Yöntem makalesi

Semiokimyasallar için yatak hataların Koku Nöron Cevapları Algılama Tek Sensillum Kaydı Kullanma

DOI:

10.3791/53337

⸱

18 Ocak 2016

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tahtakuruları, ortamdaki semiyokimyasalları tespit etmek için anten koku alma duyularında bulunan koku alma reseptörü nöronlarına güvenir. Tek sensillum kaydını kullanarak, tahtakurusunun semiokimyasallara tepkisini değerlendirmek ve ilgili kodlama sürecini keşfetmek için bir yöntem gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek koku alma sistemi ortamında Semiokimyasallar saptanmasında önemli bir rol oynar. Özellikle, içinde tek ya da çok nöronları ev anten Sensilla, kimyasal uyaranlara yanıt büyük bir katkıda bulunmak kabul edilir. Şirketinden uyaranlara maruz kaldıktan sonra koku Sensillum eylem potansiyeli kaydedilmesiyle tek Sensillum kaydı (SSR) tekniği kimyasal uyaranlara böceklerin sinir yanıtları araştırmak için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Bir azılı insan parazit bed bug için, koku Sensillum birden fazla türde karakterize edilmiştir. Bu çalışmada, iki kimyasal uyaranlara ve SSR yöntemi kullanılarak bunlardan biri doza bağımlı yanıtlara bed bug koku Sensilla nöral yanıtları gösterdi. Bu yaklaşım, devel için değerli bilgiler sağlayacaktır bed bug koku Sensilla bireysel kimyasal uyaranlara, erken tarama yapmak için araştırmacılar sağlarYeni yatak hata cezbedicilerde veya kovucular ve faydaları yatak böcek kontrolü çabalarının bir opment.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçici ektoparazit olarak, onların hayatta kalma, gelişme ve üreme, insan ve hayvanlarda 1,2 de dahil olmak konaklardan kan kaynakları gerektiren anlamına gelir yükümlü kan emici böcek olduğunu,: ortak yatak böcek Cimex L (Cimicidae Hemiptera) lectularius. Virüs iletim nadiren C'ye bağlı bildirilmiş olmasına rağmen lectularius, bir istila tarafından oluşturulan ısırma sıkıntı ciddi fiziksel ve psikolojik 3 ana etkiler. Tanıtım ve kimyasal böcek ilaçlarının yaygın kullanımı, özellikle DDT, salgınlar riskini düşürdü ve 1950'lerde istilası sonunda artık ciddi bir halk endişe vardı böyle düşük bir düzeyde idi. Ancak, olası bir dizi faktöre gibi insektisit kullanımının azaltılması olarak, dünya çapında yatak böcek popülasyonunda diriliş açmıştır, kamu bilincinin bir düşüş, aktivite seyahat artmış ve böcek öldürücüler 4-9 direnç gelişimi.

Ortamda kimyasal ipuçları tespit edilir ve bu tür anten ve maksiller palps olarak koku organları aracılığıyla böcekler tarafından tanınır. Böcek antenler üzerinde koku Sensilla bu kimyasal ipuçlarını tespit çok önemli bir rol oynamaktadır. Kimyasal moleküller manikür yüzeyindeki gözenekler aracılığıyla antennal manikür girin. Odorant bu kimyasal moleküller antennal lenf bağlama bağlama proteinleri ve odorant reseptörlerinin 10 üzerine taşırlar. Koku reseptörleri ve bu kimyasal moleküller kez depolarize olacak nöral membran üzerinde seçici olmayan katyon iyon kanalının, kendi eş-reseptör odorant reseptörlerinin 11 tarafından tanınır.

Tek Sensillum kayıt (SSR), kimyasal ya da kimyasal olmayan uyaranlara ya uygulamadan kaynaklanan aksiyon potansiyeli dışı değişikliği algılamak için geliştirilmiştir. Sensillum lenf ve bir referans elektrotu bir kayıt elektrot konması ileinsektisidin (genellikle göz bileşiminin ya da karın) bazı diğer parça içine, uyarıcıya tepki nöronların ateşleme hızı 12 kaydedilebilir. Sivri uçların sayısında değişiklikler belirli bir uyarana karşı böcek hassasiyetini temsil etmektedir. Farklı kimlikler ve konsantrasyon kimyasal uyaranlara farklı ateşleme oranları ve temporal yapıları, farklı nöral tepkiler olacak ve böylece belirli kimyasallara böceğin kodlama sürecini araştırmak için kullanılabilir.

