Hayvan araştırmalarında tekrarlanan kan örneklemesi gerekli ve önemlidir. Yetişkin zebra balıklarından tekrarlanan kan alımı için yeni, öldürücü olmayan ve güvenilir bir yöntem geliştirdik ve bu yöntemi glikoz metabolizması da dahil olmak üzere kan biyokimyası çalışmasına uyguladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma
Bu makalede
Özet
Özet
Tekrarlanan kan toplama laboratuvar hayvanları üzerinde yapılan en yaygın tekniklerden biridir. Ancak, Zebra balığı kan toplama için bir öldürücü olmayan protokol kurulmamıştır. Zebra balığı kan toplama için önceki metotlar, lateral insizyon, dekapitasyon ve kuyruk ablasyon gibi öldürücü bulunmaktadır. Böylece biz burada bu yordamı özetleyen ayrıntılı bir protokol, bir roman "tekrarlanan" kan toplama yöntemi geliştirdi ve mevcut var. Bu yöntem, minimal invaziv ve bu nedenle, aynı bireyden elde tekrarlanan kan örnekleme sağlayan zebrabalıkları için çok düşük bir ölüm oranına (% 2.3) elde edilir. Kan örneği maksimum hacim balık vücut ağırlığına bağlıdır. Aralıklarla tekrarlanan kan örneklemesi için hacim kan hemoglobin ölçümleri ile değerlendirildi vücut ağırlığının her hafta ya da ≤1% 2 haftada, bir ≤0.4% olmalıdır. Ayrıca, hemoglobin, açlık kan şekeri, plazma triaçilgliserol (TG) ve toplam cerkek ve dişi yetişkin zebrafish holesterol düzeyleri ölçüldü. Ayrıca diyet indükte obeziteye glikoz metabolizmasının bozulmasına araştırmak için, bu yöntemi uygulanır. Bu kan toplama yöntemi glukoz ve lipit metabolizması ve bir insan hastalık model organizma olarak zebrafish kullanımını artıracak hematolojik çalışmalar da dahil olmak üzere birçok uygulama, sağlayacaktır.
Giriş
Organları ve genetik insanlarda 1,2 benzemektedir, çünkü balığı insan hastalıklarında değerli bir model olarak artan bir popülerlik kazanmaktadır. Gelişimsel biyoloji alanında birçok çalışma zebra balığı ve insan gösteri hematopoiesis 3, hemostaz 4,5 ve myelopoiesis 6 benzerliği işaretli olduğunu göstermiştir. Yetişkin Zebra balığı da bu model organizma hisseleri nedeniyle insan hastalıklarında bozulduğu olanlarla ortak yollar immünolojik 7, nörodejeneratif 8 ve obezite ile ilişkili hastalıkların 9 çalışmak için kullanılır. Obezite ve obezite ile ilişkili hastalıkların (diyabet, karaciğer yağlanması ve alkolsüz steatohepatit ve ateroskleroz) için zebrabalıkları kan şekeri ve lipidler düzeyleri iyice birçok transgenik ve diyete bağlı obezite modellerinde 10-13 araştırılmıştır.
