Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

9.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53302

⸱

5 Ocak 2016

1Department of Biological Sciences, St John's University

Bu makalede

Özet

Mevcut rapor, Leishmania hücre ekstraktları kullanılarak fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivitesini ölçmek için in vitro enzimatik bir testi açıklamaktadır. Bu tahlil, bir radyoaktif metil grubunun S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden endojen fosfatidiletanolamin üzerine transferine dayanmaktadır.

Özet

Fosfatidiletanolamin metiltransferazlar, bir veya daha fazla metil grubunun (gruplarının) S-adenosil-L-metiyoninden fosfatidiletanolamin, monometil-fosfatidiletanolamin veya dimetil-fosfatidiletanolamin üzerine transferini katalize eden biyosentetik enzimlerdir. Bu enzimler hayvan hücrelerinde, mantarlarda her yerde bulunur ve ayrıca bakterilerin yaklaşık% 10'unda bulunur. İnsülin direnci, diyabet, ateroskleroz, hücre büyümesi veya virülans gibi lipid metabolizmasındaki doğrudan rollerinin ötesinde hücre fizyolojisinde çeşitli önemli işlevleri yerine getirirler. Bu el yazması, bir enzim kaynağı olarak tam hücre ekstraktları kullanılarak tritiye metil gruplarının S-[Metil-3H]adenosil-L-metiyoninden fosfatidiletanolamin üzerine transferini ölçen basit bir hücresiz enzimatik test hakkında rapor vermektedir. Elde edilen metillenmiş fosfatidiletanolamin formları hidrofobiktir ve bu nedenle organik ekstraksiyon ile suda çözünür S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden ayrılabilir. Bu test potansiyel olarak diğer hücre tiplerine uygulanabilir ve enzimi saflaştırmaya gerek kalmadan ilgilenilen bir fosfatidiletanolamin metiltransferaza özgü inhibitörleri/ilaçları test etmek için kullanılabilir.

Giriş

Fosfatidiletanolamin metiltransferaz (PEMT) PEMT enzimler monometil-PE, dimetil-PE ve / veya vermek için PE, monometil-PE veya dimetil-PE üzerine metil grubu donörü S -adenosylmethionine (SAM) ile bir veya daha fazla metil grubu kovalent bağlanmasını katalize eden bir fosfatidilkolin (PC). Bu enzimler, hayvan hücreleri ve mantarlar hemen hemen her zaman görülmektedir. Ayrıca, bazı bitkilerin 1 ve bakterilerin yaklaşık% 10, ökaryotlarda 2 ile etkileşim özellikle bulunabilir.

PEMTs değil, aynı zamanda diğer önemli hücresel fonksiyonları yerine getirerek hayvan hücrelerinde ana lipid sınıf PC, üretimine katkıda bulunarak hücre biyolojisine alakalı. Memelilerde, PEMTs esas olarak çok düşük yoğunluklu lipoprotein normalin üzerinde bir salgılama için gerekli olan karaciğer olarak ifade edilmiştir ve ayrıca diyet indükte obeziteye 3, ateroskleroz 4 katkıda bulunur ve insülin karşıance 5. Buna ek olarak, bir memeli PEMT da her ne kadar düşük seviyelere, adipositler ile ifade edilmiştir ve yağ depolanması 6, 7 katılırlar. Kanser gelişimi 8, 9 apoptoz ve hücre büyümesi 10'da PEMT rolü de ortaya konmuştur. Bakterilerde PEMT enzimler ana bitki 11, normal hücre çoğalması 2, virülans 2 ve simbiyoz için önemli olduğu gösterilmiştir.

