Yöntem makalesi

Manyetik Alan (GMF) ve Bitki Gelişimi: GMF İptalleri Etkileri üzerine Araştırılması

14.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53286

⸱

30 Kasım 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

Bu makalede

Özet

Bu protokol, etkili jeomanyetik alanın (GMF) tersine çevrilmesinin diferansiyel gen ekspresyonunu indüklediği ve Arabidopsis thaliana'nın morfolojisini değiştirdiği hipotezini test etmek için bir yöntemi açıklar. Bitki büyüme odasında yapay olarak ters GMF koşulları oluşturmak için üç eksenli sekizgen bir Helmholtz bobin çifti sistemi kullanıldı.

Özet

Bitkilerin evrimi en uyarıcı gözlemlerden biri jeomanyetik alanın oluşumu (GMF) ters (veya geziler) ve Angiospermlerin radyasyon anı arasında bir ilişki olduğunu. Bu GMF polariteli değişiklikler, bitki gelişiminde rol oynayabilir hipotezine yol açmıştır. Burada, biz yapay GMF koşulları tersine için Arabidopsis thaliana'yı teşhir ederek, bu hipotezi sınamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu üç eksenli bir manyetometre ve toplanan veriler GMF büyüklüğünü hesaplamak için kullanıldı. Üç DC güç kaynakları üç Helmholtz bobin çiftleri bağlandı ve GMF şartlarını değiştirmek için bir bilgisayar tarafından kontrol altına alındı. Petri kapları yetiştirilen bitkiler hem normal maruz kalan ve GMF koşulları tersine döndü. Sham uyarı deneyleri de gerçekleştirildi. Exposed bitkiler deney sırasında fotoğraflandı ve görüntüleri kök uzunluğu ve yaprak alanlarını hesaplamak için analiz edildi. Arabidopsis toplam RNA, ekstre edilmiş ve nicel edildiGerçek zamanlı PCR (qPCR) CRUCIFERIN 3 (CRU3), bakır taşıma protein1 (COTP1), Redox Duyarlı Transkripsiyon faktörüne 1 (RRTF1), Fe Süperoksit dismutaz 1 (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal gen ekspresyonu üzerindeki analizleri yapılmıştır Askorbat peroksidaz (TAPX), sitozolik Askorbat Peroxidase1 (APX1) ve NADPH / solunum patlaması oksidaz protein D (RbohD). Dört farklı referans genleri qPCR sonuçları normalleştirmek için analiz edildi. Dört genin en seçildi ve normalleşmesi için en kararlı gen kullanıldı. Bizim verilerimiz üç eksenli bobinleri kullanarak GMF kutuplarını ters bitki büyüme ve gen ifadesi üzerinde önemli etkileri olduğu ilk kez gösteriyor. Bu sonuçta p giden, daha yüksek bir seçici baskı haklı olabilir GMF ters bitki gelişiminde değişiklikleri uyaran katkıda hipotezini desteklemektedirlant evrim.

Giriş

Dünya'nın manyetik alanı (veya eşdeğer jeomanyetik alan, GMF) bitkiler de dahil olmak üzere gezegende yaşayan tüm canlılar için kaçınılmaz bir çevresel faktör olduğunu. GMF her zaman Dünya'nın doğal özelliği olmuştur, bu yüzden evrim sırasında, bütün canlı organizmalar eylemini yaşadı. Kanıtlar giderek artan vücut GMF birçok biyolojik süreçleri 1 etkilemek mümkün olduğunu göstermektedir. GMF üniforma değildir ve Dünya'nın yüzeyinde, büyüklüğü ve yönü önemli yerel farklılıklar vardır. Dünya'nın yüzeyinde GMF az 30 μT neredeyse 70 μT arasında değişen, büyüklükleri geniş bir yelpazede gösterir. GMF magnetosphere 2 aracılığıyla yüklü parçacıkların çoğu saptırma ile güneş rüzgarının öldürücü etkilerinden Dünyayı ve biyosfer korur.

Bitkiler çevresel uyaranlara cevap; ve ışık ve yerçekimi gibi abiyotik faktörlere klasik tepkiler t olmuşturhoroughly adlandırılan phototropic ve gravitropic yanıtları tanımlayarak tarif. Çok az ya da hiçbir şey bu konuda yayınlanmış ve son zamanlarda 1 yorum kağıtları bolluk rağmen, algı ve manyetik alanlar bitki yanıtların mekanizmaları üzerine bilinmektedir. Yerçekimi alanı aksine, GMF böylece son zamanlarda çeşitlendirilmesi ve türleşme 2 bitki katkıda sonunda potansiyel itici güç olarak kabul edilmiştir önemli bir stres faktörü temsil eden abiyotik bitki evrimi sırasında sürekli değişti. Jeomanyetik ters (veya geziler) GMF kutupluluğunda değişikliklerdir. Dünya'nın yaşam tarihi boyunca, GMF ters birkaç kez oluştu. Bunlar her polarite geçişi sırasında azalmış GMF gücü dönemlere gezegeni maruz. Düşük GMF gücü bu geçişler dönemleri böylece bir uyarıcı, yeryüzüne ulaşması güneş rüzgardan iyonizan radyasyon izin olabileceğini Bazı yazarlar hipotez varevrimi 2 bitki lider sonunda gen değişiklikleri ikna etmek için yeterince güçlü olabilirdi canlı organizmalar için tutarlı stres.

