Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

7.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53300

⸱

15 Haziran 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology, Davidoff Cancer Center, Rabin Medical Center, 2The Center of Nanoscience and Nanotechnology, Tel Aviv University, 3Experimental Therapeutics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

Burada, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünü hedefleyen küçük firkete (sh)RNA ile hücreleri transfekte ettikten sonra, kamuya açık verileri, hesaplama kaynaklarını ve mikroRNA dizilerinden elde edilen yüksek verimli verileri kullanarak, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünün mikroRNA transkriptomu üzerindeki etkisini incelemek için bir strateji öneriyoruz.

Özet

Protein kodlayan genlerin transkripsiyon düzenlemesi fazla çalışılan iken, çok az, özellikle mikroRNA, transkripsiyon faktörleri kodlayıcı olmayan RNA'lar, transkripsiyona dahil bir şekline göre bilinmektedir. Burada, kamuya açık verileri, hesaplama kaynakları ve yüksek verimli verilerini kullanarak microRNA transkripsiyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörü potansiyel rolünü incelemek için bir strateji önermek. Biz transkripsiyon faktör bağlanma siteleri ile zenginleştirilmiş microRNA destekleyicileri tanımlamak için ENCODE projeden -sequencing verileri microRNA promotör ve kromatin immünopresipitasyon (chip) tanımlamak için H3K4me3 epigenetik imza kullanın. ShRNA ilgi transkripsiyon faktörü hedef ve mikroRNA diziye hücreleri tabi olan ilgi hücreleri transfekte, biz microRNA transcriptome bu transkripsiyon faktörünün etkisini araştırmak. bir örnek olarak kronik ly mikroRNA transcriptome üzerinde STAT3 etkisi üzerine çalışmamızı kullanınmphocytic lösemi (CLL) hücre.

Giriş

MikroRNA'lar tipik posttranskripsiyonel düzeyde mRNA ifadesinin negatif regülatörleri işlev endojen küçük olmayan kodlama düzenleyici RNA vardır. Yaklaşık 1.000 kodlayıcı olmayan uzun mikroRNAlar insan genomunda 1,2 bulunur 20 nükleotid 25. MikroRNA'lar genellikle 3 'çevrilmemiş bölge, hedef mRNA (UTR) yer almaktadır microRNA ve tamamlayıcı tohum uyumlu sekans, tohum sırası arasında standart baz eşleştirme yoluyla gen ekspresyonunu düzenlerler. Toplu olarak, mikroRNAlar proteini kodlayan genlerin 3 fazla% 30 düzenleyen ama çok az mikroRNA DNA transkripsiyonu şey bilinmektedir. MikroRNA transkripsiyon regülasyonu, mRNA, 4,5 benzer olduğu ileri sürülmüştür. Özellikle, bir protein kodlayan genlerin transkripsiyonunu teşvik aktivitesine benzer transkripsiyon faktörleri mikroRNA 6 transkripsiyonunu aktif hale getirmek için düşünülmektedir. Transkripsiyon faktörü microRNA etkileşim gen ifadesinin 7 bir modülatör faktörü olarak rapor edilmiştir ve may da geri besleme ve beslemeyi ileri döngüler oluşturur. Örneğin, Yamakuchi ve ark., P53 sırayla p53 represör SIRT çevirisini ve böylece p53 aktivitesinin 8 artan inhibe microRNA34a ekspresyonunu indüklediği bir geri besleme döngüsü bildirilmiştir.

microRNA transkripsiyon faktörü bağımlı ifade spesifik örnekler rapor edilmiştir Oysa, ilgi transkripsiyon faktörü microRNA-transcriptome ifadesini düzenleyen hakkında bilgi sağlayan bir kabul gören bir yöntem yoktur. Burada önerilen protokolün amacı microRNA-transcriptome transkripsiyon faktörü bağımlı düzenleme derinlemesine bir açıklamasını sağlamaktır. kamuya açık verileri, biyoinformatik araçları birleştiren ve mikrodizi teknolojisi kullanılarak, bu algoritmayı aşağıdaki araştırmacılar genomik ölçekte yakalamak mümkün olacaktır nasıl herhangiilgi herhangi bir hücre tipinde transkripsiyon faktörü mıkroRNA-transcriptome ifadesini düzenleyen ve mikroRNA ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyon faktörü mRNA'nın varsayılan bir katkı keşfetmek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Veri Madenciliği Yaklaşımı ile MicroRNA Genler Promoter transkripsiyon faktörü Cilt Siteleri Belirlemek

