Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Özet

Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında ​​yöntemin etkinliğini gösteren E. coli.

Özet

Klorofil (Chls) ve bacteriochlorophylls (BChls) fotosentez ışık hasat ve elektron taşıma yürütmek birincil kofaktörleridir. Onların işlevselliği eleştirel büyük ve ayrıntılı birden fazla alt transmembran protein komplekslerinin içinde kendi özel organizasyon bağlıdır. Bu kompleksler güneş enerjisi dönüşüm nasıl kolaylaştıracağını moleküler düzeyde anlamak için, protein-pigment ve pigment pigment etkileşimleri ve heyecanlı dinamikleri üzerindeki etkisini anlamak için önemlidir. Bu bulgu elde etmenin bir yolu oluşturmak ve basit suda çözünür rekombinant proteinlerle Chls komplekslerini inceleyerek gereğidir. Bununla birlikte, suda çözünür protein halinde lipofilik Chls ve BChls içeren zordur. Ayrıca, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler montajı için kullanılabilir genel bir yöntem vardır. Burada, eşek sağlayan su içinde yağ emülsiyonları dayalı basit ve yüksek verimli sistemi göstermektedirhidrofobik Chls suda çözünür proteinlerin embly. Yeni yöntem Chl, bir ile Brassicaceae bitki (WSCP) suda çözünür klorofil bağlayıcı proteinin rekombinan versiyonları monte ile doğrulandı. Biz Chl başarılı derleme E. ifade WSCP bir kullanarak ham lizatları göstermek suda çözülebilen yeni bir Chl bağlayıcı proteinler için genetik ekran sistemi geliştirmek için kullanılabilir ve Chl-protein etkileşimleri ve montaj işlemlerinin çalışmalar için edilebilir coli hücre.

Giriş

Bu tür klorofil (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) ve karotenoidler gibi hidrofobik pigmentler elektron taşıma ve ışık enerjisi yakalama ve transfer yürütmek fotosentetik reaksiyon merkezleri ve hafif hasat proteinler birincil kofaktörleridir. Reaksiyon merkezleri ve Chl bağlayıcı ışık toplayıcı komplekslerinin en transmembran proteinlerdir. Olmayan oksijenik fotosentez yeşil-sülfür bakterilerin ^1,2 Fenna-Matthews-Olson (FMO), protein, ve dinoflagellatlar ³ peridinin-Chl proteini (PCP) suda çözünür ışık toplayıcı proteinlerin olağanüstü örneklerdir. Suda çözünür klorofil bağlama proteinleri (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae ve Amaranthaceae bitkiler ^{4, 5,} başka ^bir eşsiz bir örnek, henüz FMO ve PCP aksine, bu hafif hasat ne de birincil fotosentetik reaksiyon herhangi de katılmaktadırlar ve onların kesin physiological fonksiyonları henüz ^5-8 belirsizdir. Bunların yüksek Chl-bağlama çekiciliği, geçici Chls taşıyıcıları ve CHİ türevleri ^9,10 olarak önerilen bir işleve yol açmıştır. Seçenek olarak ise, bu WSCP zarar hücrelerde Chls tutucu bir rol oynar ve Chl kaynaklı fotooksidatif hasara ^7,11-13 karşı koruma olduğu varsayılmıştır. Daha yakın zamanda, bir proteaz inhibitörü olarak bu WSCP işlevleri ileri ve otçul direnci sırasında önemli bir rol oynar gibi çiçek gelişimi ¹⁴ esnasında hücre ölümünü düzenlemektedir. WSCPs kendi fotofiziksel özelliklere göre iki ana sınıfa ayrılır. Birinci sınıf (sınıf I, örneğin. Chenopodium albümünden) aydınlatma üzerine Fotoçevrim uğrayabilir. Fotoçevrim ^5,10 uğramayan Brassica bitkileri, gelen Sınıf II WSCPs, başka bir sınıfı IIa bölünmüştür (örn., Brassica oleracea, Raphanus sativus elde edilmiş) ve IIb (örn., Lepidium virginicum gelen ). Lepidium virginicum Sınıf IIb WSCP yapısı 2.0 Å çözünürlükte ⁸ X-ışını kristalografisi tarafından çözüldü. Bu protein alt-birimleri, bir hidrofobik çekirdek oluşturan bir simetrik homotetramer ortaya koymaktadır. Her bir alt-birimi, tüm Chl düzenlemesi Chl-protein kompleksleri bağlanmasını ve montaj çalışmaları için WSCPs potansiyel olarak yararlı bir model sistemi sağlar, basit core.This içinde dört yakından dolu Chls sıkı bir düzenleme ile sonuçlanan tek bir CHL ve Chls komşu etkilerini bağlanan ve bireysel Chls spektral ve elektronik özellikleri protein ortamları. Ayrıca, yapay fotosentetik cihazlar ışık hasat modüller için kullanılabilir yapay Chl bağlayıcı proteinler oluşturmak için şablon sağlayabilir.