Bitkiler üzerinde manyetik alanların etkilerini anlatan deneylerin ayrıntılı bir analiz makul biyofizik etkileşim mekanizmalarının bir eksiklik ile karakterize çatışan raporlar, çok sayıda gösterir. Diğerleri sonuçta 3 inandırıcılıktan uzak olan, bir denenebilir hipotezini eksikliği ve süre birçok deney, sadece gerçekçi değildir. Son yıllarda, bitki manyetik alanların etkisi ilerleme ve araştırma statüsü 2,4-11 gözden geçirilmiştir. Son zamanlarda, hem düşük hem de yüksek manyetik alan etkisi iyice bitki evrimi 2 GMF ters olayların katılımı özel bir odaklanma ile, 1 tartışılmıştır.

En doğrudan aracı GMF ters bitki evrimi bir GMF sentezlenmesi etkileyecek hipotezini kanıtlamak içinNormal ve ters manyetik alan koşullarına bitkilerin tepkisini test ederek laboratuvar ters. Hipotezi test etmek için, biz bu nedenle doğru, normal GMF koşulları tersine için güçlü bir üç eksenli sekizgen Helmholtz bobin-çiftleri manyetik alan kompanzasyon sistemi (üç eksenli bobinler), inşa.

Biz bir model bitki olarak, Arabidopsis thaliana kullanılır ve bazı önemli genlerin gen ifadesi üzerinde ters GMF etkisi test edilmiştir: CRUCIFERIN 3 (CRU3), Trosin-fosforilat olan ve fosforilasyon durumu karşılık olarak modüle edilen bir 12S tohum depolama proteini kodlayan Arabidopsis thaliana tohumları 12,13 yılında ABA için; Toprak Cu edinimi ve polen gelişimi 14 baskın fonksiyonu ile bir ağır metal taşıma / detoksifikasyon süperailesi proteinini kodlayan Bakır Ulaşım Protein1 (COTP1); ve Redoks Responsive Transkripsiyon faktörüne 1 (RRTF1),Bu EAF (etilen tepki faktörü) alt familyası B-3 gen sentezleme yollarının sinerjistik eş aktivasyonunu kolaylaştırır ve abiyotik çapraz tolerans ve biyotik 15 gerilmeler bir AP2 alanını ihtiva EAF / AP2 transkripsiyon faktörü ailesinin bir üyesi kodlar.

Ayrıca biz de oksidatif stres tepkileri ile bağlantılı olan beş genleri analiz: enzimatik ve hızlı bir süperoksit anyonu dönüştüren bir sitoplazmik enzimi kodlayan Fe Süperoksit Dismutase1 (FSD1), (O 2 -) ve su (H2O) hidrojen peroksit (H su ve oksijene 17,18 H nin parçalanmasını 2 O 2 katalize Catalase3 (diğer bir deyişle kodladığını CAT3) ve enzim,, 2 O 2) ve moleküler oksijen (O 2) 16 Thylakoidal askorbat peroksidaz (TAPX) bir kodlayan H 2 O scavenges kloroplastik tilakoit peroksidaz2 19, H2O 2 temizler ve NO türetilen moleküller 20 tarafından aracılık edilen translasyon sonrası modifikasyonların potansiyel hedefler birini temsil sitozolik peroksidazı kodlayan Askorbat Peroxidase1 (APX1); ve O 2 üreten bir enzimi kodlayan NADPH- Solunum patlama oksidaz protein D (RbohD) - ve Arabidopsis 21 büyüme, gelişme ve stres yanıtları düzenlenmesinde önemli rol oynar.

Bizim alan ters metodolojisi GMF ters A. morfolojisi ve gen ifadesinde önemli bir değişiklik uyarabilir ilk kanıt sağlar thaliana kökler ve sürgünler. Bu protokol ro tartışma bitki morfolojisi ve gen ifadesi üzerinde GMF bozma etkisini değerlendirmek için ve bitki davranışının diğer yönlerini GMF bozma potansiyeli etkisini değerlendirmek için kullanılabilir ve böylece rehberlik yenilikçi bir yol sağlarBitki evrimi GMF bozma le.

Protokol

Üç Eksenli Rulo 1. Ayar

NOT: Şekil 1 GMF ters kullanılan üç eksenli bobinler gösterir.