Dokuz yivli peg C Sensilla, 29 saç benzeri E (E1 ve E2) Sensilla ve bir çift Dα, Dβ, Dγ pürüzsüz PEG her: Ortak yatak böcek için, hem de cinsel form antenler üzerindeki koku Sensilla aynı desen paylaşan Sensilla 13,14. Birden çok nöronlar Sensillum her tür tespit edilmiş olarak, bu aynı Sensillum yer farklı nöronlardan aksiyon potansiyelleri ayırt etmek kolay değildir, bu deney için çok totaaksiyon potansiyellerinin l numaraları önce ve stimülasyon sonrasında 500 milisaniye süre için off-line sayılmıştır. Stimülasyon sonrasında aksiyon potansiyelinin sayısı daha sonra stimülasyon öncesi aksiyon potansiyeli sayısından çıkarılır ve ikinci 15 başak her ayrı Sensillum ateşleme hızı değişiklikleri ölçmek üzere iki ile çarpılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araçların, Uyaranlar Çözümleri ve Yatak Bugs 1. Hazırlık

  1. 20 ml'lik bir şişe içinde (a / h)% 50 KNO 2 çözeltisi hazırlayın.
  2. Arka arkaya ve çözeltiden tungsten daldırmalı elektrod ile 5 V KNO 2 çözeltisi içinde iki tungstenli Mikroelektronlar keskinleştirme.
    1. Kabaca tungsten telinin ön uç tüketen büyük ölçüde yaklaşık 5 dakika boyunca 2 eğimler / sn hızında ve KNO 2 çözeltisi üzerinden tungsten telinin yaklaşık 10 mm daldırılarak tungsten tel netleştirmek.
    2. Elektrot ince ve sivri hale getirilmesi için, incelikle en az 1 dakika için 2 eğimler / sn hızında ve solüsyonun dışında tel ucunun yaklaşık 1 mm daldırılarak elektrodu netleştirmek. O bed bug koku Sensillum bir manikür delinme kadar ince olmalıdır 0.2-0.5 mikron, ulaşana kadar sık ​​mikroskop altında elektrot ucu çapını kontrol edin.
      Not: El keskin ikenelektrotun kal- mış, KNO 2 solüsyon içine tungsten telinin daldırma hızı her zaman sabit değildir. Daha fazla uygulama ile, elektrot bileme içinde nispeten sabit hız tutmak için çok daha kolaydır. Bileme süresi elektrot nasıl olması gerektiği gayet bağlı da belirsiz. Burada ~ 0.2 mikron çapında bir elektrot ucu koku Sensillum yoluyla delmek için yeterli değildir.
  3. Bir stok çözeltisi olarak 01:10 h / h arasında bir başlangıç ​​konsantrasyonuna saf bileşikten dimetil sülfoksit (DMSO) içinde kimyasal uyaranlara her seyreltilir. Her bir kimyasal için stok çözeltileri her birinden, DMSO ile yeniden deney gerekli kaç doz bağlı dekadik dilüsyonları bir dizi oluşturur. Β-pinen ve okaliptol - Al,% 10 (+) kullanın.
  4. Beslenmemiş ya da yedi gün yerleştirin sonrası beslenme Ft (erkek veya kadın) yetişkin yatak böcek. Dix kolonisi (Kentucky Üniversitesi Haynes bir hediye) t kullanılacakO bir petri deneme.
    Not: Petri kabındaki yerleştirilen yatak hataların kesin sayı yok. Birkaç veya çok olabilir.