Bitkilerden izole kompleksleri her Chl a farklı kombinasyonları ile tetramerleri heterojen bir karışımı içerdiğinden nativ WSCPs titiz çalışmaları mümkün değildirve Chl b ^9. Bu nedenle, in vitro Chls ile rekombinant olarak ifade WSCPs monte edilmesi için bir yöntem olup gereklidir. Bu ¹⁵ gösterilmiştir tilakoit membranlarla apoprotein karıştırarak. Imkansız basit sulu çözeltiler içinde pigmentler ile suda çözünür apoprotein karıştırılmasıyla in vitro kompleks montajı yapar Chls ihmal edilebilir suda çözünürlüğü ile in vitro olarak toplanması meydan, ama Bu yöntem, Thylakoid'in nativ Chls mevcut sınırlıdır. Schmidt ve ark. rekombinant olarak E. bir histidin-etiketli proteini ifade ederek karnıbahar (CaWSCP) den WSCP ile birkaç Chl ve BChl türevleri montaj bildirildi E. coli, bir Ni-afinite sütunu üzerine hareketsiz ve deterjanlar ¹¹ içinde çözünür Chl türevleri sokulması. Başarıyla A. Rekombinant WSCPs yeniden oluşturulması thaliana ^6, ve Brüksel lahanası (BoWSCP), Japon turp (RshWSCP) birbenzer bir yöntemle D Virginia pepperweed (LvWSCP) bildirilmiştir.

Burada, bir roman, proteinler etiketleme gerektirmez WSCP ile Chls montaj veya immobilize genel, basit bir yöntem mevcut. Mineral yağ içinde suda çözünür apoproteinlerden sulu çözeltilerden emülsiyonları hazırlamak dayanır. Proteinleri, hacim oranı ¹⁶ su-içinde-yağ (o / w), çok yüksek bir yüzey ile mikro damlacıklar içinde kapsüllenir. hidrofobik kofaktör daha sonra yağ içinde eritilir ve hali hazırda yağ fazından damlacıklar halinde yerleştirilir. Biz rekombinant olarak E. ifade WSCP apoproteinlerden çeşitli türevleri montajı için yöntem kullanılarak rapor Chl bir ile E. coli. Bu yeni Chl bağlayıcı proteinler geliştirmek için bir eleme sistemi olarak kullanılabilir WSCP-aşırı ifade eden bakteriler, ham lizat düzeneğini göstermektedir.

