Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu iletişim kuralının amacı mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri incelemektir. Bu nedenle, 3D görüntüleme ve analiz teknikleri sinir özgü mitokondri yalıtmak ve duyusal sinir distal ucu mitokondri hastalığı kaynaklı değişikliklere değerlendirmek için geliştirilmiştir. Protokol Floresans immünhistokimya, confocal mikroskobu ve görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için 3D görüntü analiz teknikleri birleştirir. Detaylı parametreleri yordamlarda sinir özgü mitokondri yalıtmak için bu teknikleri kullanmayı gösteren somut bir örnek vermek için tanımlanır. Hangi sinirler ve mitokondri yeşil ve kırmızı floresan sinyali ile sırasıyla görselleştirmek için dolaylı ayirt tarafından izledi biyopsi, deri doku bölümleri içinde mitokondrial sinyalleri yumruk ve antikorlar sinir etiketlemek için kullanıldı. Z-serisi görüntüleri confocal mikroskobu ile satın alınan ve 3D analiz yazılımı işlemek ve sinyalleri analiz etmek için kullanıldı. İçinde açıklanan tam parametreleri takip için gerekli değildir, ancak boyama boyunca, toplama ve analizi adımları seçilmiş olanlar ile tutarlı olması önemlidir. Bu iletişim kuralı bir floresan sinyal aksi Yalnız çalışmak imkansız diğer sinyalleri yalıtmak için kullanıldığı çok çeşitli koşullar uygulanabilir olduğunu gücüdür.
Giriş
Mitokondri hücre enerji, kalsiyum ve nekrotik düzenleyen ve apoptotik hücre ölüm1,2,3tampon üreten dahil önemli hücresel işlevler hizmet. Sinir sistemi nöronlar hücresel enerji yüksek derecede adenozin trifosfat (ATP) formunda oluşturmak düşündüren vücut4 mitokondrial solunum ile karşılaştırıldığında yüksek bir metabolizma hızı vardır. Bir sürü kanıt belgeleri nöronal işlevleri ATP5, özellikle de sinapslarda6bağlıdır. Bu nedenle, mitokondri nöronlar içinde dağılımı önemlidir.
B....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
(Salt Lake City, UT) Utah Üniversitesi diyabet Merkezi'nde büyük topluluk tabanlı birinci basamak sağlık ağdan işe konulardan elde edilen deri punch biyopsi. Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu ilkelerinin ile uyulması. Aydınlatılmış onam test önce her konudan elde edilen yazılı.
1. Floresans immünhistokimya
- hazırla punch biyopsi intraepidermal Sinir lifi immünhistokimya için:
- gerçekleştir 3 mm cilt biyopsileri tıp tarafından personel ve bütün biyopsi 1,5 yer mL Zamboni ' s sabitleştirici çözüm (%2 paraformaldehyde, doymuş % ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Görselleştirme ve mitokondri içinde insan IENFs miktar
Floresans immünhistokimya sinirler, mitokondri ve çekirdekleri görselleştirmek için Çoklu sinyaller insan cilt biyopsileri içinde eşzamanlı etiketleme için sağlar. 96-şey plaka immünhistokimya yordamdaki adımları düzenlemek için kullanışlı bir yol var. Şekil 1 bu kadar çözümler 12 aşamalarında işlenmek üzere 8 bölüm için bu yapı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralı izole etmek, ölçmek ve boyutu ve sinir özgü mitokondri içinde IENFs 3D insan cilt biyopsileri üzerinden dağıtımını çözümlemek için tasarlanmıştır. Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Serbest dalgalanma Floresans immünhistokimya leke ve her örneğinde, Araştırma araştırma44,45için daha çok yönlü bir metodoloji sağlayan Çoklu sinyaller çözümlemek için tasarlanmıştır. Bu yordamı confocal mikroskobu görüntüleri ve 3D analiz kazanılması için .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir bildirmek için çıkar çatışması.
Teşekkürler
Bu eser Ulusal kurumları sağlık hibe K08 NS061039-01A2, Nöroloji araştırma için Program tarafından desteklenen & keşif ve A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü Michigan Üniversitesi'nde. Bu eser morfoloji ve görüntü analiz çekirdek Michigan diyabet araştırma merkezinin Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 5 P 90 DK-20572 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları tarafından finanse edilen kullanılır. Yazarlar insan deri örnekleri onların cömert bağış için J. Robinson Singleton ve A. Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %2 Zamboni'nin Sabitleyici | Yeni Gelen Arzı, Middleton, WI | 1459A | %2 paraformaldehit, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %0.2 doymuş pikrik asit, pH 7.4 |
| 10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | 1x PBS |
| Image-iT FX Sinyal Arttırıcı | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | spesifik olmayan bağlanmayı azaltarak Alexa Fluor boya sinyallerini geliştirir |
| Anti-Protein Gen Ürünü 9.5 Antikor (Tavşan Poliklonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | PGP9.5 olarak kısaltılır, üretimi durdurulan AbD Serotec'in yerini alır (Kat. No. 7863-0504) antikor |
| Anti-Piruvat Dehidrojenaz E2 / E3bp Antikor (Fare Monoklonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | PDH olarak kısaltılır |
| Keçi anti-fare İkincil antikor Alexa Fluor 594 konjuge | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | kırmızı floresan konjuge ikincil antikor |
| Keçi anti-tavşan İkincil antikor Alexa Fluor 488 konjugat | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | yeşil floresan konjuge ikincil antikor |
| Albümini, Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | TX-100 |
| 0.22 ve mikro olarak kısaltılır; m Filtre | EMD Millipore, Billerica MA | MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 & mikro; m Kırlangıç filtresi |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Kalibre edilmemiş Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | Decon LeLoop (MP 199-25) tarafından aşılama Döngüsü |
| 96 kuyulu Tahlil Plakası | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96 oyuklu düz tabanlı plaka |
| Prolong Gold antifade reaktifi DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | ile P-36931 | Çekirdeklerin DAPI boyanması |
| Mikroskop Kapak Camı 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Lameller |
| Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Mikroskop Slaytları |
| Leica SP5 Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Konfokal Mikroskop |
| Volocity x64 Yazılımı | Perkin Elmer, Waltham, MA | sürüm 4.4.0 | Volocity yazılımı, görüntü işleme protokolündeki Adım 3.1 ve 3.2 için kullanılır |
| Imaris x64 3 Boyutlu Analiz Yazılımı | Bitplane, Concord, MA | sürüm 7.7.1 | Imaris yazılımı, görüntü analizi protokolünde 3.3 ile 3.5 arasındaki Adımlar için |
| kullanılır Excel | Microsoft, Redmond, WA | sürümü Office 2013 | Excel elektronik tablo yazılımı, morfometrik özellikleri özetlemek için protokoldeki Adım 3.6 için kullanılır |
| : Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiği | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems olarak kısaltılır, Buffalo Grove, IL | CM1850 | 50 ve mikro kesim için kriyostat; m kesitler |
| CellLight Mitokondri-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Mitokondriyi yeşil floresan sinyalle etiketlemek için pozitif kontrol olarak kullanılır |
Kaynaklar
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
