Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

Özet

Burada, geri dönüşümsüz bir endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) inhibitörünün (L-Nio) lokal enjeksiyonu ile murin beyaz cevherinde fokal inme üretimi için metodoloji sunuyoruz. Bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişleten iki stereotaktik varyasyon, retrograd nöronal izleme ve taze doku etiketleme ve diseksiyon sunulmaktadır.

Özet

İnme klinik inme sunumlar% 25'e kadar beyaz madde hesaplarını etkileyen, 5-10 kat daha büyük olabilir fiyatla sessizce gerçekleşir ve vasküler demans gelişmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. fokal beyaz cevher inme birkaç model var ve uygun modellerin bu eksikliği inme bu tip sonra yaralanma tepki ve onarımında yer alan nörobiyolojik mekanizmaları anlaşılmasını engelliyordu. diğer subkortikal inme modellerinin ana sınırlama fokal beyaz cevher infarkt kısıtlamak değil ya da öncelikle olmayan fare türlerinde valide edilmiş olmasıdır. Bu beyaz cevher inme nörobiyolojisini incelemek için fare araştırma araçları çok çeşitli uygulama becerisi sınırlar. Burada geri dönüşü olmayan bir eNOS inhibitörü bir lokal enjeksiyonu kullanılarak fare beyaz cevherde fokal inme güvenilir üretimi için bir metodoloji sunuyoruz. Biz de iki benzersiz stereotaktik dahil olmak üzere genel protokol üzerinde çeşitli varyasyonlar mevcutvaryasyonlar, büyük ölçüde bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişletmek retrograd nöronal izleme yanı sıra taze doku etiketleme ve diseksiyonu. Birden fazla yaklaşımlar inme bu ortak ve ilgili yeterli formun nörobiyolojik etkilerini analiz etmek için bu varyasyonlar izin verir.

Giriş

Subkortikal beyaz cevheri etkileyen inme, ABD'de yıllık klinik inmelerin %25'ini oluşturan yaygın bir klinik durumdur ¹. Beyaz cevhere iskemik hasar da sessizce önemli ölçüde daha yüksek bir oranda meydana gelir ve vasküler demans gelişimine katkıda bulunur ^2,3. Halen, bu serebral iskemi formuna sahip hastalar, herhangi bir tedavi seçeneği varsa, çok azdır. Bu hastalığın klinik önemine rağmen, klinik olarak anlamlı az sayıda hayvan modeli mevcuttur ^4,5.

Bu protokolün amacı, murin beyaz cevheri içinde fokal iskemik bir lezyon oluşturmaktır. İnsan hastalığının bu murin modeli, inmeye aksonal yaralanma tepkisinin ve beyaz cevherin hücresel elemanlarının, yani aksonlarla birlikte oligodendrositler ve astrositlerin, inme sonrası nasıl tepki verdiğini ve onarıldığını spesifik olarak incelemeye izin verir.

Önceki raporlar, burada tarif edilene benzer bir endotelin-1 (^{ET-1) 6} kullanan bir subkortikal beyaz cevher inme modelini tanımlamıştır. Deney protokolünde birkaç önemli değişiklik yapılmış ve bu nedenle bu modelin potansiyel kullanımları genişlemiştir ^7,8. Bu protokol, fare beyni beyaz cevheri içinde bir odak vuruşu üretmek için güvenilir ve değiştirilebilir bir strateji sağlar.

Bu modelin en büyük avantajları, kimyasal bir endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) inhibitörü olan N(5)-(1)-iminoetil-L-ornitin HCl (L-Nio) ^9'un kullanılmasıdır, bu da endotelin-1 ¹⁰ kullanan modellerin bir komplikasyonu olan beyaz cevherin hücresel elemanları üzerinde bilinen hiçbir parakrin etkisi yoktur. Ek olarak, faredeki beyaz cevherin stereotaktik hedeflemesi, inmenin beyin beyaz cevheri üzerindeki etkisini belirlemek için mevcut araçları büyük ölçüde genişleterek, her türlü transgenik veya nakavt suşun kullanılmasına izin verir. Burada, bu tekniğin iki varyasyonu açıklanmış ve aksonal ve beyaz cevher hasarının anlaşılmasını ve inme sonrası onarımını geliştirmek için kullanılabilecek bazı ek varyasyonları göstermiştir.

Protokol

Bu protokolde hayvanların kullanımı Kaliforniya Los Angeles Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır.