2. Oda Bug Anten Hazırlık

  1. Buz (2-3 dk) üzerinde yatak hataların Anesteziyoloji.
  2. Çift taraflı bant ile bir mikroskop lamel antenler ve böcek vücudu hem Fix ve ince makasla bacakları kaldırmak.
  3. Sürekli bant onları sopa şekilde yavaşça antenler dokunmak için küçük bir iğne kullanın.
  4. Manipülasyonunu kolaylaştırmak ve kayıt elektrot (Şekil 1) için uygun bir açıyla (~ 90 °) bunu ayarlamak için diş mumu küçük bir top (~ 1 cm çaplı) karşı lamel dinlendirin.
  5. Bir kez, bir stereo mikroskop altında bed bug koyun, soğuk ışık kaynağı açmak ve anten açıkça sunulana kadar aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın ve yüksek büyütmede bed bug antenin ikinci kamçı üzerinde mikroskop odak, güvenli (720X) .
    Not: Deneyde kullanılan aydınlatma şiddeti gerçekten deneycinin gözleri aydınlatma yoğunluğunu nasıl hissettiğimi bağlıdır, hangi quantitated değildir.

3. Tek Sensillum Kayıt

  1. Sinyal kaydı ve görselleştirme için bilgisayar ile bağlı olan sinyal alımı kontrolörü ile preamplifier (10X) bağlayın. Bilgisayarı açın ve yazılımı, örneğin, AutoSpike32 başlatmak ve menü çubuğundan "Kayıt" modunu tıklayın. Sonra dalga sinyalleri kaydetmeye başlamak üzere "dalga" seçiniz.
    Not: arka arkaya monitörün sağına soluna çalışan düz çizgi artık görünür olmalıdır. Burada, kayıt penceresi 40 saniye sürer. Maksimum dalga kaydı 10 sn. Seçilen örnekleme hızı 96000 ve dijital örnekleme hızı 0 ofset% ve hiçbir filtreleme, kayıt sinyalleri için hiçbir düzeltme yoktur 240. değildir. Gerektiği gibi yazılımda Tüm bu parametre ayarları değiştirilebilir.
  2. antennal Sensillum gelen nöronal yanıtlar için tonlama modu sunmak için kullanılan preamplifikatör, bağlı hoparlör açın.
  3. Stabilize yatak böcek karın içine referans elektrot yerleştirin.
    Not: Referans elektrot manyetik hava masaya bağlı standı bir metal gerçekleştirildi.
  4. Referans elektrot yatak böceğin karın bağlandıktan sonra, yatak bug en antenin arka ucuna doğru, bir micromanipulator tarafından Pre amplifikatör bağlanır ve manipüle kayıt elektrot hareket.
  5. Kayıt elektrot antenin sağ ucu ile temas halinde olduğunda, mikroskop geçiş ve düşük büyütmede elektrodu bulun.
  6. Elektrod ve anten Sensillum aynı düzlem içindedir ve mikroskop altında açıkça görülebilir kadar tedricen büyütme artan kayıt sırasında elektrot ayarlayın.
    Not: Bu zamana kadar, mikroskop olağandırEn yüksek büyütmede ly.
  7. Mikromanipülatör kullanarak Sensillum şaftı içine kayıt elektrodu yerleştirin ve arka plan gürültü eylem potansiyeline göre yüksek ise biraz daha derine gitmek.
  8. Β-pinen - Bir kere net aksiyon potansiyelleri kaydedildi Sensillum dan izlenir,% 10 (+) ile bir mikropipet doldurun. Bir cam Pasteur pipeti içine yerleştirilen bir filtre kağıdı şeridi (~ 3 x 15 mm) üzerine β-pinen -% 10 (+) 10 ul tablet yatırmak mikropipet kullanın.
    1. Uyarıcı kontrolörünün nabız akış borusunun çıkışına yüklenen pipet bağlayın ve anten yönelik tüp içinde küçük deliğe pipet ucu yerleştirin.
  9. Bütün bu bağlantılar stabilize olduğunda, sürekli nemlendirilmiş hava akımı içine uyarıcı (/ dk 0.5 L) 0.5 sn puf sunmak için uyarıcı kontrolörünün ayak pedalını bastırın. Aksiyon potansiyellerinin kayıt olduğunda footswitc aynı anda başlatılacaktırh depresif. Kayıt işlemi stimülasyon önce 1 sn başlayan 10 saniye son olacak.
  10. İki 500 msn dönem, önce bir ve uyarıldıktan sonra biri için off-line aksiyon potansiyelleri sayın. Önceki 500 msn sırasında kaydedilen spontan aktivite 500 msn sonrası stimülasyon sırasında başak oranında herhangi bir değişikliğe çıkartın ve 2 ile çarpılarak sivri / s, geleneksel ölçek haline sayar dönüştürün.