Bireysel hayvanlardan Tekrarlanan kan örneklemesi hayvan kullanımı ve dec azaltacaktırbireyler farklılıkları artma. Ancak, tekrarlanan numune toplama nedeniyle nispeten küçük kan hacmi ve kolay erişilebilir damarların olmaması gibi zebrabalıkları gibi küçük hayvanlarda teknik olarak zordur. Bu yöntemler de dahil olmak üzere öldürücülüğü kendi dezavantajları, olmasına rağmen zebrafish bir defalık kan toplama için çeşitli yöntemler, ilişkili doku hasarı ve sınırlı kan hacmi geliştirilmiştir. Örneğin, 1-5 ul kan dorsal aorta 5 bölgesinde yaklaşık olarak boyuna 0.3 cm bir yanal kesi hasat edilebilir. Göğüs kuşak boyunca keserek makas ile Decapitation 5-10 ul kan 10 toplayabilir. Başka uygun kan örnekleme metodu kuyruk ablasyon 14'tür. Kardiyak delinme aynı balık tekrarlanan kan toplama için tek potansiyel alternatif bir yöntemdir, ancak çok küçük bir miktar bu prosedüre (yaklaşık 50 nl) elde perfor olabilir analizlerin sayısını sınırlar11 med. Bu duruma göre, yeni bir protokol bu organizma insan hastalıkları için standart model organizma için önemli bir ilerleme gerekli olacaktır tekrarlanan öldürücü olmayan kan örnekleme sağlamak için gereklidir. Bu teknik farmakolojik cevabı, moleküler tanı için biyobelirteçlerin, prognoz tayini keşif ve metabolik hastalıklar, dejeneratif hastalıklar ve maligniteler çeşitli türleri gibi çeşitli hastalıkların izlenmesi test etmek için izin verecek.
Bu nedenle Zebra balığı seri 15 kan elde etmek için minimal invaziv bir yöntem geliştirdi. Burada görsel prosedür göstermek ve bu teknik için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntemi kullanarak, çeşitli hemoglobin içeren parametreler, açlık kan şekeri, sağlıklı erişkin zebrabalıkları kanında lipidler dayalı normal değer değerlendirildi. Ayrıca, aynı zamanda, bu yöntem, m seri örnekleri gerektiren çalışmalar için uygun olup olmadığını değerlendiriroverfeeding deneyler sırasında kan glukoz düzeylerinde geçici değişiklikler onitoring.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bütün hayvan prosedürleri Mie Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve uluslararası kurallara Japon hayvan refahı yönetmelik 'Refah ve Hayvanların Yönetimi Yasası' (Japonya Çevre Bakanlığı) göre gerçekleştirilmiştir ve uyulması bulundu.
Needle 1. Hazırlık
NOT: Bütün deneyler anestezi altında gerçekleştirildi ve tüm çabaları acıyı en aza indirmek için yapılmıştır. Ötenazi için, balık ≥20 dakika boyunca (≤4 ° C'de 5 parça buz / 1 kısım su), bir buz-su banyosu içine daldırıldı.
- Bir iğne çektirmesi (Şekil 1A) ile 1,0 mm dış çaplı cam kapiller çekerek cam iğneler microcapillary hazırlayın.
- Oblik ince makas (Şekil 1B) kullanarak iğne uçlarını kesin. 200 mikron (Şekil 1C) - İdeal uç çapı yaklaşık 100 olmalıdır. İpucu Diamete Eğerr çok dar, kan iğne girmeyecektir.
- 5 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar tuzla içinde heparin çözülür.
- Bir aspiratör borusu düzeneğinin burunluk sonunda bir precut iğne yerleştirin ve ağız ağızlık tutun, ya da bir ampul dağıtıcı iğne bağlayın. Heparin çözeltisi içine iğne ucu daldırın ve emme ve çözelti (Şekil 1D ve 1E) ile üfleme iğnesi heparinize.
Not: aspiratör boru montaj Zebra balığı sperm dondurulması 16 kullanılmıştır. Uzun kauçuk tüp ağzına uçan herhangi bir kan durdurabilirsiniz. Tüpün yarıda bir filtre ayarlama tehlikeleri önleyebilirsiniz. - En az 1 saat süre ile 10 cm'lik bir Petri kabı ve hava-kuru heparinize iğneler saklayın. Iğneler çok sayıda önceden hazırlanabilir.
2. Anestezi
- (2-fenoksietanol, 100 ul balık 200 ml su karıştırılarak 2 küçük bir plastik durumda anestezi çözeltisi hazırlayın-PE). Anestezik nihai konsantrasyonu 500 ppm dir.