Not: Hedef fare nüfusu belirleyerek başlayın. Önceki çalışmalarda, sadece erkek doğal tipte C57 / BL6 fareleri, ancak çeşitli transgenik ya nakavt fareleri de kullanılabilir, kullanılmıştır. stereotaktik koordinatlar C57 / BL6 anatomi dayalı olduğunu unutmayın. Her kullanıcı başlangıçta beyaz cevher inme lokalizasyonu doğrulamak tavsiye edilir.

1. Beyaz Matter İnme İndüksiyon - medial Açılı Yaklaşım

1. Distal çapı 15-25 ^{um, 11} arasında olacak şekilde 0.5 mm kapiler tüp kullanılarak çekilen cam pipet hazırlanmasıyla başlar.
2. steril% 0.9 normal tuzlu su içinde 27.4 mg / ml (130 uM) de - L-NIO bir steril 10 ul alikosu ((1) -iminoethyl-L-ornitin HCI N- (5)) hazırlamak.
3. çekti cam pipet Ön doldurmakcam pipet sabitlenmesiyle, L-NIO (2-5 | il), küçük bir hacme sahip bir vakum hattına bağlı boruya. tezgah üstünde pipet düz Lay ve L-Nio çözeltisi içine çekti ucunu.
   1. Pipet 0.5 mm'lik bölümünün en az 2 mm dolana kadar vakum uygulanır. Vakumu kapatın ve pipet çekin. Adım 1.12 kadar bir kenara koyun.
4. Indüksiyon odasında fare yerleştirin ve standart% 32 izofluran kullanarak fare anestezi neden bir buharlaştırıcı akan (5 L / dk 5 L / dk oksijen ve 0,5 L / dk ile inhale _N2) 1 dakika boyunca ya da derin anesteziye kadar. stereotaktik mikroskop ile donatılmış bir stereotaktik aparatı fareyi aktarın. Bir buharlaştırıcı akan% 32 izofluran kullanarak bakım anestezi sağlamak ve bir burun konisi (2 L / dk 5 L / dk oksijen ve 0.5 L / dak N ₂ ile inhale). Bir ayak tutam anestezi derinliğini kontrol edin.
5. 36 ° enjeksiyon kolunu ayarlayın.
6. Affixa düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sistemi uzak ucuna cam pipet tutucu çekti ve stereotaktik kurulum enjeksiyon koluna takın.
7. Coat iki gözün üstünde vazelin ve yer suni gözyaşı merhemi ile anestezi hayvanın bıyık. başının üzerinde bir 5-10 cm açıklığı olan hayvanın başının üzerinde steril örtüyü koyarak steril cerrahi alanında hazırlayın. kafatası örten kürk tıraş tarafından aspetic cerrahi yüzey hazırlayın. alternatif betadin ve% 70 alkol bezlerden ile kafa derisi temizleyin.
8. kafatası yüzeyi ortaya çıkarmak için steril ince makas ile 1,5 cm orta hat kafa derisi kesi olun. Steril bir pamuklu çubukla kafatası kurutun ve 1-3X büyütme stereotaktik mikroskop kullanılarak, steril bir mikro nokta aracını kullanarak herhangi bir üstte periost doku kaldırmak.
9. ince bir nokta kalem kullanarak bir referans noktası olarak Bregma işaretleyin.
10. steril ince stip cerrahi matkap ucu kullanarak 2 mm ellipitical kraniotomi Matkap0; bregma posterior başlayan ve öne sadece orta hat sol uzanan. kemik parçaları çıkarın ve serebral korteks görüntülenmiştir böylece yumuşak doku örten.
11. aralıklı steril serum fizyolojik damla uygulayarak cerrahi alan ve nemli kortikal yüzey tutun.
12. Stereotaktik aparatın enjektör koluna çekti cam pipet yapıştırın. Bregma ile pipet distal ucunu hizalayın ve stereotaktik koordinatlar sıfır.
13. İlk ön / arka (A / P) pipet ilerlemek ve / Tablo 1'de verilmiştir koordinatları (M / L) yanal medial.
14. kortikal yüzeye pipet ilerlemek ve dorsal / ventral (D / V) ölçümü sıfır.
15. Yavaş yavaş ilk D / V Tablo 1'de koordinat ulaşana kadar beyin içine pipet geçmektedir.
16. beyne L-NIO 100 nl enjekte ve reflü önlemek için 5 dakika bekleyin, 20 msn bakliyat için 20 psi ayarlanmış bir düşük hacimli basınçlı enjeksiyon sistemi kullanarakPipet parça yukarı.
    1. Stereotaktik mikroskop mercek ve 3X bir büyütme kalibre reticle kullanın.
    2. Buna uygun olarak, koordinat her biri için çekilen cam pipet (100 NL karşılık gelen 0.5 mm çapında bir pipet 0.5 mm uzunluğunda), 0.100 mm'lik toplam ³ yerinden. Bir el çantası kullanarak, ölçmek ve her kullanılan büyütme ve ölçekler bağlı olarak değişir kurmak beri standardize.
    3. hava-sıvı menisküs bir sagital görünümü vardır, böylece her enjeksiyon sırasında doğru hacim ölçümü için, yan mikroskopla açılı pipet yaklaşım. Menisküs pipet iç ve dış duvarın hem aynı odak düzlemi görünmelidir.
17. Yavaşça pipet çekilme ve adımları tekrarlayın 1.13-1.16.3 Tablo 1'de verilen koordinatlar ikinci ve üçüncü sette de.
18. Son enjeksiyondan sonra, pipet kaldırmak ve kraniyotomi sitesini dolduracak kadar kemik mumu yerleştirin. birKafa derisi yara kenarlarını pproximate dermal yapıştırıcı ile bağlanır.
19. Kafa derisi kesi ile ilişkili yerel ağrıyı önlemek için önlemek için steril bir 30 G iğne kullanılarak yara marjları içine% 0.5 marcaine 0.1 ml enjekte edilir.
20. 5 gün boyunca içme suyu konut ve arz post-operatif antibiyotik hayvan (0.48 mg / ml trimetoprim-sulfametoksazol veya 0.5 mg / ml Levofloksasin) döndürür.

