Yöntem makalesi

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

DOI:

10.3791/53374

⸱

16 Kasım 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala Biomedical Center, Uppsala University, 2Department of Surgical Sciences, Otolaryngology and Head & Neck Surgery, Akademiska sjukhuset

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Palatin bademcikler B ve T lenfositleri açısından zengin bir kaynaktır. Burada, B ve T lenfositlerini insan palatin bademciklerinden izole etmek için kolay, verimli ve hızlı bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem, bademcik iltihabı olarak bilinen bademcik iltihabının viral etiyolojisi üzerine yapılan çalışmalar için özel olarak uyarlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bademcikler, solunan patojenlere karşı ilk savunma hattını sağlayan bağışıklık sisteminin bir parçasını oluşturur. Genellikle "bademcikler" terimi, farenksin oral kısmının yan duvarlarında yer alan palatin bademcikleri ifade eder. Cerrahi olarak çıkarılan palatin bademcikler, yabancı patojenler ve konakçı bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi incelemek için uygun ve erişilebilir bir B ve T lenfosit kaynağı sağlar. Bu video protokolü, cerrahi olarak çıkarılan insan palatin bademciklerinin diseksiyonunu ve işlenmesini, ardından aynı doku örneğinden tek tek B ve T hücre popülasyonlarının izolasyonunu açıklar. Bu çalışmada, tonsiller B ve T lenfositlerini antikora bağımlı bir afinite protokolü kullanarak etkili bir şekilde ayıran bir yöntem sunulmaktadır. Ayrıca, insan adenovirüsünün özellikle bademcik T hücresi fraksiyonunu enfekte ettiğini göstermek için bu yöntemi kullanıyoruz. Oluşturulan protokol, tonsiller immün yanıtlarda farklı patojen türlerinin rolünü incelemek için tonsiller B ve T hücre popülasyonlarını verimli ve hızlı bir şekilde izole etmek için genellikle uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bademcikler, üst aero-sindirim sistemindeki epitelin altında ve onunla temas halinde olan, tam olarak kapsüllenmemiş lenfoid doku koleksiyonlarıdır. Genellikle "bademcikler" terimi, farenksin oral kısmının yan duvarlarında yer alan palatin bademcikleri ifade eder. Eşleştirilmiş palatin bademcikler, nazofaringeal bademcik (adenoid), eşleştirilmiş tubal bademcikler ve lingual bademcikler ile birlikte "Waldeyer halkası" olarak adlandırılır. Sonuncusu, solunan veya yutulan patojenler ile aerosindirim sisteminin lenfoid dokuları arasındaki ilk temastan sorumludur1,2. Gerçekten de, çok sayıda rapor, palatin bademcik dokusu örneklerinde2-6 hem bakteriyel hem de viral antijenlerin tespit edilebileceğini göstermiştir.

Palatin bademcikler, tabakalı skuamöz, keratinize olmayan bir epitel ile kaplı yoğun lenfoid dokudan oluşur. Bademcikler, parankimmaya nüfuz ederek yüzey alanını artıran çok sayıda kript, epitel istilasına sahiptir. Histolojik olarak, palatin bademcikler, B hücresi olgunlaşması ve farklılaşması (B hücresi alanları) bölgeleri olan germinal merkezlere sahip çok sayıda lenfoid folikül içerir. Benzer şekilde, palatin bademcikler, esas olarak ekstrafoliküler bölgelerde (T hücresi alanları) bulunan T hücrelerini kapsar. B ve T hücrelerine ek olarak, palatin bademciklerde çeşitli foliküler dendritik hücreler de tespit edilebilir1,2.