  1. Kimin sonda üç eksenli bobinler eklenir üç eksenli manyetometre, açın.
  2. Veri üç eksenli magnetometer toplanan sağlar magnetometre yazılım bilgisayarınızı açın ve başlatın.
  3. GMF büyüklüğünü hesaplamak için manyetometresi tarafından bildirilen bileşen değerleri kullanın. Manyetometre değerleri ile Mesela,: Bx = 6,39 μT, tarafından = 36,08 μT, Bz = 20,40 μT aşağıdaki eşitlik kullanılarak 41,94 μT bir alan gücünü hesaplar: A, B = B GMF + B ek burada B, ek = (Bx 2 + 2 + Bz 2) tarafından ½ (yani, örneğin 41.9 μT).
  4. Üç DC güç kaynakları (dual aralığı: 0-8V / 5A ve 0-20V / 2.5A, 50W) çevirin üç coupl bağlı her biriHelmholtz bobinleri es ve bir GPIB bağlantısı (Şekil 1B) üzerinden bir bilgisayara bağlı.
  5. Güç kaynakları kümesi gerilimler ters bir manyetik alan vektörü ile istenen manyetik alan üretir. Yeni bir bileşke B üretmek amacıyla, örneğin, adım 1.3 ve burada açıklanan enstrümantasyon bobin boyutu ile gibi B GMF ile V. voltaj set x = 0,00 V, V y = 30.52 V, V z = 0.00 V = B + B GMF üç eksenli bobinleri = (6.38, -36,08, 20.39) μT. yani aynı B GMF olarak büyüklüğü, ancak farklı bir yöne işaret ile yeni bir alan.
  6. 1.3 anlatılan prosedürü kullanarak magnetometre yazılımı ile yeni bir alan doğrulayın.
  7. Hem normal bitkileri Açığa ve bölüm 2'de tarif edildiği gibi Petri plakaları kullanılarak GMF koşulları ters.
  8. Eşit alanın büyüklüğünü tutarak sahte maruziyet deneyler | B GMF | ve tutmaGMF o ama eşit alanın düşey bileşeni alanı ters durumuna göre üç eksenli bobinler eşit akımlarla alan yatay bileşeni yönünü (yani, "Kuzey, Doğu ya da Batı") değiştirilmesi. 1.5 açıklandığı gibi bobinlerin gerilim değiştirerek bunu yapın.
    Not: Bu sahte poz potansiyel ince ısıtma veya iki bobinler titreşim etkilerini kendileri veya bobinleri kontrol etmek için kullanılan elektronik dışarı yönetir.
  9. Veri deneyler kalanını gerçekleştirmek ve / veya sözlü personelinden kör alan koşulları uygulayarak çift kör deneyler çalıştırın.

Bitki Materyalleri ve Bitki Büyüme Şartlar 2. Hazırlık

  1. Arabidopsis thaliana'nın tohumları kullanarak, ekotip Columbia 0 (Col 0), bir 1.5 ml tüp içine daha sonra yer ve yüzey, bir% 5 ile işlenerek sterilize edin (ağırlık / hacim), kalsiyum hipoklorit çözeltisi ve% 0.02 (hac / hac) Triton X-Sürekli çalkalanarak 25-28 ° C'de 10-12 dakika boyunca% 80 etanol (EtOH), 100. Daha sonra% 100 EtOH ile yıkayın,% 80 EtOH ile iki kez yıkayın ve son olarak da steril damıtılmış su ile yıkayın.
  2. Ekleyerek orta modifiye Murashige ve Skoog 22 (MS) 1 L hazırlayın: MS 2,297 g (0.5 x MS temel tuz karışımı), 10 g sükroz, 1 L, KOH ile ayarlanmış pH 5.8-6.0 kadar deiyonize su kadar. 20 dakikada, 120 ° C, agar ve otoklav 16 g ekleyin.
  3. Katılaşma önce, her (120 x 120 mm 2) kare Petri kapları içine orta 80 ml ​​dökün. Mumsu film ile plakaları mühür sonra plaka üzerinde otuz steril tohumlarını ekmeye ve.
  4. Hızlandırabilir ve çimlenme senkronize ve sonra ya normal Petri plakaları maruz veya GMF ters 2 gün boyunca 4 ° C'de karanlıkta yatay plakaları Vernalize.
  5. Üç eksenli bobin içinde ve üç eksenli bobin dışındaki paralel deneylerde dikey konumda 22 ° C'da bir iklim kontrollü bir ortamda tohumları açığaSodyum buharlı lambalar kullanılarak 8 saat karanlık ve 16 saat ışık fotoperiyod takvimi altında (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Lambaların kırmızı bileşeni azaltmak için spot için mavi jelatin filmi kullanın.
  6. Normal (kontrol) hem RNA ekstraksiyon ve ters (tedavi) GMF koşulları önce 10 gün süreyle bitki Açığa.
  7. Maruz kaldıktan sonra, Petri fotoğraflarını çekmek.
  8. Kök uzunluğu ve yaprak alanlarını hesaplamak için ImageJ yazılımı kullanın.
    1. Kısaca, daha sonra Petri plaka ve tam plaka yan haçlar bir çizgi çizmek için "düz" çizgi seçeneğini kullanarak görüntüyü açmak, Petri plakasının tarafını ölçmek.
    2. "Analiz" menüsünde "set ölçek" seçin ve "bilinen mesafe" kutusuna (örneğin, 120 mm), daha sonra uzunluğu (mm) birimini takın gerçek mesafeyi eklemek; nihayet tüm ölçümler için ayarları yapmak "küresel" seçeneğini tıklayın.
    3. Roo içint uzunluğu, serbest aracını kullanarak dikkatlice kök şeklini izleyin. "Analiz" menüsünden "ölçü" seçeneğini kullanarak uzunluğunu ölçün. Resimde tüm kökleri ölçmek ve ileri istatistiksel analizler için dosyayı kaydetmek için devam edin.
    4. Yaprak alanı için, "image" menüsünden seçeneğini ve ardından "renkli eşiği" ayarlamak kullanın. Tek yaprak seçin ve "analiz" menüsünden "parçacıklar analiz" i seçin. Istatistiksel analizler için bireysel ölçümler kaydedin.

