanılabilir. Hamile yetişkin kadın yaklaşık 2-3 aylık ve servikal dislokasyon ve embriyo çıkarılması öncesinde ikili torakotomi ardından CO 2 inhalasyon yoluyla ötenazi edildi. Fareler NIH esaslara uygun olarak muhafaza edildi ve deneysel protokoller Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Araçların, Kültür....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ex vivo damlacık kültürü kimse, böyle bir gonad olarak bütün organların, işlemek için hücresel etkileşimleri ve dinamiklerini incelemek için. 1, bir E11.5 gonadal damlacık kültürü nasıl hazırlanacağını adım adım moda gösteriyor Şekil verir. Kültür protokolünde ilk adımlar anne fare (Şekil 1A ve 1B) gelen embriyo içeren rahim başlangıçtaki kaldırılmasını içerir. Anneden rahim çıkarılmasından sonra rahim duvarına kesilir ve embriyoların daha da d.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma fetal gelişimi eğitimi için birçok potansiyel uygulamalar vardır bir ex vivo tüm organ damlacık yöntemi gösterir. Bu teknik sayesinde embriyo ve potansiyel embriyonik letalitesinin erişilememesi biyolojik in vivo kullanarak incelemek için zor sorulara yaklaşımları ele araştırmacı birden organlar için kullanılan ve izin verir edilebilir. Bu kültür yöntemi memeli hücre çizgileri gibi yaklaşımlar nitro Diğer üzerinde ek avantajları vardır: bütün organların nedenle uterus içinde mev.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar tarafından desteklendi: CancerFree KIDS Araştırma Bursu, March of Dimes Basil O'Connor Başlangıç Bursu Ödülü (#5-FY14-32), Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) Mütevelli Heyeti Hibe Ödülü; CCHMC Araştırma İnovasyonu ve Pilot Finansman Ödülü; ve CCHMC geliştirme fonları. Yazarlar ayrıca bu tekniğin ilk optimizasyonu için Capel laboratuvarına da teşekkür ederler.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Kapak Camları: Kareler (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Oje, Görünmez | Sally Hansen | ||
| 8 Şeritli 0.2 ml PCR Tüpleri & Müstakil Düz Kapaklar | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forseps | FST | 91150-20 | |
| İnce Makas | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleri | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml mikrosantrifüj tüpleri | Denville | C2176 | |
| 10 & mu; l SHARP Hassas Bariyer Uçları | Denville | P1096FR | |
| 20 & mu; l SHARP Hassas Bariyer Uçları | Denville | P1121 | |
| 200 & l SHARP Hassas Bariyer Uçları | Denville | P1122 | |
| 1.000 μ l SHARP Hassas Bariyer Uçları | Denville | P1126 | |
| 27 gauge iğneli 1 ml şırınga | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml şırınga | BD | 305559 | |
| 0.2 & mu; M PES şırınga filtresi | VWR | 28145-501 | |
| Sınıf 3 Kalitatif Filtre Kağıdı Standart Sınıf, daire, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Kolay Kavrama Stili Hücre Kültürü Kabı | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Kapları, Steril (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 İnkübatör | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biyogüvenlik Kabini | Nuare | NU-425-400 | |
| Minisantrifüj | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Değişken XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Termal Döngüleyici, kontrol panelli | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomikroskop | Nikon | SMZ445 | |
| AlphaEase Yazılımlı MultiImage Işık Kabini | Alpha Innotech Corporation | Durduruldu | |
| Mutlak 200 geçirmez Etanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodyum Fosfat (Dibazik MW 142) Na2< / sub>HPO4< / sub > | Fisher | S374-1 | |
| Potasyum Fosfat (Monobazik MW 136) KH2< / sub>PO4< sub> | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodyum Klorür (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potasyum Klorür (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnezyum Klorür (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Kalsiyum Klorür (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nükleaz İçermeyen Su | Ömrü Teknolojileri | AM9938 | |
| XY PCR Astarı | IDT | N/A | |
| Buzul Asetik Asit | Fisher | A38-500 | |
| Etilendiamin Tetraasetik Asit (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| %1 Etidyum bromür çözeltisi | Fisher | BP1302-10 | Toksik |
| Agaroz | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodyum Hidroksit (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Seti, 100 mM Çözümler | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Seçimi 10x Tamponlu Taq polimeraz | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehit | Fisher | O4042-500 | Toksik |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hidrojen Klorür ( HCl) | Fisher | A144212 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA), toz, Fraksiyon V, Isı şoku izolasyonu | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Yaşam Teknolojileri | 11965-092 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS), üçlü 100 nm filtreli | Fisher | 03-600-511 | |
| (10.000 U/ml) | : Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | 1: 100'de kullanın |
| Dimetil sülfoksit (DMSO), Hybri-max, steril filtreli | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tirozin Kinaz İnhibitörü II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Tavşan Anti-Sox9 Antikoru | Millipore | AB5535 | Seyreltmede kullanım: 1: 4.000 |
| Sıçan Anti-Fare PECAM1 (CD31) Antikor | BD Pharmingen | 553370 | Seyreltmede kullanım: 1:250 |
| Tavşan Parçalı Kaspaz-3 (Asp175) Antikor | Hücre Sinyali | 9661S | Seyreltmede kullanım: 1:250 |
| Sıçan E-kaderin / CDH1 Antikoru (ETGB-2) | Yaşam Teknolojileri | 13-1900 | Seyreltmede kullanım: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihidroklorür, trihidrat | Invitrogen (Moleküler Problar) | H1399 | 2 ug / ml'de kullanın |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Seyreltmede kullanım: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H + L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Kullanım yeri Seyreltme: 1:500 |
| Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 555 konjuge | Yaşam Teknolojileri | A31572 | Seyreltmede kullanım: 1:500 |
| Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjuge | Yaşam Teknolojileri | A21206 | Seyreltmede kullanım: 1:500 |
| Eşek anti-sıçan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 eşlenik | Yaşam Teknolojileri | A21208 | Seyreltmede kullanım: 1:500 |
| Eşek anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 647 konjuge | Yaşam Teknolojileri | A31573 | Seyreltmede kullanım: 1:500 |
Kaynaklar
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