Protokol

1. Chl bir stok Çözümler hazırlanması

1. KRİTİK ADIM: ışık zararını minimuma indirmek için yeşil ışık (520 nm) veya karanlıkta altında kimyasal bir kaput klorofil hazırlık tüm adımları. Her depolama için pigmentler dondurma işleminden önce nitrojen veya argon ekleyin. Tüm çözücüler analitik dereceli olduğundan emin olun.
2. Tilakoit membranlarda tek Chl A içeren liyofilize Spirulina platensis'in hücreleri veya diğer siyanobakteriyi hücrelerin yaklaşık 5 mg tartılır ve bir havan ve havan tokmağı kullanarak ezmek.
3. cam kolonuna ezilmiş hücreleri yükleyin ve karotenoidler uzaklaştırmak için yaklaşık 50-100 ml% 100 aseton ile yıkanır. akıtılarak turuncu / yeşil fraksiyonu atın.
   Not: turuncu fraksiyonu 100 ml aseton ile yıkanır ise yeşil fraksiyon elüte başlayana kadar aseton ile hücrelerin yıkanması devam eder.
4. Değişim% 100 metanol ile aseton ve CHL bir içeren yeşil kısmını toplamak. yıkandı, Fract hacmiiyon 50-100 ml arasında değişebilir. Başlangıçta, Elüe edilen fraksiyon elüsyonun sonunda soluk yeşil dönüşür koyu yeşil bir renge sahiptir. yıkandı, fraksiyonun rengi soluk yeşil içine döndüğünde elüsyon durdurun.
5. Ekstre tamamen kuruyana kadar bir döner buharlaştırıcı kullanılarak metanol buharlaştırın. çözüm ısı uygulamayın; evaporatör su banyosu sıcaklığı 30 ° C'yi aşmayacak şekilde sağlar.
   Not: buharlaşma süresi buharlaştırılmadan Metanol fraksiyonunun hacmine bağlıdır ve 10-60 dakika arasında değişebilir. Tamamen kurutun önemlidir.
6. dietil eter (5-10 ml), küçük bir hacim içinde kurutuldu ekstreden pigmentler çözülür ve pamuk süzülür. pigmentler tam filtrelemeden önce eter emin olun.
7. pigmentler (10-30 dk) tamamen kuruyana kadar dietil eter buharlaşır.
   Not: Kuru pigment ile temizlendi ve nitrojen veya argon altında tutulabilir -20 ° C, daha sonra işlenene kadar karanlıkta.
8. her şey tamamen askıya bile, 100% metanol (1 mi) mümkün olan en küçük hacimde, kuru pigment çözülür. çözeltiye 4 ml aseton ekleyin ve tümüyle pigmentleri eritmek için hafifçe cam itin.
9. Pasteur pipeti kullanılarak, DEAE sütun% 100 aseton içinde dengelenmiş Sefaroz üzerine yavaşça örnek yüklemek.
10. % 100 aseton ile elüte karotenoidler (turuncu-sarı bir bant). 1 h / h oranında aseton / metanol karışımı: Daha sonra, 3 Chl bir (yeşil bant) yıkayın.
    Not: aseton, aseton / metanol karışımının hacmi sütunu üzerine yüklenmiş Sefaroz DEAE hacmine yaklaşık olarak eşittir.
11. Elüent ¹⁷ olarak 2 diklorometan / n-heksan / izopropanol / metanol (h / h) karışımı: 25: 5: CHL 68 kullanılarak ince tabaka kromatografisi ile bir saflığa edin.
12. Chl tamamen kuruyana kadar (bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılmakta 1060 dakika).
    Not: Kuru Chl bir nitrojen veya argon ile temizlendi ve karanlıkta -20 ° C'de argon atmosferi altında depolanır.
13. % 100 etanol 2-4 ml kuru Chl a yeniden eriterek CHL bir stok solüsyonu hazırlayın.
    Not: 663 nm'de Chl a ekstinksiyon katsayısı 74.400 ^{cm-1 M-1} (83.3 ^cm-1 (mg / mL) ^-1), etanol bulunmaktadır. Tipik bir stok çözeltisi, 25 mM (23 mg / ml) 'in bir konsantrasyonuna karşılık gelen 1.860 OD olmalıdır. Chl 10 kat molar fazlası, bir genel ile bir karışım içinde, organik faz 5 ml, ve sulu faz 1 ve sonuçlar ml WSCP 1 mg içeren bir emülsiyon, bu stoğun 20 ul ekleyerek WSCP.