Anatomik yerleşimleri nedeniyle palatin bademciklere cerrahi müdahalelerle kolayca ulaşılabilir durumdadır. Örneğin, tonsillektomi olarak bilinen bademciklerin cerrahi olarak çıkarılması dünya çapında rutin olarak yapılmaktadır7. Bademcik hiperplazisi olan çocuklarda, bazen bademciklerin kısmi cerrahi olarak çıkarılması (tonsillotomi) kullanılır ve bu da hastalara ameliyat sonrası daha az ağrıya neden olur. Bademciklerde çeşitli patojenlerin birikimi göz önüne alındığında, cerrahi olarak çıkarılan bademcikler, viral ve bakteriyel ajanların bademcik lenfosit fonksiyonları üzerindeki etkisini incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar2,8. Ayrıca, bazı patojenlerin belirli hücre alt popülasyonlarında bulunmayı tercih edip etmediğini incelemek mümkündür9. Ek olarak, bademcikler B lenfositleri açısından zengin bir kaynak olduğundan, izole edilmiş bademcik B lenfositleri, farklı B hücresi alt popülasyonlarının aktivitesini incelemek için verimli bir şekilde kullanılabilir10. Bununla birlikte, palatin bademcikler hücre tiplerinin bir karışımını içerdiğinden, farklı hücre alt popülasyonlarını ayırmak için etkili bir yönteme ihtiyaç vardır.

Burada, manyetik olarak aktive edilen hücre ayırma tekniği kullanarak insan palatin bademciklerinden tonsiller B ve T hücre popülasyonlarının verimli ve hızlı bir şekilde izole edilmesi için basit bir yöntemi açıklıyoruz (Şekil 1). Burada açıklanan yöntem, palatin bademcikler gibi insan lenfoid organlarında farklı enfeksiyöz ajanların rolünü değerlendirmek isteyen bilim adamları için yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, insan hasta malzemeden lenfoid hücrelerin izolasyonu açıklar ve bu nedenle etik onayı gerekiyor. Bu çalışmada yapılan çalışmalar Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (DNR. 2013/387) tarafından verildi.

İnsan Palatine Bademcikler dan Mononükleer Hücreleri (ÇUŞ) 1. İzolasyonu

UYARI: kan, doku veya vücut sıvıları gibi insan kaynaklı tüm elenmemiş malzeme potansiyel enfekte materyal olarak kabul edilmelidir. Bu nedenle, insan dokuları işlemek için önerilen biyogüvenlik uygulamaları takip edilmelidir.

Not: kontaminasyonunu önlemek için, her çözeltiler ve hücre kültürü ekipmanları steril olması gerekmektedir. Tüm tamponlar ve solüsyonlar önceden soğutulmuş ve buz üzerinde tutulmalıdır. Tonsil dokular ve izole hücreler tutulur ve buz üzerinde tutulmalıdır.