Mevcut protokolün amacı ve gerekçesi enzimi arındırmak gerek kalmadan bütün hücre ekstrelerinden PEMT aktivitesini ölçmektir. İki farklı protokoller PEMT aktivitesini ölçmek için, geliştirilmiştir. İlk ve en yaygın olanı, bu makalenin konusu olan PE, üzerine radyoaktif SAM trityumlu metil grubunun transferini ölçer. Bu protokol, ilk olarak bir underst elde etmek için maya 12 ve memeli hücrelerinde (karaciğer) 13 den PEMT aktivitesini ölçmek için, geliştirilmiştirBu hücrelerde PC biyosentezinin anding yanı sıra, bu enzim özgüllüğünü belirlemek için. Daha sonra, bu teknik ve tek hücreli parazitlerin 14 (15 olsa deneyi için bir bazik pH değeri kullanılarak) bu tür bakteri 2 gibi diğer hücre tiplerinde uygulanmıştır. Bu teknik, bütün hücre hülasaları hem de saflaştırılmış enzim ile birlikte kullanılabilir ve potansiyel olarak herhangi bir hücre ekstresi sistemine uygulanabilir. Olmayan bir radyoaktif deneyi de S -adenosylhomocysteine, SAM 16 metillenmenin ürünün enzimatik miktarının dayandığı dizayn edilmiştir. Bu radyoaktivite içermeyen olarak ikinci deney daha uygun olabilir ancak saflaştınldı enzimler için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Özüt Hazırlama

  1. 20 mM HEPES pH7.4, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 5 ug / ml heme 100 ug ile takviye edilmiş M199 1 x yapılmış bir ortam içinde 26 ° C 'de hava geçirmez kapak ile sızdırmaz steril plastik şişe Leishmania hücreleri büyümek çalkalamadan, 0.35 g / L NACO 2H, 0.1 mM adenin, ve 2 ug / ml biopterin. Bunlar 1-2 x 10 7 / ml'lik bir hücre yoğunluğuna ulaştığında 4 ° C 'de 5 dakika süre ile 1500 g'de santrifüje edilerek hücreler hasat.
  2. Bir pipet ile süpernatant atılır ve soğuk fosfat tamponlu serum fizyolojik kültürün hacmi (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI yarısı bir serolojik pipet hücre topağın tekrar askıda bırakılmasıyla yıkama hücreleri, 10 mM Na-2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4). BL2 güvenlik kurallarına göre hücre süpernatantlar bertaraf edin.
  3. Hücrelerin tekrar santrifüj 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 g'de. Bir pipet ile süpernatant atın. T Devamya da bir sonraki adıma o -80 ºC (üç ay) uzun süreli saklama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak oturtun.
  4. 2x lizis tamponu (0.5 M sukroz, 0.1 M TrisHCl, pH 7.5, 2 mM EDTA ve 2 x proteaz inhibitör kokteyli) hazırlayın ve buz üzerinde 4 ° C'de tutun.
  5. 2x lizis tamponu eşit hacimde (taze veya dondurulmuş) hücre pelletini. Cam boncuklar 1x hacmi ekleyin. Vorteks kuvvetli bir şekilde 10 dakika boyunca 4 ° C'de.
  6. 1x liziz tamponu 2 hacim ekleyin ve karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de santrifüjleyin hücre ekstreleri kesintisiz hücre ve çekirdeklerin: pelet.
  7. Bir taze soğuk bir santrifüj tüpü içine pipetle aktarın ve süpernatant deney tamamlanana kadar buz üzerinde hücre ekstreleri tutun.

2. Bu tür Bikinkoninik Asit Testi Protein Tahmin Kiti Kullanımı Cep Özü Protein Konsantrasyon belirleyin

  1. Bisinkoninik asit hazırlanması (BCA) çözeltisi BCA ve bakır (II) karıştırılması ile (1 mL / tüp) s49 oranında ulfate: 1 (v / v).
  2. Protein standartlarını hazırlayın 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve BCA solüsyonun 1 ml'lik alikolar içinde bir 10 mg / ml bovin serum albümini (BSA) stok solüsyonu seyreltilerek 60 ug / ml olmuştur.
  3. Tekrarlardaki BCA çözeltisi 1 ml hücre ekstrelerinin 2 ul ekleyin. Önceden ısıtılmış 60 ° C su banyosu içinde 10 dakika için standartlar ve protein örnekleri inkübe edin.
  4. Aktarım numuneler 3 dakika boyunca buz. 562 nm bir dalga boyunda bir spektrofotometre ile standart ve protein örnekleri absorbansı ölçülür.
  5. Üreticinin protokolünde tarif edildiği gibi, bir referans olarak BSA standardı kullanılarak hücre ekstrelerinin protein konsantrasyonu hesaplanır. 1x lizis tamponu ile mi, 10 mg / bir protein konsantrasyonuna hücre ekstreleri seyreltilir.