2. Emülsiyon Organik fazın hazırlanması

Emülsiyonun Organik faz (h / h) Span 80% 4.5 ihtiva eden mineral yağ oluşur ve% 0.4 (v / v) Tween 80: edin.

1. T bir 50 ml tüp 0.2 g tartılır80 Span 80, 1.8 g, ve mineral yağı 38 g kavuştu. de tüm bileşenleri karıştırın ve buz üzerinde soğumasını.
   Not: Organik faz, bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

3. Emülsiyonun sulu fazın hazırlanması

Not: emülsiyonun sulu fazı saflaştırılmış WSCP veya WSCP Aşırı Sunan Bakteriler ham ekstresi, ya meydana gelebilir.

1. Saflaştırılmış WSCP ihtiva eden bir sulu fazın hazırlanması.
   1. 0.3-0.6 OD kadar 37 ° C'de LB ortamı, 1 L WSCP plazmidi ¹² içeren E.coli BL21 bakteri büyütün.
   2. 1 mM IPTG eklenmesi ile, protein ifadesini teşvik eder. İndüksiyondan sonra 12-16 saat boyunca 30 ° C'de bakterileri büyür.
   3. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleme ile hasat bakteri.
   4. buz üzerinde tampon ve sonikasyon bağlama pelet (30 sn, 15 sn kapalı, beş kez) eritin. 250 ml santrifüj elde edilen topak tampon için 10 ml,protein aşırı eksprese eden hücrelere sahip LB ortamı.
      Not: saflaştırma yöntemine bağlı olarak, bağlama tamponu, 100 mM fosfat tamponu, pH 7.2 ya da 50 mM Tris, pH 7.5, 500 mM NaCI, 5 mM EDTA imal edilebilir.
   5. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 xg'de hücre lizatının Spin.
   6. afinite kromatografisi ile WSCP saflaştınlır. WSCP kaynaşmış etiketi bağlı olarak, üreticinin talimatlarına aşağıdaki protein saflaştırma için uygun ticari olarak mevcut afinite kromatografisi sistemini kullanarak rekombinant proteinleri arındırmak.
   7. Emülsiyon hazırlanması için, 50 mM saflaştırılmış WSCP fosfat tamponu, pH 7.8 kullanımı. Sulandırma için kullanılan son protein miktarı, 1 ml tampon başına 0.5-1.0 mg olduğundan emin olun.
2. WSCP Ham bakteriyel lizat içeren bir sulu fazın hazırlanması.
   1. OD 0.3-0.6 kadar 37 ° C'de LB ortamı, 250 ml plazmid ifade WSCP ihtiva eden E. coli BL21 hücrelerinden büyütün.
   2. protein ifadesini uyarmak1 mM IPTG ve 30 ° C'de gece boyunca bakteri büyür.
   3. santrifüj ile hasat bakteri hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5000 x g'de.
   4. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 x g'de 1-2 mi 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.8, sonikasyon (30 saniye, 15 saniye kapalı, üç kez) ve santrifüj pelet çözülür.
   5. 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.8 içinde 0.875 ml süpernatan 0.125 ml karıştırılarak emülsiyonun sulu fazı hazırlanır.