  1. Tonsillektomi veya tonsillotomy (Şekil 2) uygulanan hastalarda taze bademcikler edinin. Doku clum Plunge% 5 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM Glutamin, 0,05 mg / gentamisin ve% 1 antibiyotik antimikotik karışımı ml (penisilin buz soğukluğunda steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) ile dolu bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne ps Streptomisin ve Amfoterisin B).
  2. Buz üzerinde her zaman batık bademcik dokusu örnekleri ile tüpleri tutun. En kısa sürede bademcik işlemek için çalışın, ve en geç cerrahi müdahaleden sonra 3 saat daha.
  3. Buz üzerinde 60 mm plastik hücre kültür plaka üzerinde bademcik yerleştirin ve HBSS ile nemlendirilmiş doku tutun. Bademcik yüzeyinden temiz bir forseps ile görünür kan pıhtılarını, yağlı ve bağ dokuları çıkarın.
  4. 5 ml HBSS içeren yeni 60 mm hücre kültürü plakası kullanın. Makas ve / veya bir neşter steril bir çifti kullanılarak 3-10 mm parçalara bademcik dokusu yığın kesin.
  5. HBSS 10 ml içeren yeni 60 mm hücre kültürü tabak hazırlayın ve HBSS çözeltisi içinde 100 mikron plastik hücre süzgeç yerleştirin.
  6. Diss aktarınSteril forseps ile hücre süzgecinden içine yansıtılmaktadır bademcik fragmanları. Plastik şırınga pistonu ucunu kullanarak, sorunsuz hücre süzgecinden doku parçaları sıkın. Bademcik fragmanları tamamen HBSS dalmış emin olun.
  7. Doku kalıntıları hücre süzgecinden atın ve bir 50 ml plastik bir santrifüj tüpüne 60 mm hücre kültür plakasından elde edilen hücre süspansiyonu aktarın. Adımlar 1.8 ve 1.9 ile devam ederken buz üzerinde tüp bırakın.
  8. Büyük bademcikler durumunda, boyutu 2 cm'den büyük (Şekil 2), süzgeç örgü tıkanmasını önlemek için iki hücre süzgeçler de bademcik parçaları sıkın.
  9. Hücre süspansiyonu 35 ml'lik nihai hacim elde edilir.
    Not: Bu aşamada, dondurarak saklama (bakınız bölüm 2) hücre süspansiyonu hazırlamak mümkündür.
  10. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne Ficoll gibi yoğunluk gradyan çözeltisi 10 ml ekleyin. Yavaşça hücre Suspens bindirmeİyon yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine (aşama 1,9). Hücre süspansiyonu ve yoğunluk dereceli çözeltisinin karıştırılması kaçının.
    Not: yoğunluk gradyan çözeltisi, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı gerekir.
  11. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 700 xg'de bir salıncak-out rotor hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Degrade bozabilir hızlı frenleme olarak santrifüj fren işlevini etkinleştirmek etmeyin. Ayrıca, santrifüj mevcut olan en düşük ivme işlevini kullanın.
    Not: Bu santrifüj aşamasından sonra, tüpün alt kısmında tortu bir ara yüzeyde kabarık beyaz tabaka ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC), fibroblastlar ve hücre kalıntıları olarak ÇUŞ'larına dikkate alınmalıdır.
  12. Dikkatlice 10 ml pipet kullanarak ÇUŞ'ları katmanı toplamak. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu yerleştirin.
  13. Hücre süspansiyonuna buz soğukluğunda PBS 25 ml ilave edilir ve 4 ° C 'de dışarı salınan bir rotor 5 dakika boyunca 300 x g'de tüp spin.
  14. 25 ml'lik bir pipet kullanarak süpernatantıve hücre pelet yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, PBS, 15 ml hücre pelletini.
    Not: Son yıkama aşamasından sonra, hücre süspansiyonu (bakınız bölüm 2) cryopreserve mümkündür.
  15. Hemositometre hücre sayım bölmesi içinde hücre süspansiyonu 10 ul uygulayın ve bir mikroskop altında hücre sayısını. Hücreler uygun miktarda dağıtın (örneğin, 2-3 x 10 7) takip eden manyetik boncuk ayrılması için bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne. Adım 3.2 kadar buz üzerinde bu kısım tutun.

Tonsil Hücre 2. Kryoprezervasyon

  1. Donma orta (% 90 FBS ve% 10 DMSO) hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de donma medyayı tutmak.
  2. Bir hemositometre hücre sayım odasını (adım 1.15) ile hücrelerin toplam sayısını belirler. İstenen donmuş hücre yoğunluğuna göre dondurma orta gerekli miktarını hesaplayın (örneğin, 10 7 hücres dondurma ortamı / ml).
  3. 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Hücre topaklarını bozmadan süpernatantı boşaltacaktır ve (aşama 2.1) buz gibi soğuk dondurma ortamı içinde hücre pelletini.
  4. Sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolama için tasarlanmış steril şişelere hücre süspansiyonu 1 ml'lik numuneler koyun. Bir izopropanol odasında şişeleri dondurun ve -80 ° CO / N saklayın. Uzun süreli korunması için depolama tankı veya -140 ° C hücre dondurucu içeren bir sıvı azot içine şişeleri aktarın.
  5. Dondurulmuş hücreler şişeleri çözülme için, 37 ° C su banyosu içinde hızla onları sıcak. Çözülmüş hemen zaman (takviyeleri ile 1.1 adım a) önceden ısıtılmış HBSS 10 ml hücre süspansiyonu dispers 15 ml santrifüj tüpüne. (1.1 adım takviyeleri ile), 5 dakika boyunca 300 x g'de tüp Spin HBSS çıkarın ve HBSS, istenen hücre yoğunluğuna hücre pelletini.
    Not: ÇUŞ af canlılığınıter çözme Ölü hücrelerin varlığı saflaştınldı B ve T lenfositleri nihai verim düşecektir, önem taşımaktadır.
    Not: hücre izolasyon verimi azaltacaktır hücre canlılığı az% 80 daha sonra bizim deneyim göre.

Tonsil ÇUŞ'larının T Lenfosit Nüfus 3. Pozitif Seçimi

Not 1: Bu protokol, CD3 antikoru bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak Tonsiller çok uluslu insan CD3 + T lenfositlerinin pozitif seçimi dayanmaktadır. Taze (Bölüm 1) veya dondurulmuş (Bölüm 2) çok uluslu şirketler bu bölümü başlatmak mümkündür.

