Method Article

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

DOI:

10.3791/53417

⸱

February 25th, 2016

 ,  ,  , 
1Radiation Oncology, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir (hücre döngüsü) kinazın mitokondriyal lokalizasyonunun nasıl çalışılacağını ve alt mitokondriyal konumunun yanı sıra potansiyel mitokondriyal substratların/hedeflerin nasıl belirleneceğini ana hatlarıyla açıklıyoruz. Proteinlerin mitokondriye zorla ekspresyonu, ilgilenilen bir proteinin mitokondriyal lokalizasyonunun fonksiyonel sonuçlarını incelemek için yararlı bir araç sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri kendi transkripsiyon mekanizmasına sahip olmasına rağmen, mitokondriyal proteinlerin sadece %1'i organel içinde sentezlenir. Nükleer olarak kodlanmış proteinler, mitokondri hedefleme dizileri (MTS) tarafından yönlendirilen mitokondriye taşınır; bununla birlikte, mitokondriyal lokalize proteinlerin çoğu tanımlanabilir bir MTS'den yoksundur. Bununla birlikte, MTS'nin proteinlere mitokondriye girme talimatı verebilmesi, normalde nükleer ve / veya sitoplazmik proteinlerin mitokondriyal fonksiyonlarını incelemek için değerli bir araç sağlar. Yakın zamanda mitokondride hücre döngüsü kinaz CyclinB1 / Cdk1 kompleksini tanımladık. Bu kompleksin mitokondriyal fonksiyonlarını spesifik olarak incelemek için, bu kompleksin nükleer veya sitoplazmik fonksiyonlarına müdahale etmeden mitokondriyal aşırı ekspresyonu ve yıkılması gerekliydi. CyclinB1 / Cdk1'i MTS ile etiketleyerek, mitokondriyal hedeflerini ve işlevlerini incelemek için bu kompleksin mitokondriyal aşırı ekspresyonunu elde edebildik. Baskın-negatif Cdk1'in MTS ile etiketlenmesi yoluyla, özellikle mitokondride Cdk1 aktivitesinin inhibisyonu gerçekleştirildi. CyclinB1 / Cdk1 kompleksinin potansiyel mitokondriyal hedefleri, jel bazlı bir proteomik yaklaşım kullanılarak tanımlandı. Geleneksel 2D jel analizinden farklı olarak, mitokondriyal Cdk1 eksprese eden hücrelerde diferansiyel olarak fosforile proteinleri floresan olarak etiketlemek için 2 boyutlu fark jel elektroforezi (2D-DIGE) teknolojisini ve ardından fosfoprotein boyamayı kullandık. Baskın negatif Cdk1 taşıyan mitokondriye karşı vahşi tipte değişen fosfoprotein lekelerinin tanımlanması, Cdk1'in mitokondriyal hedeflerinin kimliğini ortaya çıkardı. Son olarak, CyclinB1 / Cdk1 mitokondriyal lokalizasyonunun hücre döngüsü ilerlemesindeki etkisini belirlemek için, hücreleri hücre döngüsünden geçerken izlemek ve DNA'larını kopyalamak için sentetik bir timidin analoğu EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin) kullanan bir hücre proliferasyon testi kullanıldı. Toplamda, bir hücre döngüsü kinazının mitokondriyal lokalizasyonunu ve aktivitesini incelemek için mevcut çeşitli yaklaşımları gösterdik. Bunlar, birçok hücre biyolojisi araştırmacısı için faydalı olacak gelişmiş, ancak takip etmesi kolay yöntemlerdir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memelilerde, hücre döngüsü ilerlemesinin siklinlerin ve sikline bağımlı kinazların (cdk'lar) 1 ile kontrol çok düzenli olaylar bağlıdır. Onun sitoplazmik, nükleer ve centrosomal lokalizasyon yoluyla, CyclinB1 / Cdk1 nükleer zarf arıza ve sentrozom ayırma 2 olarak mitoz farklı etkinlikleri senkronize edebiliyor. CyclinB1 / Cdk1 apoptoz 3 karşı mitoz hücreleri korur ve mitokondriyal fisyon, yeni kurulan yavru hücreye 4 mitokondri eşit dağılımı için kritik bir adım teşvik etmektedir.