  1. DNA elemanı (ENCODE) projesi Ansiklopedisi parçası olarak üretilen kromatin immünopresipitasyon (ChIP) dizi veri ayıklamak için California Üniversitesi Santa Cruz (UCSC) genom tarayıcı kullanın.
    1. UCSC genom tarayıcıda tablo tarayıcınızı açın.
    2. tablo ayıklamak için aşağıdaki özelliklere kullanın: CLADE: (Memeliler), genom: (Insan), Montaj: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), grubu: (düzenleme), parça (TxnFactorChIP), masa: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), bölge : (Genom), çıkış biçimi (seçilen tablodan tüm genler).
    3. .txt dosyası olarak ve bir elektronik tabloya 1.1.2 çıktı kaydedin.
    4. Çevrede transkripsiyon faktörü (örneğin, STAT2) için sıralama ve filtre.
  2. Baeer ark mevcut H3K4me3 epigenetik imza dayalı microRNA rehberleri listesini kullanın. 9 . bir .txt dosyasına bu listeyi kopyalayın.
  3. , Insan genomu üzerindeki koordinatlarına göre maç (örneğin, STAT3 varsayılan microRNA rehberleri bağlayıcı) 1.1 ve 1.2 veri harita ve dosyayı 1 kodlama tamamlayıcı belirtildiği gibi keskin C yazılı kodu kullanarak ortanca bağlanma eğilimini belirlemek için.

2. Kullanım ShRNA İlgi bir transkripsiyon faktörünün ifadesi aşağı düzenler

  1. Plaka, yaklaşık% 50 izdiham (DMEM,% 10 FBS), 10 cm plaka 293 insan embriyonik böbrek hücre çizgisi, 1.5 x 10 6 hücre.
  2. shRNA içeren yeşil floresan proteini (GFP) lentivirüs 5 ug 293 insan embriyonik böbrek hücre çizgisi transfect hücreler, ilgilenilen transkripsiyon faktörü ile ilgilidir ve paketleme vektörlerinin 5 ug üreticinin protokolüne uygun olarak yapışık hücreler için transfeksiyon reaktifi kullanılarak.
  3. Bir kontrol olarak, 293 insan embriyonik böbrek hücre çizgisi hücreleri transfekteshRNA ve imalatçının protokolüne göre ambalaj vektörleri karıştırılmış.
  4. (37 ° C, CO2 inkübatör de) 16 saat hücrelerde transfeksiyon karışımı tutun sonra% 10 FBS ile taze,% 10 DMEM ortamı 10 ml bir ortam.
  5. 48 saat sonrası transfeksiyon bekleyin hücre kültürü (300 xg 5 dak) santrifüj ve bulaşıcı süpernatant toplamak. herhangi bir kayan hücrelerin çıkarılması için 0.45 um'lik bir şırınga filtresinden (25 mm yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat membran) süpernatanın filtre.
  6. süpernatant Konsantre ve 100 kDa eşiğinde olan bir ultrasentrifugal filtre cihazı kullanılarak lentivirüs toplamak. 30 950 xg'de Spin - hacim kadar 60 dakika daha az 250 ul konsantre olmuştur. -80 ° C'de konsantre edildi virüs saklayın.
  7. lentivirüs hücreleri transfekte. -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş lentivirüs çıkarın ve oda sıcaklığına kadar Çözülme. taze bir 1.5 ml mikrofüj tüpe, viral süpernatanın 100 ul aktarın.
    1. Bring kadar düşük serum ortamı ile 1 ml tüp içinde hacim. 10 ng / ml nihai konsantrasyon 1 mi virüs süspansiyonu heksadimetrin bromit ekleme yavaşça karıştırın ve karışım 5 dakika boyunca bekletin.
  8. Santrifüj 5 x 10 6, her transdüksiyon için hücreler yavaşça virüs içeren ortam, 0.5 ml hücre pelletini. sonra% 10 FBS nihai bir konsantrasyona kadar% 20 FBS ile 0.5 ml ortamda ekleyin - 24 saat hücreler 4 inkübatöre kalsın.
  9. 48 ila 72 saat beklemek ve propidyum iyodür (PI) ve üreticinin talimatlarına uygun olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ve hücreleri leke. Işıktan hücreleri korur ve GFP + / PI oranlarını ölçmek için bir FACS sıralayıcı kullanın - hücrelerdir. PI lekeleri sadece ölü hücrenin bu yana, bu oran canlı hücrelerin transfeksiyon verimliliği bir tahmindir.
  10. Daha önce 10 açıklandığı gibi FACS sıralayıcı ile GFP (GFP +) pozitif hücre popülasyonunu sıralayın.
  11. Kullanım WesteRn immün lekeleme, daha önce önce belirlenmiş shRNA ile (örneğin, CLL hücreleri) ilgi hücreleri enfekte sonra ilgi konusu bir transkripsiyon faktörünün seviyelerini belirlemek için 10 tarif.