Not 2: 3 x 10 7 uluslu şirketler ile başlayın. Ayırma sütunları tıkayabilir ve bu izolasyon verimi azaltacaktır çünkü, bu hücre sayısı aşmayın. Daha fazla hücre ele alınacak olursa büyük sütunları kullanın. Bu protokolde kullanılan hacimleri deneysel hücrelerin bize sayısı için optimize edilmiştirBizim deneysel kurulum ed.

  1. Ayırma tamponu [PBS (pH 7.2),% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA] hazırlayın. 4 ° C'da bir 0.45 um filtre ve mağaza boyunca ayırma tamponu filtre.
  2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de ÇUŞ'ları süspansiyonu (basamak 1,14) dönerler. Buz soğukluğunda ayırma tamponu 240 ul ile sonuçlanan hücre pelletini (10 7 hücre başına 80 ul) yeniden süspanse edin. Steril 2 ml'lik bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın.
  3. Hücre çözeltisine, CD3 manyetik antikorun 20 ul ekle. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin durumda tutmak için sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edin.
  4. Hücreleri yıkamak için 5 mi, buzla soğutulmuş ayırma tamponu ihtiva eden 15 ml'lik bir tüp içine hücre süspansiyonu her aktarın.
  5. Dışarı salınan bir rotor, 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin tüp.
  6. Bu arada manyetik ayırıcı ve sütun kurdu. Stand manyetik ayırıcı takın ve Separ sütun yerator. Buz soğukluğunda ayırma tamponu 500 ul uygulayarak sütun yıkayın. Akışını atın.
  7. Sütunun altında yeni bir 15 ml toplama tüpü yerleştirin. Buz üzerinde toplama tüpü bulundurun.
  8. Pipet ile süpernatantı (adım 3.5) atın ve yavaşça 500 ul ayırma tampon içinde hücre pelletini. Önceden yıkanmış sütunun üstüne hücre süspansiyonu uygulayın ve içinden çalıştırın.
    Not: Hücre kümeleri sütun yapışmasına neden olabilir ve bu şekilde akış hızını azaltabilir. Bu sorunu önlemek için, kolonun tepesinde bir 40 um plastik hücre süzgeci yerleştirin. Bu örgü sayesinde hücreleri Passing çok bu yöntemin etkinliğini artıracaktır.
  9. Ayırma tamponu, 1.5 ml (10 7 hücreleri için 500 ul) ile sütun 4 kez yıkayın. Bir sonraki yıkama adımı uygulamadan önce (hiçbir sıvı sütununda dikkat edilmelidir) boş sütun rezervuar bekleyin.
    Not: B lenfosit kısmıyla olarak kabul CD3 etiketsiz hücreleri elde, oldukları gibitoplama tüpüne yıkandı.
  10. Yeni 15 ml toplama tüpüne ayırıcı ve yerden sütun çıkarın. Pipet kolonuna ayırma tamponu 2 mi. T lenfosit fraksiyonu olarak kabul edilmektedir olumlu seçilmiş T lenfositleri, Zehir sütununda verilen piston kullanma.
  11. Saflaştırılmış hücreler (adım 1.15) Gerekirse sayısını belirler. Hücre süspansiyonları, artık aşağı doğru deneyler için hazırdır.

İzole 4. Akım Sitometri Analizi Tonsil B ve T Lenfositler

DİKKAT: Paraformaldehit çözüm tahriş edici ve kanserojen olabilir. Çalışırken uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz / yüz koruyucusu kullanın.

Not 1: Bu protokol (FACS) analizi Kontrol THP izole edilmiş B ve T hücrelerinin doğrudan boyanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu adımın amacı popülasyonları af izole hücre saflığını değerlendirmek içinter CD3 manyetik antikor ayırma. Bu amaçla kurulan B ve T hücre belirteçleri için fluorofor konjuge monoklonal antikorlar CD20-FITC ve CD2-APC kullanılır. Ayrıca izotip kontrol antikorları dahil yüksek CD2 ve CD20 antikorlarının (adım 4.8) arasında spesifik olmayan bağlanma "arka plan" ayırt önerilir.