Memeli hücre çoğalmasına olarak mitokondriyal ATP 5 çoklu alt birim kompleksi oluşur oksidatif fosforilasyon (OX....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültür Hücrelerinin gelen Mitokondri 1. İzolasyonu

  1. Hücreler (IBC) Tampon izolasyonu Tampon Hazırlanması
    1. Hazırlama 0.1 M Tris / MOPS (tris (hidroksimetil) aminometan / 3- (N-morfolino) propansülfonik asit) toplam damıtılmış su ekleyin, MOPS toz kullanılarak 7.4 pH ayarlamak, damıtılmış su 800 ml Tris 12.1 g çözündürülür 4 o C'de 1 L ve mağaza hacmi
    2. 0.1 M EGTA (etilen glikol bis (2-aminoetil eter) tetraasetik asit), Hazırlama / Tris: 1 L'lik bir toplam hacme distile su ilave Tris toz kullanılarak 7.4 pH ayarlamak, damıtılmış su 800 ml EGTA 38.1 g çözündürülür ve 4 o C'de saklayın ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CyclinB1 ve CDK1 Alt mitokondrial yerelleştirme

Sodyum karbonat ekstraksiyonu, bir protein mitokondri içinde ya da dış yüzeyi, yani, dış zar üzerinde yer olup olmadığını belirlemek için kullanılır. bir protein mitokondri içinde lokalize olduğu gösterilmiştir sonra, alt mitokondriyal yerelleştirme daha belirlenmesi proteaz sindirimi ile birlikte mitoplasting ile yapılabilir. CyclinB1 ya CDK1 alt mitokondriyal y.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diğer hücre içi organellere için mukadder proteinler gibi, mitokondriyal hedeflenen proteinler ayrıntılı protein translocating ve katlama makineleri 21,22 yardımı ile organel onları yönlendirmek onların birincil veya ikincil yapı içinde hedefleme sinyalleri sahiptirler. Bu COX8 olarak sadece mitokondriyal yerleşik proteinlerden elde dizileri (MTS) hedefleme mitokondri, mitokondri 11,23,24 üzerine belirli proteinleri hedef için bir gen sekansının N-terminalinden eklenebilir. Burada, CyclinB1 ve Cdk1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH hibeleri CA133402, CA152313 ve Enerji Bakanlığı Bilim Ofisi DE-SC0001271 tarafından desteklenmiştir. NCI P30 CA0933730 ve NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 ve S10 RR 026825 hibelerinden sağlanan finansman ve akış sitometrisi deneylerindeki yardımları için Bayan Bridget McLaughlin ve Bay Jonathan Van Dyke'ın teknik yardımı ile California Üniversitesi Davis Akış Sitometrisi Ortak Kaynak Laboratuvarı'na teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
32P ATP PerkinElmerBLU002001MC 
Anti-fare ikincil antikoruInvitrogen A-11003Alexa-546 konjuge
Anti-tavşan ikincil antikoruInvitrogen A11029Alexa-488 konjuge
ATPAraştırma Organikleri1166Ain vitro kinaz testi için
Cdk1 antikoruHücre Sinyal Teknolojisi9112
Cdk1 kinaz tamponuNew England BiolabsP6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Görüntüleme KitiYaşam TeknolojileriC10337EdU etiketlemeli
hücre döngüsü analizi içinMitokondriyal immün boyama içinHücre Sinyal Teknolojisi4844S
Siklin B1 antikoruSanta Cruz Biotechsc-752
CyclinB1 / Cdk1 enzim kompleksiNew England BiolabsP6020SDonmayı/çözülmeyi önleyin
CyDye DIGE Fluor Etiketleme KitiGE Healthcare Yaşam Bilimleri25-8009-83
DIGE Jel ve DIGE Tampon KitiGE Sağlık Yaşam Bilimleri28-9480-26 AA
Dimetilformamid Sigma Aldrich319937DMF
DithiothreitolBio-Rad161-0611DTT
dNTPEMD Millipore71004Sahaya yönelik mutajenez