3. Arabidopsis Toplam RNA Ekstraksiyon, Kantitatif Real Time PCR (qPCR) Reaksiyon Koşulları ve Arabidopsis için astarlar

  1. Ayrı ayrı 30 sürgünler ve 30 kökleri toplayın ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurarak. Daha sonra havanda sıvı azot içinde öğütün.
  2. Üretici kullanarak bir saflaştırma seti ve RNase-barındırmayan DNase işleme kiti kullanılarak toplam RNA izole edilirer talimatları.
  3. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA nano kiti ve kapiler jel elektroforezi kullanarak örnek kalitesini ve miktarını kontrol edin. Spektrofotometrik RNA ölçümü onaylayın.
  4. Toplam RNA, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak, birinci kol cDNA'ları elde etmek için bir cDNA Ters Transkripsiyon Kit kullanılarak rastgele primerler 2 ug kullanın.
  5. Bir iç yükleme standart olarak ROX ile SYBR yeşil I ile bir Real-Time Sisteminde tüm deneyler.
  6. 2x SYBR Green qPCR Master Mix 12,5 ul cDNA 0,5 ul ve 100 nM primer oluşan karışımın 25 ul reaksiyon gerçekleştirin. Tablo 1'de listelenen primerleri kullanarak. Kontrollerde (genomik DNA kontaminasyonu izlemek için ters transkripsiyon total RNA kullanılarak) non-RT kontrol ve şablon olmayan kontroller (yerine su şablonu) ekleyin.
  7. Standart kullanan tüm primerler çifti astar verimi olarak hesaplanıreğri yöntemi 23.
  8. CRU3, COTP1, RRTF1: Aşağıdaki PCR koşulları kullanarak. 95 ° C de 10 dakika, 95 ° C, 58 ° C 'de 30 saniye ve 72 ° C'de 30 saniyede 15 saniye 40 döngü, UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3 TAPX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 en az 95 ° C 'de, 95 ° C, 57 ° C' de 20 saniye ve 72 ° C'de 30 saniyede 15 saniye 40 döngü.
  9. Her tavlama ve uzatma fazında aşağıdaki floresan okuyunuz. Tüm koşular için, termal profilinde ayrışma segmenti dahil ederek 55 ° C 95 bir erime eğrisi analizi gerçekleştirmek. Ayrışma profili (sıcaklığın bir fonksiyonu olarak floresan arsa) görmek için sonuç sekmesi aracılığıyla erişilen ayrışma eğrisi ekranını kullanın. Deney ayrışma kesimi sırasında toplanan veri kümesi Analiz / Kurulum ekranını kullanarak analiz için seçili olduğundan emin olun.
  10. L belirleyinÜç kez tekrarlanmış, teknik 24,25 analiz üç bağımsız RNA ekstraksiyonlardan cDNA kullanılarak on kat inceltilmiş serileri (1-kat 3 ile 10 arasında) gerçekleştirerek eşik döngüsü değeri (Ct değeri) şablon konsantrasyonunun linear aralığı.
  11. Ct değerlerini elde etmek için Real-Time PCR cihazı yazılımı ile tüm amplifikasyon araziler analiz edin. Kalibre ve aşağıdaki gibi en iyi temizlik genlerin düzeyi ile göreli RNA düzeylerini normalleştirmek: 3.11.1) Sonuçları sekmesinden Arsalar ekranında Amplifikasyon yapın, veri analizi Seçimi / Kurulum ekranını kullanarak analiz edilmelidir hangi rampa veya plato seçin ve sonra komut panelinde Floresan menüden DRN (taban düzeltilmiş normalize floresan) seçin. Örneklenmiş kuyuları için Ct değerleri görüntülemek için Sonuçlar sekmesinden örnek Değerleri ekranı Plate erişin.
  12. Dört farklı referans genleri için [örneğin, sitoplazmik gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz, (GAPC2), ubikitin specific proteaz 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) ve uzama faktörü 1B alfa-alt birimi 2 (eEF1Balpha2)] gerçek zamanlı PCR sonuçları normalleştirmek için. Bir analiz yazılımı 26 kullanılarak gen sırada üst seçiniz; ve normalleşmesi için en stabil gen kullanın.
    1. Kısaca, örnek adlarını içeren gen isimleri ve ilk satırı içeren birinci sütun ile bir Excel sayfasında girdi verileri düzenlemek. Sonra menü çubuğundan analiz yazılımı seçin. Giriş verileri seçmek için iletişim kutusunu kullanın.
    2. Sonra, alanları örnek isimler, gen adlarını ve basit çıktı sadece kontrol ediniz. Analizi gerçekleştirmek için Git düğmesine tıklayın. En stabil dile aday gen olarak (küçük stabilite değerine sahip olan) üst sıradaki geni seçin.
  13. Sürgünler ve kökler hem de farklı kat değişimi ifadesini göstererek arsa verileri.