Not 2: Bu boyama zamanına kadar 4 ° C 'de bir% 1 paraformaldehid içinde karanlıkta (PFA) çözeltisi saflaştırılmış hücre fraksiyonları tutmak mümkündür (örneğin, ertesi gün).. Boyama ve FACS analizi arasında bir zaman boşluğu olduğu takdirde de aynı prosedür uygulanabilir. Her iki durumda da hücreler PBSA lekelenme veya FACS analizi öncesinde tamponu (PBS% 0.2 BSA ihtiva eden) ile düzgün yıkanmalıdır unutmayın.

  1. Adım 3.10 aşama 3.9 ve T lenfosit fraksiyonu, B lenfosit kısmını (önceki sütuna uygulamadan) aşama 1.15 den çok uluslu şirketler 6 x 10 6 hücre çıkar.
  2. Hücreyi Spindışarı salınan bir rotor kullanılarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de süspansiyonlar.
  3. Pipetle Süpernatantı ve buz gibi soğuk PBSA'da 1 ml ile bir kez hücre pelet yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonları dönerler. Pipetle Süpernatantı ve tekrar süspansiyon buz soğukluğunda PBSA tampon 600 ul hücre.
  4. FACS tüpün alt hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
  5. PBS, her tüpe,% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ihtiva eden 100 ul eklenir, iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında ~ 1 dakika veya buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
    Not: B lenfositleri Fc reseptörleri taşıyan. Fc bloke etmek için saflaştırılmış hücre fraksiyonları% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ile inkübe edilir reseptörleri. Insan serumu, 1 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edilerek inaktive ısıdır. -20 ° C'de dondurulur, küçük kısımlar ve mağaza, ısı ile inaktive edilmiş serum bölün.
  6. Bir sw 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücre süspansiyonuing-out rotor.
  7. Pipetle Süpernatantı ve 1 ml PBSA'da hücre pelet yıkayın. Santrifüj (4 ° C 'de 5 dakika süre ile 300 x g) tekrarlayın.
  8. Buz üzerinde, her bir tüpe 100 ul PBSA ekleyin. Üreticinin tavsiyesine göre, florofor konjuge monoklonal antikorun uygun miktarda ekleme (örneğin, anti-CD20 20 ul ve / veya albümin 100 ul anti-CD2 antikorlarının 5 ul). Not: FACS analizi için yeterli kontrol tüpleri atamak unutmayın. Bu protokol, aşağıdaki kontroller dahil edilmelidir: ayrı ayrı anti-CD2 ve anti-CD20 antikorlar ile boyandı 1) hücreler, ek olarak bireysel olarak, anti-CD2 ve anti-CD20 izotip kontrol antikorları ve 3) hücreleri ile boyanmış 2) hücreleri Antikorların.
  9. Kısaca tüp vorteks ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  10. PBSA'da 2 kez yıkayın. Örnekler 1,% PFA çözeltisi 2 ml ilave edilir. Hücreler 4 ° C'de PFA çözeltide kalır edelim76; FACS analizi zaman kadar karanlıkta C.
  11. Hemen FACS makinesinde örnekleri çalıştırmadan önce, (4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g), albümin ile hücreler 2 kez yıkayın. 1 ml PBS ile yeniden süspanse Numuneler akış sitometresi üzerinde ayırma, ışıktan korunan, 4 ° C'de (ya da buz üzerinde) tutmak.
  12. Üretici sitometresi akışından protokolü aşağıdaki FACS sıralama yapın.

İzole Tonsil B ve T Lenfositlerindeki Adenovirüs DNA'nın 5. PCR Algılama

Not 1: adeno virüs hekson geni primerleri AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') ve AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'), 11. Bu primerler, 139 bp'lik bir amplikon üretir. Ev sahibi 18S rRNA gen primerler tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') ve tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3') ile tespit edilebilir. Beklenen Amplikon boyutu 300 bp olduğunu.

Not 2: Her PCRÇalışma bir negatif kontrol (damıtılmış H2O) ve insan adenovirüs tip 5 12 ile enfekte edilmiş insan B hücre çizgisi (BJAB) elde edilen bir DNA pozitif kontrolü içerir.