için Dpn I enzimiStratagene200519-53Sahaya yönelik mutajenez için
Kuru Şerit kapak sıvısıGE Healthcare Life Sciences17-1335-01Mineral yağ
EDTA olarak kullanılırJ.T. Baker4040-03
EGTAAcros Organics409910250
Eppendorf Vacufuge KonsantratörüFisher Scientific07-748-13Vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı olarak kullanılır
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01Solmaya karşı dayanıklı montaj çözümü
Fortessa Akış SitometresiBD Biosciences649908Hücre döngüsü için EdU etiketleme ile analiz
Histone H1Calbiochem382150İn vitro kinaz testi için
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704Agaroz jellerinden DNA fragmanlarını saflaştırmak için
İmmobilin DryStrip JellerGE Healthcare Yaşam Bilimleri18-1016-61IEF (izoelektrik odaklama) şeritleri
İmmobilize GlutatyonThermo Scientific15160Glutatyon-agaroz boncuklar
İyodoasetamidSigma AldrichI1149IAA
IPGphor 3 İzoelektrik Odaklama ÜnitesiGE Healthcare Yaşam Bilimleri11-0033-64IPGfor şerit tutucular
İzopropil-b-D-tiyo-galaktopiranosid RPI Corp156000-5.0IPTG
LeupeptinSigma AldrichL9783Hücre lizis tamponu için
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri11668027Transfeksiyon reaktifi
LizinSigmaAldrich L5501CyDye etiketleme için
LizozimEMD Kimyasalları5960
Mitoctracker Kırmızı / YeşilInvitrogen M7512 / M7514Mitokondriyal floresan boyalar
MOPSEMD Kimyasalları6310
pEGFP-N1Clonetech6085-1GFP ifade eden vektör
PfuStratagene600-255-52
pGEX-5X-1  GE Healthcare Yaşam Bilimleri28-9545-53GST ifade eden vektör
Fenilmetilsülfonil florürShelton ScientificIB01090PMSF
Fosfat tamponlu salinLife Technologies14040PBS
Spectra/Por 4 diyaliz tüpü diyaliziçin gözenekli membran tüpü olarakSpectrum Labs132700
Pro-Q Elmas Fosfoprotein Jel LekesiYaşam TeknolojileriP-333002D jeller üzerinde fosfoproteinleri boyamak için
Proteinaz inhibitör kokteyliCalbiochem539134Hücre lizis tamponu için
QuikChange bölgeye yönelik mutajenez kitiStratagene200519-5
QIAprep Spin Miniprep KitiQiagen27104MiniPrep Plazmid İzolasyon Kiti
RO-3306Alexis Biyokimyasallar270-463-M001Cdk1 inhibitörü
RotenoneMP Biyomedikal150154Kompleks I inhibitörü
Sodyum karbonatFisher ScientificS93359
Sodyum klorürEMD KimyasallarıSX0420-5Hücre lizis tamponu için
Sodyum ortovanadatMP Biyomedikal159664Hücre lizis tamponu için
Sodyum pirofosfat dekahidratAlfa Aesar33385Hücre lizis tamponu için
Sodyum ve beta;-gliserofosfatAlfa AesarL03425Hücre lizis tamponu için
SpectraMax M2e Moleküler CihazlarM2EMikroplaka okuyucu
SucroseFisher Scientific57-50-1
Doku Öğütücü havaneliKimble Chase885301-0007Mitokondri izolasyonu için
Doku Öğütücü tüpKimble Chase885303-0007Mitokondri izolasyonu için
Trikloroasetik asit çözeltisiSigma AldrichT0699TCA
TrisMP Biyomedikal103133
Triton-x-100TeknovaT1105
TripsinCalbiochem650211
Tayfun GörüntüleyiciGE Healthcare Yaşam Bilimleri28-9558-09Lazer jel tarayıcı fro 2D-DIGE
UbiquinoneSigma AldrichC7956
COX IV antikor

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
  2. Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial LocalizationCdk1 KinaseMitochondrial Overexpression2D DIGE AnalysisEdU Labeling AssayFlow CytometrySodium Carbonate ExtractionSubmitochondrial FractionationMitochondrial Targeting SequenceCell Proliferation Assay

Related Articles