2. Beyaz Matter İnme İndüksiyon - Posterior Açılı Yaklaşım

1. posterior anterior odaklı 45 dereceye stereotaktik kurulum enjeksiyon kolunu ayarlamak dışında, medial açılı yaklaşım protokolünde olduğu gibi adımları 1.1-1.12 gerçekleştirin.
2. İlk A / P pipet ilerlemek ve M / L Tablo 2'de verilmiştir koordinatları.
3. Komple kalan adımları yanal açılı yaklaşım protokolde olduğu gibi 1,14-1,20.

3. Retrograd Sinir Etiketleme

1. 10 steril hazırlanması% 0.9 normal serum fizyolojik içinde 54.8 mg / ml L-NIO ul alikosu.
2. % 0.9 normal serum fizyolojik içinde% 20 Fluororuby (veya% 20, biyotinlenmiş dekstran amin ya da% 2 Fluorogold) steril bir kısım hazırlayın.
3. 27.4 mg / ml L-Nio ve% 10 Fluororuby nihai konsantrasyonları için 1: Birlikte: 1 seyreltin.
4. adımlarda 1,3-1,23 olarak yukarıdaki vuruş protokolü gerçekleştirin.
5. Daha önce ⁸ açıklandığı gibi perfüzyon fiksasyon, cryosectioning ve mikroskopi ile doku bölümünde doğal floresan tracer gözünüzde canlandırın.

İmmünofloresan 4. Doku İşleme

1. 3 saat dan inme sonrası 14 gün arasında değişen uygun bir inme sonrası aralıklarla, izofluran doz aşımı ya da yerel IACUC üzerinden fareler prosedür onaylı euthanize.
2. açılı makas kullanarak göğüs boşluğu açın ve sol ventrikül içine bir 23 G kelebek iğne takın.
3. perfüzyon sıvısı için bir çıkış izini izin ince makas kullanarak sağ atrium küçük bir kesim yerleştirin.
4. Transkardiyal oda sıcaklığında, 10 ml / dk'lık bir oranda soğuk% 4 paraformaldehit 30-40 ml ve ardından soğutulmuş fosfat tamponlu tuz 30-40 ml serpmek.
5. fare başını kesmek ve posterior kafatası açmak için steril makas kullanarak beyin kaldırmak ve sonra yavaşça 24 saat süreyle soğuk% 4 PFA halinde beyin, bir spatula ile örten kafatası kaldırmak yerleştirin ve daha sonra 48 saat süreyle PBS içinde% 30 sakaroz transfer .
6. Bir kriyostat kullanarak devre mikron kayan kesitler hazırlamak ve daha önce ^6-8 tarif edildiği gibi, antikor işlemi gerçekleştirir. Bu çalışmada aşağıdaki antikorların kullanımı: tavşan anti-sinir lifi 200 (1: 500 seyreltme); tavşan anti-vimentin (1: 500); keçi anti-GFAP (1: 500); tavşan anti-IBA-1 (1: 1000).