Tüp başına 200ul 3. Enzimatik Deneyi

NOT: Bir kimyasal kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.

  1. 15 ml nüsha halinde her bir numune test edinkonik tüp. Tüp başına 20 ul 1 M TrisHCl pH 7.5 hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. Her bir tüp, oda sıcaklığında, (çözelti durdurma 1 (h / h) 1) kloroform / metanol 2 ml hazırlayın.
  2. Pipet, buz üzerinde, her 15 ml konik bir tüp içinde 1 M TrisHCl pH 7.5, 20 ul.
  3. Burada radyasyon güvenlik kurallarına uyun. SAM 50,06 uM toplam tüp başına [metil- 3 H] adenosil-L-metionin ve 50 uM soğuk SAM - 0.06 uM (0.2 uCi), S eşdeğer ekleyin. Soğuk su ul x ekle x = 200- (20 (+ hücre ekstreleri için 20 () + soğuk ve radyoaktif SAM hacmi) tamponu için) tüp başına.
  4. Önceden ısıtılmış 30 ºC su banyosunda her konik tüp aktarın. Reaksiyonu başlatmak için her bir tüpe, hücre ekstreleri (proteinin 200 ug eşdeğer) 20 ul ekle. İstediğiniz zaman (0-45 dakika) inkübe edin.
  5. Kloroform / metanol 2 ml ilave ederek reaksiyonu durdurun (1: 1; v / v; durdurma çözeltisi) her tüpe. (Oda sıcaklığına 20-25 konik tüp transfer6 ° C).

4. Lipid Ekstraksiyon

NOT: Bir kimyasal kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.

  1. Enzimatik reaksiyon örneğini içeren her tüpe su 700 ul ekle. Kuvvetlice 30 saniye boyunca girdap. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin su fazının organik ayırmak için.
  2. Bir pipet yardımıyla yeni bir 15 ml konik tüp içine alt organik fazı aktarın. 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde boru ve vorteks içeren her "düşük değerli faz" su 1 ml ilave edilir. Tekrar santrifüj 5 dakika boyunca 1500 x g'de su fazının organik ayırmak için.
  3. Bir pipet, bir sintilasyon tüpüne alt organik faz transfer edin. N2 akışı altında kuru örnekleri. Olmayan anonim radyoaktif SAM ve radyasyon kurallarına göre radyoaktif konik tüpler içeren su fazları bertaraf edin.
  4. 2 ml / sintilasyon sıvısı tüp ekleyin. Bir sintilasyon cou ile radyoaktiviteyi ölçünnter üreticilerin protokol ve enstrümanın kullanıma göre.
  5. Aşağıdaki genel denklemi kullanarak nmol / mg protein enzimatik aktivite hesaplanır
    cpm x değeri 10 3 x [SAM (mM) 'nin toplam (radyoaktif ve soğuk) konsantrasyonu], radyoaktif SAM (Ci / mmol) x x 5 spesifik aktivitesi [radyoaktif SAM konsantrasyonu (mM)]
    Not: Yukarıdaki protokole bağlı SAM konsantrasyonu ya da bir protein bağlı PEMT tahlili için değiştirilebilir. SAM, konsantrasyona bağlı enzimatik deney için, zaman ise, protein bağlı PEMT tahlilinde, SAM konsantrasyonu için tahlil eklenir sabit (lineer aralığında 15 dakika) ve soğuk SAM çeşitli miktarlarda tutulur (biz mM 0.05 seçtik) ve zaman sabiti (15 dakika) tutulur. Ayrıca tampon çözeltisinin pH değeri, bazı PEMT enzimler farklı optimal pH değerine sahip olması gerektiği gibi değiştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, bir alt-tabaka olarak endojen PE kullanılarak, bir enzim kaynağı olarak Leishmania bütün hücre ekstresi ile gerçekleştirildiği zamana bağlı PEMT deneyi göstermektedir. Organik faz içinde radyoaktivite miktarı, sintilasyon sayımı ile nicelendirildi. Elde edilen PE numaraları üzerine transfer tritiye metil gruplarının miktarını hesaplamak için kullanıldı. PEMT aktivitesi yaklaşık 20 dakika boyunca doğrusal olmuştur. Daha sonra, başka bir 15 dakika boyunca...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu basit, pratik PEMT tahlil, bir protein kaynağı olarak bütün hücre ekstresi kullanarak PE üzerine SAM radyoaktif metil gruplarının transferi sonucu PE metillenmiş formlarının ölçümü sağlar. Bu, hızlı, hassas ve tekrarlanabilir ve saflaştırılmış enzimler 17 için de uygundur. Ilgi metiltransferaz yerine PE 12,13,18,19 daha Bu yüzeylerde özgü olup olmadığını monometil veya dimetil-PE tahlilinde eklenebilir. Saflaştınldı PEMT enzim kullanılırsa, PE tahlilinde eklenebilir. Bu protokolün bir sınırlama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması ilan

