Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Summary

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Abstract

transloke substrat olmayan electrogenic ise tek bir protein düzeyinde membran proteini taşıma hala detaylı analizler kaçıyor. Kaydadeğer çaba bu alanda yapılmış, ancak zar taşıyıcıları analizi için gerekli olan solvent içermeyen çift katlı lipid teknikleri ile birlikte otomatik yüksek verimli taşıma analizi sağlayan teknikler nadirdir. taşıyıcıların Bu sınıf, ancak hücre homeostazında önemli ve bu nedenle ilaç geliştirme ve yeni anlayışlar kazanmak için metodolojiler önemli bir hedef umutsuzca ihtiyaç olduğunu.

Burada sunulan el yazması tek taşıyıcı çözünürlükte membran proteini aracılı taşıma süreçlerinin analizi için yeni bir Biochip kurulmasını ve kullanımını açıklar. biyoçip tasarımında oldukça paraleldir ve endüstriyel cins ve miktarda üretilebilir nanopores çevrelediği, mikro boşlukların üst oluşmaktadır. Protein Barınma lipozomlar doğrudan uygulanabilirSSM-teknikleri kullanarak kendini monte gözenek kapsayan çift katlı lipit katmanını oluşturan yonga yüzeyi (katı lipid membranlar desteklenir). membran parçaları, müstakil içine veya gerçek zamanlı multi-spektral floresan okuma ile takip edilebilir kavite alanı, dışarı substrat translokasyonu için arayüz sağlıyor Gözenek kapsayan. standart operasyon prosedürleri (SOP) kurulması işlevsel yeniden olabilir hemen hemen her membran proteini çip yüzeyinde protein barındıran lipit tabakalarının kolay kurulmasını sağlar. tek ön şart olmayan electrogenic taşıma yüzeyler için bir floresan okuma-out sistemi kurulmasıdır.

Yüksek içerik tarama uygulamaları paralel olarak birden fazla fiş kayıt otomatik ters floresan mikroskop kullanılarak accomplishable vardır. Büyük veri kümeleri serbestçe kullanılabilir özel tasarlanmış bilgisayar programları kullanılarak analiz edilebilir. Üç renkli çoklu spektral floresanOkuması ayrıca yanlış pozitif sonuçlar ortadan kaldırarak, farklı olay sınıflarına tarafsız veri ayrımcılık sağlar.

Chip teknolojisi şu anda SiO ₂ yüzeylere göre, ama altın kaplamalı yonga yüzeyleri kullanılarak daha fonksiyonlandırmalar da mümkündür edilir.

Introduction

membran proteinlerinin analizi son 20 yılda temel ve ilaç araştırmaları için artan ilgi haline gelmiştir. yeni ilaçların geliştirilmesi halen kısıtlayan faktörlerden biri olan tanımlanması ve yeni hedefler detaylı karakterizasyonu bağlıdır. Tüm ilaç hedefleri yaklaşık% 60 zar proteinleri ¹ olması, tekniklerin geliştirilmesi fonksiyonları önemli aydınlatmak için yapar.

^{4 -} Geçmişte, electrogenic kanalları ve taşıyıcıları çalışma teknikleri ² sayıda geliştirilmiştir. Aksine olmayan electrogenic yüzeyler daha zorlu bir görev sunuyoruz. Onlar kaskadlar ⁵ sinyal kilit reseptörler olarak hü....

Protocol

Büyük tek tabakalı veziküller 1. Hazırlama (LUVler)

1. toz parçacıkları çıkarmak için azot gazı ile bir tabanı yuvarlak bir şişe (10 ml hacim) temizleyin. etanol ile tabanı yuvarlak bir şişe durulayın.
   Not: Kalıntı etanol tolere edilebilir ve daha sonraki adımlar rahatsız etmez.
2. Herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için, kloroform ile 1 ml cam şırınga 4x yıkayın. Yuvarlak tabanlı bir şişeye 4 mi SoyPC20, kloroform (25 mg / ml) ilave edin ve 0.1 mol% 'bir son konsantrasyona kadar ilave DOPE ^{ATTO 390} lipid çözeltisi katkı yapılmasını.
   Not: yerine DOPE ^{ATTO 390} diğer fluoroforla işaretlenm....