DİKKAT! 2-PE hızlı bir etkiye sahiptir. - Dolaşım sisteminden balık (AB zorlanma) istenen sayıda kaldırın.
- 2 dakika (Şekil 1F) - 1 Anesteziyoloji içine balık aktarmak için bir net kullanın. 1 dakika içinde hızlı operkulum hareketlerini yavaş yavaş, yüzmek, yatay gasp göğüs yüzgeçleri yayıldı ve sahip balık gözlemleyin.
- Zaman geçtikçe, balık kasanın altında yatıyordu gözlemlemek ve nihayet yüzme durdurun. Balık gasp durur ve operkulum hareketleri yavaş olduğunda anestezi cerrahi uçağı ulaşacak. Bu noktada, balık kan toplama için hazırdır.
- Bir skimmer hafifçe 2-PE anestezi balık kaldırın ve kullanma anestezik (Şekil 1G) ile ıslatılmış kağıt havlu üzerine yerleştirin. Göz kuruluğunu önlemek ve yavaşça başka bir kuru ve yumuşak doku kağıt kullanmak da 2-PE çözeltisi ile ıslatılmış yumuşak doku kağıt ile balığın baş örtüsüvücut yüzeyinden kurulayın.
3. Kan Toplama
- Aspiratör tüp montajı (ya da ampul dağıtıcı) burunluğu sonunda bir heparinize iğne yerleştirin ve ağızda aspiratör borusu düzeneğinin ağızlık ucunu tutun.
- Burunluk ucu bir arada iğne tutun ve dikkatlice iğne ucu ile müdahale ölçekleri kaldırın. Kan toplama sitesine 45 ° açı - 30 de iğne takın. Gastrointestinal sistem (Şekil 1H) bir patlağı kaçının. Yukarıda açıklandığı gibi ampul dağıtıcı kullanılması durumunda, başparmak ve orta parmak ile ampul basın ve ilk parmak ile ampulün ucundaki delik blok, sonra iğneyi.
Not: Kan toplama sitesi dorsal aorta bölgesinde anüs vücut ekseni ve posterior boyunca olduğunu. Dorsal aorta (DA) ve posterior kardinal ven (PCV) omurga ventral sadece (Şekil 2). - Emmek başlayıniğne omurgayı dokunmadan hissettim zaman aspirasyon borusu düzeneğinin sonuna ağızlık. Kan yükselecek etmezse, kan akışını teşvik etmek için elle kurnazca iğne ucu hareket ettirin. Kan iğne içine yükseliyor kez hemen sallayarak durdurun ve yavaşça (Şekil 1i) emmek unutmayın. Ampul dağıtıcı kullanılması durumunda, kan aspire ampul basıncı boşaltın.
- Kan yavaş nedeniyle arteriyel kan basıncının muhtemelen emme olmadan pulsatil bir tarzda iğne içine artacak gözlemleyin. Bu nedenle, iğne doğru arteri nüfuz halinde emmek için gerekli değildir.
- Kanın uygun hacmi toplanır sonra emme durdurun. Balık iğneyi çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için yumuşak doku kağıdı kullanarak ponksiyon sitesine basın. Parmak basıncı 20 sn (Şekil 1J) - yaklaşık 10 sonrası kanama durdurma gözlemleyin.
- Kanama durdurulduktan sonra, derhal bir cle geri balık transferiBir sıcak su (~ 28 ° C) tankı. Yüzmek başlayana kadar yavaşça solungaçları doğru su dönen kurtarmak için balık yardımcı olur.
Not: 2 L tankında 5 postsampling balık tutun ve balık oksijen sirkülasyon sistemine tankı bağlayın. Balık su antibiyotik ilave edilmesi gerekli değildir. Normal konut ve beslenme ile balık koruyun. - Parafilm bir parça (Şekil 1K) temiz bir alan üzerine iğne kan kovmak.
- Herhangi bir ticari el glukometre (Şekil 1 L) kullanılarak kan şekeri ölçün.
