Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında yöntemin etkinliğini gösteren E. coli.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem
Bu makalede
Özet
Özet
Klorofil (Chls) ve bacteriochlorophylls (BChls) fotosentez ışık hasat ve elektron taşıma yürütmek birincil kofaktörleridir. Onların işlevselliği eleştirel büyük ve ayrıntılı birden fazla alt transmembran protein komplekslerinin içinde kendi özel organizasyon bağlıdır. Bu kompleksler güneş enerjisi dönüşüm nasıl kolaylaştıracağını moleküler düzeyde anlamak için, protein-pigment ve pigment pigment etkileşimleri ve heyecanlı dinamikleri üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Bu bulgu elde etmenin bir yolu oluşturmak ve basit suda çözünür rekombinant proteinlerle Chls komplekslerini inceleyerek gereğidir. Bununla birlikte, suda çözünür protein halinde lipofilik Chls ve BChls içeren zordur. Ayrıca, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler montajı için kullanılabilir genel bir yöntem vardır. Burada, eşek sağlayan su içinde yağ emülsiyonları dayalı basit ve yüksek verimli sistemi göstermektedirhidrofobik Chls suda çözünür proteinlerin embly. Yeni yöntem Chl, bir ile Brassicaceae bitki (WSCP) suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinin rekombinan versiyonları monte ile doğrulandı. Biz Chl başarılı derleme E. ifade WSCP bir kullanarak ham lizatları göstermek suda çözülebilen yeni bir Chl bağlayıcı proteinler için genetik ekran sistemi geliştirmek için kullanılabilir ve Chl-protein etkileşimleri ve montaj işlemlerinin çalışmalar için edilebilir coli hücre.
Giriş
Bu tür klorofil (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) ve karotenoidler gibi hidrofobik pigmentler elektron taşıma ve ışık enerjisi yakalama ve transfer yürütmek fotosentetik reaksiyon merkezleri ve hafif hasat proteinler birincil kofaktörleridir. Reaksiyon merkezleri ve Chl bağlayıcı ışık toplayıcı komplekslerinin en transmembran proteinlerdir. Olmayan oksijenik fotosentez yeşil-sülfür bakterilerin 1,2 Fenna-Matthews-Olson (FMO), protein, ve dinoflagellatlar 3 peridinin-Chl proteini (PCP) suda çözünür ışık toplayıcı proteinlerin olağanüstü örneklerdir. Suda çözünür klorofil bağlama proteinleri (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Chl bir stok Çözümler hazırlanması
- KRİTİK ADIM: ışık zararını minimuma indirmek için yeşil ışık (520 nm) veya karanlıkta altında kimyasal bir kaput klorofil hazırlık tüm adımları. Her depolama için pigmentler dondurma işleminden önce nitrojen veya argon ekleyin. Tüm çözücüler analitik dereceli olduğundan emin olun.
- Tilakoit membranlarda tek Chl A içeren liyofilize Spirulina platensis'in hücreleri veya diğer siyanobakteriyi hücrelerin yaklaşık 5 mg tartılır ve bir havan ve havan tokmağı kullanarak ezmek.
- cam kolonuna ezilmiş hücreleri yükleyin ve karotenoidler uzaklaştırmak için yaklaşık 50-100 ml% 100 aseton ile....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Rekombinant WSCP apoproteinler önceki bölümde tarif edilen protokole göre W / O emülsiyonları Chl A ile birleştirildi. Protokol saf WSCPs veya lizatları E. coli hücreleri WSCP aşırı eksprese eden (Şekil 1) ya da ihtiva eden sulu fazlar kullanılarak uygulanmıştır. protokol hızlı, basit ve bir doku homojenleştirici dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez.
Bu, ilgili ana kompleksleri .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Amacımız, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür klorofil bağlama proteinlerinin kurulması için bir yeni genel sistem geliştirmektir. Burada W / O emülsiyon dayalı yeni sulandırma sistemi rekombinant olarak E. ifade Brüksel lahanası, karnabahar, Japon horseradish ve Virginia pepperweed gelen WSCP apoproteinlerden montajı için çalışmaya kanıtlanmış genel bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir E. coli. Burada sonuç Chl, bir 10-misli molar fazlası ile WSCP 1 mg yeniden oluşturulması arasında sunulmak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
DN AB 7.ÇP projelerinin PEPDIODE (GA 256672) ve REGPOT-2012-2013-1 (GA 316157), ve İsrail Bilim Vakfı kişisel bir araştırma bursu (No 268/10) destek kabul eder. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri çekmek için Prof. Shmuel Rubinstein, Mühendislik Okulu ve Uygulamalı Bilimler, Harvard Üniversitesi, Cambridge MA, ABD teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mineral yağ | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Biyo-Ölçekli Mini Profinity eXact Kartuşları | Bio Rad | 10011164 | Doğal dizi ile WSCP saflaştırması için afinite kromatografisi. |
| His Trap HF sütunu | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | WSCP saflaştırması için afinite kromatografisi |
| GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Klorofil saflaştırması için kromatografi ortamı |
Kaynaklar
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorba....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