Results

Gözenek kapsayan zarlar kolayca kendi kendine monte şekilde nano yapılı çip yüzeyinde oluşturulabilir. Ancak altta yatan süreç hala hassas ve lipozom boyutu, lipozom nüfus, lameller, lipid-ve tuz konsantrasyonu ve kimyasal yüzey özelliklerinin monodispersiteye gibi birçok parametrede tarafından etkilenir. Bu parametrelerin çoğu dikkatle, özelliği yukarıdaki protokol standardize edilmiştir. Ancak her yeni hazırlanması sırasında kontrol edilmelidir Diğer parametreler, başarılı bir deney sa.......

Discussion

Burada sunulan teknik membran proteini ulaşım son derece paralel analiz sağlar. Sulandırılmış membran proteini sistemleri doğrudan teorik her zar taşıyıcı uyarlanmasını yapmadan veya olası kanala, Biochip uygulanabilir. Taşıma analizi sadece doğrudan floresans değişimi (fluorophores translokasyon veya floresan etiketli substratlar) ya da dolaylı olarak floresans değişimi (pH'a duyarlı boyalar, sekonder enzimatik reaksiyonlar) yoluyla, bir flüoresan okuması sisteminin kurulması ile sınırlıdır. İkincisi ise henüz tam .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif< / güçlü>
[2- (Trimetilamonyum) etil] metanetiyosülfonat	Toronto Araştırma Kimyasalları A.Ş.	T792900	MTSET; su ile hidrolize edilir. Tamponda çözündükten hemen sonra (30 dakika) -80 ° C'de kuru pouder aliquot olarak saklayın.
1 ml gaz geçirmez şırınga	Hamilton	#1001
10 ml yuvarlak şişe	Schott Duran
2,7 mm cam boncuk	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Uzatma Tüpü	Sarstedt	744304
Aseton	Roth	5025.5
Biyo-Boncuk SM-2 Adsorban	Bio-Rad	152-3920'nin	ilk kullanımdan önce etkinleştirilmesi gerekir
CaCl2 Dihidrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	-20 ° C'de koyu saklayın; C
Kloroform reaktif sınıfı	VWR Kimyasalları	22711324
DOPE ATTO390< / sup>	ATTO-TEC	AD 390-165	-20 ° C'de koyu saklayın; C
Etanol mutlak	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Tek kullanımlık şırınga	Braun	460 60 51V
Injekt-F tek kullanımlık şırınga	Braun	91 66 017V
Keck klipsleri	Schott	KC29
L-&alfa;-Fosfatidilkolin, %20 (Soya)	Avanti Polar Lipidler	5416016	-20 °C'de inert gaz altında saklanır; C
NaCl %99,5 yıllık	Roth	3957.2
Nanopore E100 gofret/cips	Mikromotor (Mainz/Almanya)		istek üzerine temin edilebilir
Nucleopore Track-Etch Membran 0.4 & m	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	-20 &°C'de karanlık mağaza C
Oy647	Luminartis (Mü nster / Almanya)	OY-647-T-1mg	-20 ° C'de koyu mağaza; C
Rotilabo-şırınga filtrasyonu, steril olmayan, gözenek boyutu 0.22 ve mikro; m	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	boyut dışlama kromatografisi için kolon malzemesi
Silastic MDX4-4210	camı desteğine talaş sabitlemek için	Dow Corning
yapışkan-Slayt 8 kuyulu	ibidi	80828	cam kızaklara montaj için çok kuyulu hazne (talaş tutucu)
Üç musluk mavisi	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan %99,9 Ultra Kalite	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 & mikro; m selüloz nitrat membran filtre	Roth	NH69.1
Name< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Equipment< / strong>
B & uuml; chi 461 su banyosu	Bü
Bü chi Rotavapor RE 111	Bü
Cary Eclipse Floresan Spektrometresi	Varian
LiposoFast Mini Ekstruder	Avestin
Membran pompası	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanopartikül İzleme Mikroskobu	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE mikroskop	Synentec		istek üzerine temin edilebilir
Pompa kontrolü	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator banyosu Sonorex RK100H	Brandelin elektronik	31200001107477
Vakum pompası RC5	Vaccubrand	1805400204
Su banyosu W13	Haake	002-9910
Plazma Temizleyici PDC-37G	Harrick Plazma	PDC-37G
Name<	strong>Company	Katalog Numarası	Comments
Software
ImageJ	Açık Kaynak		http://imagej.nih.gov/ij/ bilimsel görüntü işleme yazılımı
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	büyük taşıma kinetik veri kümeleri için veri analizi/değerlendirme yazılımı
NTA 2.3 Analitik Yazılım	Nanoparçacık takibi için Nanosight		veri toplama ve analiz yazılımı mikroskop
NTA 2.3 Sıcaklık İletişimi	Nanopartikül izleme mikroskobu için Nanosight