4. Statistik analizler

  1. Standart hata ± ortalama değerler olarak verileri ifade eder. Co karşılaştırınntrol ve varyans (ANOVA) ve Bonferroni ve Dunn-Sidak Düzeltilmiş Olasılık testi (% 0.95 güven) ile Tukey testi analizi yaparak tedavi grupları.

Sonuçlar

Bu protokolün amacı, set GMF ters kullanılan Şekil 1A gösterildiği gibi jeomanyetik alanın (GMF) ters bitki gelişimi ve Arabidopsis thaliana ekotip Col 0. Üç eksenli bobinlerin gen ifadesini etkileyebilir olmadığını değerlendirmek için bir yöntem sağlamaktır Protokolde aşama 1,5 de tarif edildiği gibi uygun bir tahrik gerilimleri (Şekil 1B), elde edilmiştir. Üç eksenli bobin boyutları ~ birkaç Petri plakaları barındırmak için ters GMF koşulları yeterli boşluk izin 2 x 2 x 2 m 3. Kontroller, aynı çevre koşullarında, normal GMF değerleri büyütülmüştür. GMF koşulları normale maruz 10 gün sonra ve ters, bitkilerin fenotipi belirgin morfolojik değişiklikler göstermiştir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, (normal GMF koşullarında yetiştirilen yani,) kontrol bitkileri belirgin bir şekilde (Dunn-Bonferroni Sidak ve Arındırılmış Prob <0,001 kök uzunlukları göstermiştir;Ters GMF maruz bitkilere göre (17.53 mm N = 32);; Student t = 10.68, df = 31) yüksek değerler (29.41 mm; SEM = 1.04 SEM = 0.58; N = 36). GMF-ters bitkilerde sürgün morfolojisi de yaprak genişlemesinin indirgenmiş gelişme göstererek değiştirilmiştir. Öğrencinin t = 31.32, df normal koşullara maruz kalan bitkiler 4.95 mm 2 (SEM 0.025, N = 54), ters GMF koşullarına maruz kalan bitkiler anlamlı gösterdi oysa (Dunn-Sidak ve Bonferroni Düzeltilmiş Prob = <0.001 ortalama yaprak alanı gösterdi = 53) daha düşük yaprak alanı değerleri (3.71 mm 2, SEM = 0.032; N = 54). Bu nedenle, ters GMF koşulları Arabidopsis maruz kök uzunluğu ve yaprak alanı hem de bir azalmaya neden.

Yaprak genişlemesi ve kök gelişiminin bölünmesi ve hücreler 27 uzama hem de bağlıdır. Bu nedenle, bitki gelişimi, verimlilik ve genel uygunluk 28. Ters GMF koşullarına maruz kalan bitkiler, indirgenmiş kök uzunluğu ve yaprak boyutu manyetik alan yoğunluğu değişimleri algılamak sadece bir sensör sisteminin varlığı mümkün olduğunu hem de gravite ile karşılaştırıldığında manyetik alan "yönünde" değişikliklere cevap vermek. GMF ters bitki büyümesini etkileyebilir hipotez GMF ters koşulları önemli ölçüde bitki gelişimini etkileyebilir olduğunu göstermektedir deneyler, zorlayıcı kanıtlar bulur.