SSR 4. uyarıcı Değiştirme

  1. Bed bug antenleri üzerine pipet β-pinen ve pipet kaldırılır sonra 10 saniye için bu özel odorant yanıtı kayıt - ayak pedalı tetikleyen edildikten sonra,% 10 (+) teslim.
  2. % 0.001 okaliptol ile yeni bir pipet Etiket test edilecek. Uyaran 10 ul, yeni pipet içine, uygulanmış, bunun üzerine filtre kağıdı, bir parça yerleştirin.
  3. Uyaran tamamen vapori kadar 2-5 dakika bekleyinCam pipet zed. Nabız akış tüp çıkışına üzerine pipet takın.
  4. Anten yönelik tüp küçük deliğe pipet yerleştirin. Ayak pedalını basın ve 10 saniye kayda başlamak.
  5. Pipet çıkarın ve% 0.01 ökaliptol başka pipet hazırlayın.
  6. Doza bağlı bir yanıt gözlemlemek için anten Sensilla ilgili okaliptol doz (0.001 ila% 10% si), tüm geri kalan test edin. En Test sulandırmak az dozlarda sulandırmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek Sensillum kayıt böcek kimyasal ekoloji ve nöral fizyoloji çalışmalarında kullanılan güçlü bir araştırma tekniğidir. Farklı uçucu bileşiklerin, düşünce özellikle böceklerin sinir tepkileri araştıran böceklerin hayatta kalma ve gelişme ekolojik ilgili olmak değil, sadece bize böcek koku alma sürecine çok değerli anlayışlar verir, ama aynı zamanda potansiyel olarak yol açabilecek umut verici yeni yollar açılıyor Haşere kontrolü için yeni ve faydalı reaktiflerin gelişimi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek Sensillum Kayıt tekniği yaygın böyle bir ortamda farklı kimyasal uyaranlara meyve sinekleri, sivrisinek ve yatak böcek olarak böceklerin sinir yanıtları test kullanılmıştır. Bu kimyasal uyaranlara genellikle çözündürüldü ve işlemlerin farklı dozlarını hazırlamak için, yaygın bir çözücü içinde seyreltilir. Bununla birlikte, farklı çözücüler uyarıcılar için oldukça farklı salım oranları üretebilir. Böyle Drosophila melanogaster, anopheles gambiae, Culex quinquefasciatus ve Aedes aegypti<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proje, NL'ye AAES 461Hatch/Multistate Grants ALA08-045 ve ALA015-1-10026 Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tungsten telSİSTEMLERİ# 716500
KNO2Sigma# 310484elektrotunu hazırlamak için kullanılır Tungsten telini keskinleştirmek için kullanılır
ACGüç Kaynağı BK Precision1653ATungsten telin keskinleştirilmesinde voltajın sağlanması
Leica Z6 APO MikroskopLeica10447424Antenler üzerindeki sensillayı gözlemlemek için kullanılır
Simulus kontrolörSyntechCS-55Uyaran uygulamasını kontrol etmek için kullanılır
4 Kanallı USB Toplama Kontrol CihazıSyntechIDAC-4Kayıt öncesi ve sırasında tüm sinyallerin gerçek zamanlı ekran görüntüsü
Işık KaynağıSCHOTTA20500Gözlem için ışık kaynakları sağlama
MikromanupulatorLeica115378Küçük hareketler için kullanılır elektrot
HoparlörJuster95aEdinme Kontrolörü IDAC-4 ile bağlantılı ve sinyal için ses sağlayan
Manyetik standNarishigeGJ-1Referans elektrodu, stabilize yatak böceği ve uyaran dağıtım tüpünü tutmak için kullanılır
TMC Titreşim İzolasyon TablosuTMC63-500Ekipmanlardan gelen titreşimi izole etmek için kullanılır
LamelTedpella2225-1Yatak böceğini tutmak için kullanılır
Çift Taraflı Bant3MXT6110Yatak böceğini kapak klipsi üzerinde sabitlemek için kullanılır
Diş MumuDentakitDK-R012Yatak böceğinin sabitlendiği kapak klipsini desteklemek için kullanılır 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartonicka, T., Gaisler, J. Seasonal dynamics in the numbers of parasitic bugs (Heteroptera, Cimicidae): a possible cause of roost switching in bats (Chiroptera, Vespertilionidae). Parasitol Res. 100 (6), 1323-1330 (2007).