3. Transkripsiyon Faktör-shRNA ile transfekte edilen hücrelerde mikroRNA transcriptome ifade seviyelerini belirlemekte

  1. RNA, imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit kullanılarak izole edilir.
  2. RNA Etiket ve mikroRNA mikroarray 11 o melezleşme.
  3. Transkripsiyon faktörü-shRNA veya boş vektör kontrolleri 5 ile transfekte hücrelerde farklı şekilde eksprese mıkroRNA belirler.
  4. PCR 5 gerçek zamanlı kullanarak en farklı şekilde eksprese microRNA için mikroarray sonuçları doğrulayın.

4. Transkripsiyon Faktörü Bağımlı transkriptom nitelendiren içinde Biyoinformatik ve shRNA Yaklaşımı arasındaki örtüşme belirleyin

  1. dettransfekte hücreler kendi rehberleri siteleri bağlanma transkripsiyon faktörü liman ve transkripsiyon faktörü-shRNA olarak azaldı microRNA genlerinin beklenen ve gözlenen oranları ermine aşağıdakileri yapın:
    1. 1.3 oluşturulan listeden kendi organizatörü / toplam microRNA ilgi transkripsiyon faktörü barındıran genlerin oranı elde. Bu liste (örneğin, STAT3 bağlama siteleri / toplam microRNA genleri ile microRNA genleri = 0.25 test) beklenen oranıdır.
    2. 3.3 oluşturulan listeden transkripsiyon faktörü-ShRNA transfekte hücrelerde downregüle VE 1.3 oluşturulan listeden faiz bağlayıcı sitelerin transkripsiyon faktörü vardır edildi genlerin sayısını belirler. Downregüle genlerin Bu sayı / toplam sayısı gözlenen oranı (örneğin, downregüle microRNA STAT3 bağlayıcı siteleri / toplam sayısı = 0.6 ile microRNA genleri).
  2. Yukarıda oluşturulan gözlenen ve beklenen oranları karşılaştırarak transkripsiyon faktörü-shRNA transfekte edilmiş hücreler olarak azaldı genlerin listesi, promotör transkripsiyon faktörü bağlama bölgeleri ile zenginleştirilmiş olup olmadığını belirlemek için istatistikleri χ2 kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

STAT3 tipik olarak anti-apoptotik ve proliferatif etkilere 12 olan genlerin transkripsiyonu uyaran bir transkripsiyon faktörüdür. İster STAT3 da kodlamayan RNA transcriptome bilinmemektedir etkiler. Tüm KLL hücrelerinde STAT3 serin 707 artıkları 10,13 üzerinde yapısal fosforile olduğunu. Çekirdeğe fosfoserin STAT3 servisleri, DNA'ya bağlanır ve diğer hücre tipleri 10 tirosin pSTAT3 ile aktive edileceği bilinen bir gen aktif hale getirir. CLL mikroRNA ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Protein kodlayan genlerin RNA polimeraz II bağımlı transkripsiyonu altında yatan mekanizma yoğun çalışmalar olmuştur. Bu elemanlar sadece% 1'ini oluştururlar iken - İnsan genomunun% 2, ENCODE projeden kanıtlar, insan genomunun% 80'in üzerinde transkripsiyonu 17 uğrayabileceği ne kodlamayan DNA elemanlarının transkripsiyonunu düzenleyen düşündürmektedir büyük ölçüde bilinmemektedir 6 .

Pol II, aynı zamanda mikroRNAlar 6 dahil olmayan bazı protein kodla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma KLL Küresel Araştırma Vakfı tarafından sağlanan hibe ile desteklenmiştir. Texas MD Anderson Cancer Center Üniversitesi Kanser Merkezi Destek Hibe (P30CA16672) aracılığıyla Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri11668027
0.45 ve mikro; m şırınga filtresiThermo Scientific (Nalgene)190-2545
100 & nbsp eşikli Amicon ultrasantrifüj filtre cihazı; kDaMerck Millipore
PolibreneMerck MilliporeTR-1003-G
TRIzol reaktifiYaşam Teknolojileri (Invitrogen)15596-026
293 Hücre hattı insanSigma-Aldrich85120602

Kaynaklar

  1. Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
  2. Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  4. Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
  5. Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
  6. Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
  7. Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
  8. Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
  9. Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
  10. Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
  11. Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
  12. Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
  13. Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
  14. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
  15. Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
  16. Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
  17. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
  18. Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
  19. Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
  20. Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Transkripsiyon Fakt r Reg lasyonuH3K4me3 Epigenetik mzasChIP SekanslamashRNA TransfeksiyonuMikroRNA DizisiSTAT3 NakavtiKronik Lenfositik L semiWestern BlottingKantitatif RT PCR
MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.