Morfolojik değişiklikler aynı zamanda gen ekspresyonunda değişmeler ile eşlik edilmiştir. Temizlik genler arasında, en kararlı gen uzama faktörü 1B alfa alt birim 2 idi. Genin (CRU3, COTP1, RRTF1) ilk grubu gen ekspresyonunda belirgin bir değişiklik (Şekil 3). Üç genin ekspresyonu anlamlı rezerv maruz bitkilerde yaklaşık 2.5 misli (p <0,05) artmıştır Sürgünd GMF koşulları. CRU3 kök ekspresyonu normal GMF koşullara maruz kalan bitkiler köklerinin yukarı regüle ancak (P <0.05) ters GMF koşulları olarak azaldı belirgin oldu. Ters (Şekil 3), normal koşullarda olarak azaldı ve GMF ters mevcudiyetinde yukarı regüle edilmiştir ve COTP1 RRTF1 için bulunmuştur.

Krusiferin (12 S globulin) A'nın tohumlarda en çok görülen bir depolama proteinidir thaliana ve diğer turpgillerin, ve kaba endoplazmik retikulum içinde bir ön işaret olarak sentezlenir. Daha sonra, protein, depolama vaküol 13 nakledilir. Çimlenme Fide azot bir başlangıç ​​kaynağı olarak kullanılmaktadır krusiferin, parçalanmasını gerektirir. Yük Atma bozulması krusiferin hücre yapılarını ya da hücre bileşenleri geliştirme 29,30 bozarak embriyoların gelişimi azaltır. Sonuçlarımız CRU3 üst ayarlanması ile ilişkili olduğunu göstermektedirböylece aşırı ekspresyonu GMF ters ve bu hassas, bu gen, bitki gelişiminin azalmaya neden olabilecek belirten bir alt kanat genişlemesi ve daha düşük bir kök uzunluğu. Ayrıca, GMF ters azaltılmış kök uzunluğu ile ilişkilidir köklerinde CRU3 önemli bir down-regüle, uyarmaktadır. Bakır bitkilerde önemli süreçler için temel kofaktör, ancak aşırı zararlı etkiler; Böylece, bakır taşıma fazla sentezleyen bitki büyümesini taviz. GMF bozma etkisi dolayısıyla azaltılmış bitki gelişimini açıklayan sürgün ve kökleri hem COTP1 önemli bir aşın oldu. İyon stres sıkıca hücrenin redoks durumuna bağlıdır kloroplast metabolizması, bozar. Arabidopsis olarak transkripsiyon faktörü RRTF1 31 değişikliği redoks ayarlamak yeteneği ilişkili genlerin ekspresyonu için önemlidir. Bu nedenle, ne zaman bitkiler fizyolojik ve gelişimini değiştirmek mümkün dış uyaranlara maruzal programları bu önemli transkripsiyon faktörünün bir aşın bekleniyor. GMF iptali böylece ters GMF koşulları bitkilerin yüksek oksidatif stres tepkileri gösteren sürgünler ve kökler hem RRTF1 önemli bir aşın kaynaklı.

Ilginç sonuçlar oksidatif stresi dahil beş genleri analiz edilerek elde edilmiştir. Genel olarak, sürgünler çıkarılan ve analiz tüm genlerin bitkiler normal yetişen veya GMF koşulları (Şekil 4 ve Şekil 5) tersine dönmüş önemli farklılıklar (P> 0.05) yoktu. Bununla birlikte, önemli bir aşağı-regülasyon, her zaman ters GMF koşullarına maruz kalan bitkilerin kökleri gözlenmiştir. Özellikle, CAT3 (Şekil 5), APX1, FSD1, RBOHD ve TAPX (Şekil 4) ile aşağı doğru düzenleme sırasına ardından yüksek down-regüle göstermiştir.

Bir Çapraz toleransbiyotik ve biyotik stres biyokimyasal yollarla ilgili farklı genlerin aktivasyonu ile sağlanır. RRTF1 transkripsiyon faktörü, bu yolların 15,31 gen ekspresyonunun sinerjistik eş aktivasyonunu kolaylaştırır, ve potansiyel olarak oksidatif stres 32 dahil edilebilir. Oksijen tutucu azalır, bu nedenle, RRTF1 yukarı-regülasyonunun beklenmektedir. Kök kirleticilerin alınmasına yönelik enzim baskılanması artan oksidatif strese tepki olarak hareket eden RRTF1 yukarı regülasyonu ile ilişkilidir. CAT3, APX1 ve TAPX dramatik kök downregülasyonu FSD1 azalma ile süperoksit anyon dismutate yeteneğinde azalma eşlik eder H 2 O 2, temizlemek için kök hücreleri azalır yeteneğini gösterir. Oksidatif stres yanıtları ters GMF algı ana site gibi görünen kökleri, daha yüksektir.