  2. Thomas, I., Kihiczak, G. G., Schwartz, R. A. Bed bug bites: a review. Int J Dermatol. 43 (6), 430-433 (2004).
  3. Anderson, A. L., Leffler, K. Bed bug infestations in the news: a picture of an emerging public health problem in the United States. J Environ Health. 70 (9), 24-27 (2008).
  4. Boase, C. Bed bugs (Hemiptera: Cimicidae): an evidence-based analysis of the current situation. Sixth international conference on urban pests. OOK-Press Kft. Robinnson, W., Bajomi, D. Budapest, Hungary, , (2008).
  5. Doggett, S. L., Geary, M. J., Russell, R. C. The Resurgence of bed bugs in Australia: with notes on their ecology and control. Environ Health. 4 (2), 30-38 (2004).
  6. Ter Poorten, M. C., Prose, N. S. The return of the common bedbug. Pediatr Dermatol. 22 (3), 183-187 (2005).
  7. Yoon, K. S., Kwon, D. H., Strycharz, J. P., Craig, S., Lee, S. H., Clark, J. M. Biochemical and molecular analysis of deltamethrin resistance in the common bed bug (Hemiptera: Cimicidae). J Med Entomol. 45 (6), 1092-1101 (2008).
  8. Wang, L., Xu, Y., Zeng, L. Resurgence of bed bugs (Hemiptera: Cimicidae) in mainland China. Fla Entomol. 96 (1), 131-136 (2013).
  9. Haynes, K. F., Potter, M. F. Recent progress in bed bug management. Advanced technologies for managing insect pests. Ishaaya, I., Palli, S. R., Horowitz, A. R. , Springer. New York. 269-278 (2013).
  10. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  11. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annu Rev Entomol. 58, 373-391 (2013).
  12. Den Otter, C. J., Behan, M., Maes, F. W. Single cell response in female Pieris brassicae. (Lepidoptera: Pieridae) to plant volatiles and conspecific egg odours. J Insect Physiol. 26 (7), 465-472 (1980).
  13. Levinson, H. Z., Levinson, A. R., Muller, B., Steinbrecht, R. A. Structural of sensilla, olfactory perception, and behavior of the bed bug, Cimex lectularius., in response to its alarm pheromone. J Insect Physiol. 20 (7), 1231-1248 (1974).
  14. Harraca, V., Ignell, R., Löfstedt, C., Ryne, C. Characterization of the antennal olfactory system of the bed bug (Cimex lectularius). Chem Senses. 35 (3), 195-204 (2010).
  15. Liu, F., Haynes, K. F., Appel, A. G., Liu, N. Antennal olfactory sensilla responses to insect chemical repellents in the common bed bug, Cimex lectularius. J Chem Ecol. 40 (6), 522-533 (2014).
  16. Olson, J. F., Moon, R. D., Kells, S. A., Mesce, K. A. Morphology, ultrastructure and functional role of antennal sensilla in off-host aggregation by the bed bug, Cimex lectularius. Arthropod Struct Dev. 43 (2), 117-122 (2014).
  17. Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30 (2), 537-552 (2001).
  18. Qiu, Y. T., Loon, J. J. A., Takken, W., Meijerink, J., Smid, H. M. Olfactory coding in antennal neurons of the malaria mosquito, Anopheles gambiae. Chem Senses. 31 (9), 845-863 (2006).
  19. Ghaninia, M., Ignell, R., Hansson, B. S. Functional classification and central nervous projections of olfactory receptor neurons housed in antennal trichoid sensilla of female yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Eur J Neurosci. 26 (6), 1611-1623 (2007).
  20. Hill, S. R., Hanson, B. S., Ignell, R. Characterization of antennal trichoid sensilla from female southern house mosquito, Culex quinquefasciatus Say. Chem Senses. 34 (3), 231-252 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tahtakurusu AntenleriKimyasal Uyaran TespitiKoku Sensillum AnaliziAksiyon Potansiyeli KaydUyaran Verme SistemiMikroelektrot Manip lasyonuDoz Yan t TestiB cek Koklama Duyusu

İlgili makaleler