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH hibeleri ARRA RO3 AI078145 ve RZ'ye 1SC3GM113743 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
S- [Metil-3< / sup>H] adenosil-L-metiyonin (5-15 Ci / mMole'un spesifik aktivitesi)Perkin ElmerNET155050UCReaktifi aliquot ve -20 ° C'de dondurun; C; Bu reaktif
Proteaz inhibitörü kokteyliRoche Life Sciences'ı11836170001taze olarak seyreltin 
Cam boncuklar, asitle yıkanmış, 425-600 mmSigma AldrichG8772
Bikinkoninik asit çözeltisiSigma AldrichB9643
Bakır (II) sülfatSigma AldrichC2284
Sintilasyon sayacı MicroBeta2, 1 dedektörlüPerkin Elmer 2450-0010
Spektrofotometre Biomate 3Thermo Scientific840208300
BSA stok çözeltisi (10 mg / ml)New England BiolabsB9001S
Sintilasyon sıvısı Araştırma Ürünü International Corp111198
S- (5'-Adenosil) -L-metiyonin klorür (hidroklorür)  Cayman Chemicals13956, reaktifi 20 mM HCl'de seyreltin ve alikotları -80 ° C'de dondurun; C 
kullanırken radyasyon güvenliği yönergelerine uyun

Kaynaklar

  1. Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean. J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).
  2. Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).
  3. Gao, X., et al. Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice. Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).
  4. Zhao, Y., et al. Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).
  5. Vance, D. E. Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function. Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).
  6. Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins. Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).
  7. Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins. J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).
  8. Li, D., et al. Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer. Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).
  9. Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2. J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).
  10. Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers. Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).
  11. Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant. Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).
  12. Kodaki, T., Yamashita, S. Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes. J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).
  13. Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes. Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).
  14. Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs. Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).
  15. deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).
  16. Aktas, M., Narberhaus, F. In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).
  17. Ridgway, N. D., Vance, D. E. Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver. Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).
  18. Gaynor, P. M., Carman, G. M. Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties. Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).
  19. Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides. J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).
  20. Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane. Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).
  21. Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes. J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).
  22. Henderson, D. M., et al. Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy. Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).
  23. Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).
  24. Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium. Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).
  25. Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).
  26. Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation. Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).
  27. Hoffman, J. L. Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine. Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).
  28. Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine. Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).
  29. Dorgan, K. M., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

PEMT Aktivite AnaliziTüm Hücre EkstraktıTrityumla İşaretli Metil Grubu TransferiOrganik Faz AyrımıSintilasyon SayımıProtein Konsantrasyonu ÖlçümüSAM Konsantrasyonuna BağlıEnzimatik Aktivite HesaplamasıLeishmania Hücre Ekstraktı
Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.