figure-results-1
Şekil 1. jeomanyetik alan Tazminat sistemi. (Üç dikey eksenin her biri için sekizgen bir çift bobini içerir) (A) üç eksenli rulolar yer manyetik alanın vektör tersine çevirmek için kullanılabilir. (B) bir bilgisayar kontrollü güç kaynağı Helmholtz bobinleri her bir çiftine bağlanmıştır. (Bu rakamlar Gerilimler keyfi) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil Arabidopsis morfolojisi jeomanyetik alan bozma 2. Etkileri. Pozlama, kontrol bitkilerinin on gün sonra (normal GMF koşullara maruz kalanlar, yani) anlamlı olarak daha fazla kök uzunluğu ve daha Expan göstermekded bildiriler ters GMF koşullarına maruz kalan bitkiler ile karşılaştırıldığında. Metrik bar = 18 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil Arabidopsis gen ifadesi üzerinde jeomanyetik alan bozma 3. Etkileri. Maruz kalma on gün sonra, kontrol ve tedavi edilen bitkilerin toplam RNA ekstrakte edildi ve ekspresyon analizi için gerçek zamanlı PCR ile analiz edildi. . COTP1, Bakır Taşıma Protein1;, RRTF1, Redoks Duyarlı Transkripsiyon faktörüne 1 GMF tersine etkisi CRU3, krusiferin 3, test edilen tüm genlerin gen ifadesi ciddi bir değişikliğe neden oldu. Barlar standart hata gösterir; yıldızlarla pl arasında anlamlı (p <0.05) farklılıklar gösterirters ve normal GMF şartlara maruz karıncalar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil Arabidopsis antioksidan ilgili gen ifadesinin üzerinde jeomanyetik alan bozma 4. Etkileri. Maruz kalma on gün sonra, kontrol ve tedavi edilen bitkilerin toplam RNA izole edildi ve Gerçek Zamanlı PCR kullanılarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır. GMF tersine etkisi sürgün gen ifadesinde anlamlı değişikliklere neden oldu; Bununla birlikte, ciddi bir aşağı doğru düzenleme ters GMF koşullar altında yetiştirilen bitkilerin kök gen ekspresyonu gözlenmiştir TAPX, Thylakoidal Askorbat Peroksidaz;. APX1, Askorbat Peroxidase1; FSD1, Fe Süperoksit Dismutase1; RbohD, NA. DPH / Solunum patlama oksidaz protein D Barlar standart hata gösterir; yıldız ters ve normal GMF şartlara maruz bitkiler arasında önemli (P <0.05) farklılıklar gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
Şekil Arabidopsis Katalaz 3 (CAT3) gen ifadesi üzerinde jeomanyetik alan bozma 5. Etkileri. Maruz kalma on gün sonra, kontrol ve tedavi edilen bitkilerin toplam RNA izole edildi ve Gerçek Zamanlı PCR kullanılarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır. GMF tersine etkisi sürgün gen ifadesinde anlamlı değişikliklere neden oldu; Bununla birlikte, ciddi bir aşağı doğru düzenleme ters GMF koşullar altında yetiştirilen bitkilerin kök gen ekspresyonu gözlenmiştir. Barlar standart Erro gösterirr; yıldız ters ve normal GMF şartlara maruz bitkiler arasında önemli (P <0.05) farklılıklar gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Biz son zamanlarda inanılmaz bir korelasyon GMF ters ve ailesel Angiosperm soyları çoğunun derivasyon 2 oluştu zaman arasında var olduğunu gösterdi. Ancak, GMF ters kendisi bitki gen ifadesi ve morfoloji önemli değişiklikler neden olabilir uyarıcı hipotezler ve çeşitli GMF şiddetlerinde etkisi üzerine yapılan çalışmaların bolluğu, varsayım rağmen gösterilmiştir olmamıştı. Burada, ilk kez için, laboratuarda GMF tersine çevirmek için üç eksenli sekizgen Helmholtz bobini kullanan ve çevre manyetik alanın tersine fenotipik değişiklik ve bitkilerde gen ekspresyonunun modüle edilmesine neden olduğu bir yöntem göstermektedir.

Bitki büyüme deneylerinde (2 x 2 x 2 m 3) için yeterli bir hacmi üzerinde GMF ters (veya değiştirilmesi) elde etmek için, biz sekizgen Helmholtz bobin sistemi kurdu. Bu sistem (genellikle Helmholtz bobinleri halka şeklinde ve daha küçük olan) ticari olarak mevcut değildirve inşaat maliyetleri önemli idi. Önemlisi, bu sistem değiştirilmiş manyetik alanlarda olağanüstü zaman istikrar ve homojenlik ile sağlam alan değişikliği sağlıyor.

Sistem normal şartlarda bir binde GMF değerini azaltmak veya manyetik alanın üç boyutlu herhangi tersine tasarlanmış ve inşa edilmiştir. Ancak, ruloların tasarımı, yüksek bir manyetik alan gücünden oluşturmak için izin vermez. Bu nedenle, bu biçimde, bu cihaz ya da diğer organizmalar bitkiler yüksek manyetik alan gücü etkisini değerlendirmek için tasarlanmıştır deneyler için uygun değildir.