Protein veya RNA Analizi 5. Doku İşleme

1. 3 saat dan inme sonrası 14 gün arasında değişen uygun bir inme sonrası aralıklarla, izofluran doz aşımı yoluyla euthanize ya da yerel IACUC prosedürü onayladı.
2. başını kesmekFare posteriora kafatası açmak için steril makas kullanarak beyin kaldırmak ve daha sonra bir spatula ile hafifçe örten kafatası kaldırmak ve.
3. Koku ampul ve optik sinirleri koparmaya beynin ön kısmında steril 4 mm spatula yerleştirin. Yavaşça calvarium üzerinden beyin kaldırın ve (1x Hank Dengeli Tuz Çözeltisi, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 35 mM glukoz, 4 mM sodyum bikarbonat, ve 0.01 mg / ml cyclohexamide) buz soğukluğunda tahlil tamponuna içine koyun.
4. Bir beyin blok ve steril yeni Jilet kullanarak, soğuk diseksiyon tampon içine inme ve yeri içeren 2-3 mm döşeme hazırlamak.
5. bir mikroskop altında enjekte yarımkürede beyaz cevher altta yatan motor korteksin tespit. uzun inme sonrası aralıklarla, bölge görsel fokal nekroz ve miyelin solukluk tarafından tespit edilebilir.
   (Daha önce inme sonrası aralıklarla,% 10 1 ul ile karıştırılmış L-NIO enjeksiyonu ise Hızlı Yeşil inme görsel kimlik izin verebilir: Not Şekil 4A).
6. Bir mikroskop rehberliğinde ve taze bir neşter kullanılarak altında, dikkatle Hızlı Yeşil etiketleme ya da doku kaybı ya tarafından belirlenen inme içeren beyaz cevher bölgeyi incelemek. istediğiniz gibi örten korteks ve altta yatan striatum çıkarın.

Sonuçlar

sunulan modeli kullanarak, beyaz cevher altta yatan ön ayakları sensorimotor korteks güvenilir hedeflenebilir. Tipik olarak insan laküner infarkt görüldüğü gibi kimyasal olarak bağlı kontur modeli, fokal aksonal ve miyelin kaybı, astrositoz ve microgliosis (Şekil 1) üretir. Üç iğne kullanarak, klinik olarak faydalı model ön ayakları, motor görevleri ⁷ erken yetmezliği ve beyin dokusu deneyimleri küçük ama önemli bir kısmı ile kurulan immünohistokimyasal, immun...

Tartışma

Subkortikal inme örneksiz bir dizi sıçan ^12-14 ve fare ^6,15 iç kapsüle endotelin-1 fokal enjeksiyonlar subkortikal beyaz madde ve striatum içeren tarif edilmiştir. Küçük odak vuruşları daha yeni modeller kolesterol mikroemboli karotis arter ¹⁶ enjeksiyon ve tek delici arteriole ¹⁷ Fototrombotik tıkanıklığı kullanmışlardır. Bu modellerin her biri avantaj ve dezavantajları ⁵ hem de sahiptir. Şu anda açıklanan model aksonal anormallikler ve zarar, miyelin bozulması, fo...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
L-N5- (1-İminoetil) ornitin, Dihidroklorür	Calbiochem	400600-20MG
İzofluran	Phoenix İlaç A.Ş.	NDC 57319-559-06
Kılcal borular	Dünya Hassas Aletler	50-821-807
Picospritzer	Parker Enstrümantasyon	Picospritzer II
Stereotaktik kurulum	Kent Scientific	KSC51725
Pipet çektirme	KOPF	Model 720
Stereomikroskop SZ51	Olympus	88-124
İnce makas	İnce Bilimsel Aletler	14084-08
Forseps	Harvard Aparatı	PY2 72-8547
Kavisli Forseps	Harvard Aparatı	PY2 72-8598
Künt diseksiyon aleti	İnce Bilimsel Aletler	10066-15
Matkap	Dremel	8220-1/28
Matkap uçları	İnce Bilimsel Araçlar	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimetoprim-Sülfametaksol	STI Eczane	NDC 54879-007-16
Flororuby	Florokrom Inc	30 mg
Paraformaldehit	Fisher	O4042-500
Sükroz	Fisher	BP220-10
Kriyostat	Leica CM3050 S
Cam kaydıraklar	Fisher	12-544-7
Hızlı Yeşil	Sigma	F7252-5G
Diseksiyon mikroskobu	Nikon	SMZ1500
23 G kelebek iğne	Fisher	14-840-35
10x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi Yaşam Teknolojileri		14065056
1 M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glikoz	Sigma	G8270
Sodyum bikarbonat	Sigma	S5761
Sikloheksamit	Sigma	01810