  1. Silika membran bazlı kolon arıtma yöntemi kullanılarak (en az 1 x 10 6 hücre, adım 3.11) DNA ayıklayın. Fenol ve guanidin izotiyosiyanat çözeltisi 13 kullanarak, RNA yı ekstrakte edin.
  2. 1x HF tamponu, deoksinükleotid trifosfat karışımı 0.2 mM (dNTP), 0.25, her bir primerden uM ve 20 ul bir toplam hacim içinde Yüksek Fidelity DNA polimeraz 1 U ihtiva eden bir reaksiyon karışımına, B ve T lenfositleri 100 ng DNA ekleyin.
  3. Aşağıdaki çevrim koşulları altında PCR amplifikasyonu yapın: 10 sn, 67 ° C (hekson) ya da 58 ° C (18S rRNA) 30 sn için ve 72 ° C sıcaklıkta 98 ​​° C 30 döngü, ardından 98 ° C'de 30 saniye denatürasyon, 30 sn. PCR reaksiyonu, 72 ° C'de 7 dakikalık son bir uzatma aşaması ile sona erdirildi.
  4. Elde edilen PCR amplif Ayrı1x TBE içinde% 1.5 agaroz jeli üzerinde ication ürünleri tampon ve nükleik asit boyası ile boyandı, beklenen şeritleri görselleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B ve T lenfositlerinin yüksek oranda saflaştırılmış alt popülasyonlannda tonsil uluslu şirketlerin sonuçların verimli bir ayırma. Bu B ve T lemfosit popülasyonları sırasıyla (Şekil 3A) tespit etmek için bir anti-CD20 ve anti-CD2 antikorları kullanılarak FACS analizi ile teyit edilmiştir. Bunun aksine, B ve T lenfosit alt (Şekil 3B) hem de bir hücre karışımı hücre fraksiyonlarında uluslu şirketlerin sonuçların etkisiz bir ayrılması.

İzole bademciği B ve T lim...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün sonucunu etkileyen en önemli faktörlerden biri başlangıç ​​malzemesi olarak taze tonsil malzeme kullanılmasıdır. Bu nedenle, bademcik örnekleri ameliyat sonrası 3 saat içinde işlenmelidir. Bademcikler yetişkinler hem de çocuklar elde edilebilir. Çocuklar bademcik malzeme nedeniyle bademcik (tonsillotomy) kısmi cerrahi olarak çıkarılması genellikle küçüktür. Bu nedenle, çok uluslu sayısı az tonsillektomi örneklerinde (1 x 10 8 -2 x 10 9) karşılaştırılır tonsillotomy örneklerinde (1 x 1...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, İsveç Kanser Derneği (11 0253, 13 0469), İsveç Araştırma Konseyi (K2012-99X-21959-01-3), Marcus Borgströms Vakfı ve İsveç Araştırma Konseyi tarafından Uppsala RNA Araştırma Merkezi'ne (2006-5038-36531-16) yapılan bir hibe yoluyla desteklenmiştir. FACS analizinde çok yardımcı oldukları için Uppsala Üniversitesi'ndeki BioVis çekirdek tesisine borçluyuz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) Gibco14175-053%5 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM Glutamin,      içerir; 0.05 mg/ml Gentamisin ve %1 Antibiyotik-Antimikotik karışımı
Donma ortamı%90 FBS ve %10 DMSO
MACS tamponuPBS (pH 7.2), %0.5 BSA ve 2mM EDTA
PBSA %0.2 BSA içeren PBS
PFA%1 paraformaldehit (PFA) içeren PBS. Taze yap. PFA'nın kanserojen olduğundan şüphelenilir. Eldiven ve gözlük takın.
Antibiyotik-Antimikotik karışımıGibco15240-062
60 mm PetridishNunc150326
Diseksiyon forecepsFisher Scientific1381241
Düz iris makası Fisher Scientific12912055
tek kullanımlık neşterlerSwann-MortonREF 0501
100 & m plastik hücre süzgeciCorning Yaşam Bilimleri352360
40 μ M Plastik Hücreli Süzgeçler Corning Yaşam Bilimleri352340
2 ml plastik şırıngaBD Biosciences 
15 ml konik santrifüj tüpleriSARSTEDT62554502
50 ml konik santrifüj tüpleriSARSTEDT62547254
Sabit açılı veya döner kova rotorlu düşük hızlı santrifüjThermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll– HypaqueSigma-AldrichF5415-50MLFicoll çözeltisi
Fetal buzağı serumuBiyolojik endüstriler040071A
Dimetil sülfoksit (DMSO)SIGMAD2650-5X5ML
MACS MS sütunları Miltenyi Biotec130-042-201
MACS insan CD3 Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-092-881
MACS ayırıcı (Octo MACS)Miltenyi Biotec130-042-109
Sığır Serum Albümini (BSA)Merck Millipore 1120180100
EDTAAnalaR NORMAPUR20302.293
CD2 allofikosiyanin ( CD2-APC) BD Biyobilimler & nbsp;
CD20, floresein izotiyosiyanat (CD20-FITC) ile konjuge edilmiştir.BD Biyobilimler & nbsp;
İnsan serumu Rockland İmmünokimyasallarD119-0100
Phusion Yüksek Sadakatli DNA PolimerazThermo ScientificF-530L
FACS tüpleriBD Falcon352003
KriyotüpSARSTEDT72379
BD LSRII akış sitometresiBD Biosciences 
BD FACSDiva 4.1 yazılımıBD Biosciences 
Nükleospin Kanı Macherey-Nagel740951.50DNA izolasyon kiti
TRIzol  reaktifYaşam teknolojileri15596RNA izolasyon reaktifi
HemositometrePaul Marienfeld GmbH & Co. KG0610030hücresi sayma cihazı
GelRedBiotium41003Nükleik asit jel boyası 
,300185560642556632