Laboratuarda, bu yöntemde tarif edilenlere benzer GMF değiştirilmesi manyetik alan sapma ve metal kendi içinde onları konsantre yüksek manyetik geçirgenliğe sahip ferromanyetik metal levhalar, deneysel bölgeyi çevreleyen tarafından koruyucu dahil olmak üzere farklı yöntemlerle elde edilmiştir. ThHelmholtz bobinleri kullanılarak e avantajı, sistemin bu nedenle sadece in vitro çalışmalar için (Petri kaplarının kullanımı ile ilgili olarak) doğru değil, aynı zamanda yapım bitkiler daha doğal koşullar (ışık, hava dolaşımı, vs.) maruz kalmasına olanak sağlamasıdır in vivo bitki büyüme ve gelişme deneyler için. Sistemimizde boyutları, böylece birkaç Petri plakaları veya bazı küçük ev sahibi için izin (Şekil 1A bakınız) 25 x 25 x 25 cm3 küresel bir hacim boyunca doğal GMF <1 / 1000. a kadar bastırma izin veren bir boşluk oluşturmak bitki büyümesi için tencere.

Burada sunulan yöntem, bitki biyolojisi çalışmaları uygulanmıştır; Bununla birlikte, sistem viroloji, mikrobiyoloji içeren deney geniş bir yelpazede izin verir, hem de nematodlara (örneğin Caenorhabditis elegans), böcek ve (fareler ve sıçanlar da dahil olmak üzere), küçük hayvanlar üzerinde çalışmaları. Bu nedenle, hipotez testleri GMF bu ters yapabiliyormorfolojik ve transkripsiyonel değişiklikler de belki sonuçta hatta insan hücrelerine, diğer pek çok canlı sistemler için uzun olabilir ikna etmek.

GMF sürekli değişen ve dalgalanıyor. Bu nedenle, deneylerde bir meydan okuma istenen yeni GMF değerlerini elde etmek için GMF sabit bir telafi sağlamaktır. Bu yalnızca manyetometre değerleri ve gerilim telafisi okunması üzerinden manyetik alan değerleri sürekli bir kontrolü ile elde edilebilir. Bu nedenle, sistem GMF yavaş yavaş değişen bir bölümünü telafi edebilirsiniz ama yüksek frekans dalgalanmaları için hiçbir şey yapmaz.

Sonuç olarak, vektör GMF ters üç eksenli bobinlerinin kullanımı GMF vektörünün bu bitki ters morfolojik değişiklikler ve farklı gen ekspresyonunu başlatmak için mümkün olduğunu göstermek için etkili oldu. Sunulan yöntem ile elde edilen sonuçlar hipotezi GMF yeniden destekleyen bir zorlayıcı kanıtevrenselleri jeolojik zaman ölçekleri üzerinde 2 bitki gelişimi için itici güçlerden biri olabilirdi.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, İtalya'daki Torino Üniversitesi Yaşam Bilimleri ve Sistem Biyolojisi Bölümü'nden MEM'e verilen bir hibe ile desteklenmiştir. Yazarlar, bazı deneyler sırasında teknik yardım için G. Gnavi'ye teşekkür eder. TO, Wellcome Trust ve Royal Society tarafından finanse edilmektedir (Hibe Numarası 098436/Z/12/Z).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Üç eksenli manyetometreBartington Mag-03MCüç eksenli fluxgate manyetometre
Manyetometre güç kaynağıBartington ve nbsp;Mag-03PSUüç eksenli fluxgate manyetometre
Manyetometre yazılımıBartington Mag03DAMüç eksenli fluxgate manyetometre
DC güç kaynağı Agilent TechnologiesE3642A
Kalsiyum hipoklorit Sigma211389
Triton X-100 SigmaX100 
Etanol Sigma2860
GroLux Sodyum buharlı lambalar OSRAM Sylvania600W
RNeasy Bitki RNA kiti Qiagen74903
RNaz İçermeyen DNase Qiagen79254
Agilent 2100 BiyoanalizörAgilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000 ve nbsp;Thermo Fisher Scientificmevcut
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti Uygulamalı Biyosistemler4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas International, IncK0221
ParafilmSigmaP7793-1EA
Murashige ve Skoog Bazal OrtaSigmaM5519  
Petri kabı kare (120 x120 mm2)SigmaZ692344 
değil

Kaynaklar

  1. Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
  2. Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
  3. Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
  4. Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
  5. Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
  6. Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
  7. Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
  8. Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
  9. Pazur Galland, P., A, Magnetoreception in plants. J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).
  10. Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
  11. Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
  12. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
  13. Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
  14. Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
  15. Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).
  16. Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
  17. Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
  18. Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
  19. Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
  20. Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
  21. Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
  22. Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  23. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
  24. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  25. Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
  26. Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
  27. Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
  28. Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
  29. Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
  30. Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
  31. Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
  32. Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Jeomanyetik Alan TersinmesiHelmholtz BobinleriGen fade AnaliziBitki B y me l mKantitatif Ger ek Zamanl PCRK k Uzunlu u AnaliziYaprak Alan l mManyetik Alan MaruziyetiReferans Gen Normalizasyonu

İlgili makaleler