Emülsiyon Chl a ile WSCP 4. Montaj

1. Bir cam şişenin içine transfer yağı yüzey aktif madde karışımının 5 ml buz üzerinde soğutulur. pipetleme önce, organik fazın tüm bileşenler iyice karıştırıldığı emin olun ve yüzey aktif maddeler ve mineral yağı ile herhangi bir faz ayrılması bulunmaktadır.
2. organik faz 5 ml bölüm 3'te gibi hazırlanan buz soğukluğunda sulu faz 1 ml ilave edilir.
3. Buz üzerinde 9,500 rpm'de 2 dakika boyunca, bir doku homojenleştirici kullanarak, her iki faz karıştırılır.
4. KRİTİK ADIM: Bu aşamadan sonra, fotohasar en aza indirmek için yeşil ışık (520 nm) altında diğer tüm adımları uygulayın. 25 mM Chl stok çözeltisi 20 ul ekle emülsiyona (bölüm 1.13 bakınız). Flicking ve cam şişe tersini dağılırlar. Chl eşit emülsiyon dağıtılır emin olun.
5. karanlıkta buz üzerinde 1-2 saat boyunca emülsiyonun inkübe edin.
6. Oda sıcaklığında 5 dakika 14,000 x g'de 1.5 ml'lik plastik tüplere ve santrifüj emülsiyonun aktarmak organik fazdan emülsiyonu ve ayrı su damlacıklarının parçalamak için.
   Not: Montaj başarılı olursa, alt sulu faz yeşil bir renge sahip olmalıdır.
7. Üst yağ fazı imha ve mineral yağ 1 ml. girdap ya da iyice tüpü çevirerek pelet haline emülsiyon iyi madeni yağ karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika 14,000 x g'de örnek Spin. sulu ve madenci ayıran net bir menisküs kadar bu adımı yineleyinherhangi bir ara madde emülsiyon olmayan ark yağ safhaları, elde edilir.
8. Bir kimyasal kaputu bu adımı gerçekleştirin. Sulu ve mineral yağ safhaları, birbirinden ayrılır sonra madeni yağ çıkarın ve su ile doyurulmuş dietil eter 1 ml. Vortex ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 14.000 xg örnek aşağı doğru döndürün. İki kez bu adımı yineleyin.
9. İkinci santrifüj işleminden sonra dietil eter uzaklaştırılmış ve kaputu 5-20 dakika açık tüpler bırakın.
10. Son olarak, bir tuz giderme kolonu üzerine WSCP / Chl bir kompleks ihtiva eden sulu bir faz yük ve ileri deneyler için uygun bir tampon ile elüte.
    Not: Protein pH (6.0-7.5) arasında geniş bir aralıkta fosfat ve Tris tampon stabildir. Örnek bir aya kadar ışıktan korunan 4 ° C'de saklanabilir.

Sonuçlar

Rekombinant WSCP apoproteinler önceki bölümde tarif edilen protokole göre W / O emülsiyonları Chl A ile birleştirildi. Protokol saf WSCPs veya lizatları E. coli hücreleri WSCP aşırı eksprese eden (Şekil 1) ya da ihtiva eden sulu fazlar kullanılarak uygulanmıştır. protokol hızlı, basit ve bir doku homojenleştirici dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmez.

Bu, ilgili ana kompleksleri ^...

Tartışma

Amacımız, hidrofobik pigmentler ile suda çözünür klorofil bağlama proteinlerinin kurulması için bir yeni genel sistem geliştirmektir. Burada W / O emülsiyon dayalı yeni sulandırma sistemi rekombinant olarak E. ifade Brüksel lahanası, karnabahar, Japon horseradish ve Virginia pepperweed gelen WSCP apoproteinlerden montajı için çalışmaya kanıtlanmış genel bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir E. coli. Burada sonuç Chl, bir 10-misli molar fazlası ile WSCP 1 mg yeniden oluşturulması arasında sunulmak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mineral yağ	Sigma	M5904
Span80	Sigma	85548
Tween80	Sigma	P8074
Biyo-Ölçekli Mini Profinity eXact Kartuşları	Bio Rad	10011164	Doğal dizi ile WSCP saflaştırması için afinite kromatografisi.
His Trap HF sütunu	GE Healthcare Life Science	17-5248-02	WSCP saflaştırması için afinite kromatografisi
	GE Healthcare Life Science	17-0709-01	Klorofil saflaştırması için kromatografi ortamı

His-tag DEAE Sefaroz Hızlı Akış ile