Not: Glucometer bir glikoz dehidrojenaz-flavin adenin dinükleotid elektrot kullanır ve 0,6 ul örnek bir hacimde kullanılmasını gerektirir.- Metre içine tamamen bir test bandı takın ve doğrudan kan damlası dokunun. Otomatik olarak test şeridi içine kan beraberlik gözlemleyin ve görüntüleme alanında kan şekeri sonucu 5 sn edinin. Sonucu kaydedin ve test bandını atın. KullanınHer ölçüm için yeni bir test şeridi.
- (isteğe bağlı adım) bir pipetleme kanın doğru miktarda alın ve daha analizler (hemoglobin, triaçilgliserol (TG), total kolesterol, vs.) bir mikrosantrifüj tüp kan transferi. Gerekirse, tuzlu su ile bir balık tam kan seyreltin. RT'de 680 x g'de 3 dakika boyunca kan örnekleri santrifüj ve plazma hasat. Yeni bir tüp içine plazma aktarın. Bu noktada, bu biyokimyasal analizlerde kullanılmak üzere hazırdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
(Şekil 1J <1 mm delinmesi) ve% 2.3 gibi çok düşük bir mortalite oranı veren bu kan toplama yöntemi zebrabalıkları minimal hasara neden olmaktadır. Tek bir balık toplanan ve vücut ağırlığı (Şekil 3) bir ilişki değerlendirilebilir kan maksimum ses incelenmiştir. Biz toplanan maksimum kan hacmi doğrusal vücut ağırlığının (R = 0,813) ile ilişkili olduğunu bulduk. Tek bir balık (vücut ağırlığı = 1,071 g) toplanan kanın en büyük hacmi 25 ul oldu ve en küçük hacmi 0.115 g ağırlığında bir ba...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz seri erişkin zebrabalıkları kan elde etmek için burada ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yöntem gerçekleştirmek için basittir ve günlük olarak laboratuvarda kullanın. Bu kan toplama yöntemi Zebra balığı en dorsal aort içine bir cam kılcal iğne takmadan dayanmaktadır. Bu işlem sırasında, o dorsal aorta arıyor için kriter olduğu için omurgayı baskılamak için dikkatli olmak önemlidir. Omurga yaralanması azaltılması hayatta kalma oranını artıracaktır. Bu teknik, basit ve usta kolay olmasına rağmen, yüksek başarı ve haya...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma JSPS KAKENHI Hibe Numarası 25860294 ve 25590073 tarafından desteklenmiştir. Elle çizilmiş illüstrasyon için Bayan Yui Namie'ye ve zebra balığı bakımındaki yardımları için Bay Koshi Kataoka ve Bayan Sayuri Ichikawa'ya teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Filamentli cam kılcal damarlar | Narishige | GD-1 | 1.0 mm dış çap. |
| İğne çektirme | Narishige | PC-10 | İğneleri üretmek için |
| Heparin | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 081-00136 | Heparinizasyon için |
| Aspiratör borusu tertibatı | Drummond | 2-040-000 | Kan alma için |
| Ampul dağıtıcı | Drummond | 1-000-9000 | Kan alma için |
| 2-fenoksietanol | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 163-12075 | Balığın uyuşturulması için |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm-Hemoglobin | ölçümü için | |
| DRI-CHEM Slaytlar | Fujifilm | Hb-WII | Hemoglobin ölçümü için |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho-Bood | glikoz ölçümü için | |
| Wako L-tipi TG kiti Wako | Saf Kimya Endüstrileri | 464-44201 | ölçüm |
| Wako L tipi CHO kiti | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 460-44301 | Toplam kolesterol ölçümü için |
| Parafilm M | Alcan Ambalaj | PM996 | Kanı dışarı atmak için |
Kaynaklar
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
- Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
- Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474(2012).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
- Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
- Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
- Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708(2014).
- Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
- Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