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nave, H., Gebert, A., Pabst, R. Morphology and immunology of the human palatine tonsil. Anat Embryol (Berl). 204, 367-373 (2001).
  2. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology today. 19, 414-421 (1998).
  3. Alkhalaf, M. A., Guiver, M., Cooper, R. J. Prevalence and quantitation of adenovirus DNA from human tonsil and adenoid tissues. J Med Virol. 85, 1947-1954 (2013).
  4. Brandtzaeg, P., Halstensen, T. S. Immunology and immunopathology of tonsils. Adv Otorhinolaryngol. 47, 64-75 (1992).
  5. Imai, S., et al. Epstein-Barr virus (EBV)-carrying and -expressing T-cell lines established from severe chronic active EBV infection. Blood. 87, 1446-1457 (1996).
  6. Veen, J., Lambriex, M. Relationship of adenovirus to lymphocytes in naturally infected human tonsils and adenoids. Infect Immun. 7, 604-609 (1973).
  7. Friedman, M., Wilson, M., Lin, H. C., Chang, H. W. Updated systematic review of tonsillectomy and adenoidectomy for treatment of pediatric obstructive sleep apnea/hypopnea syndrome. Otolaryngol Head Neck Surg. 140, 800-808 (2009).
  8. Garnett, C. T., et al. Latent species C adenoviruses in human tonsil tissues. J Virol. 83, 2417-2428 (2009).
  9. Garnett, C. T., Erdman, D., Xu, W., Gooding, L. R. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J Virol. 76, 10608-10616 (2002).
  10. Perez, M. E., Billordo, L. A., Baz, P., Fainboim, L., Arana, E. Human memory B cells isolated from blood and tonsils are functionally distinctive. Immunol Cell Biol. 92, 882-887 (2014).
  11. Cooper, R. J., Yeo, A. C., Bailey, A. S., Tullo, A. B. Adenovirus polymerase chain reaction assay for rapid diagnosis of conjunctivitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 90-95 (1999).
  12. Zhang, Y., Huang, W., Ornelles, D. A., Gooding, L. R. Modeling adenovirus latency in human lymphocyte cell lines. J Virol. 84, 8799-8810 (2010).
  13. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. biochem. 162, 156-159 (1987).
  14. Watanabe, T., Yoshizaki, K., Yagura, T., Yamamura, Y. In vitro antibody formation by human tonsil lymphocytes. J Immunol. 113, 608-616 (1974).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

B Lenfosit zolasyonuT Lenfosit zolasyonuPalatin Tonsil lemeManyetik Boncuk ile Ay rmaYo unluk Gradyan Santrif jlemeAk Sitometrik AnalizAdenovir s DNA TespitiCD3 Pozitif T H creleriCD20 B H cre Mark rnsan Tonsil Dokusu

İlgili makaleler