Method Article

Gata4, Mef2c ve Tbx5 Optimal Oranı ifade bir polisistronik Construct kullanma Kaynaklı kardiyomiyositlerde Geliştirilmiş Nesil

DOI:

10.3791/53426

⸱

November 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, polisistronik bir yapıda Gata4, Tbx5 ve Mef2c'nin retrovirüs aracılı dağıtımını kullanarak iCM'lerin üretilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, geliştirilmiş verimlilik ve kaliteye sahip nispeten homojen bir yeniden programlanmış hücre popülasyonu sağlar ve gelecekteki iCM yeniden programlama çalışmaları için değerlidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynaklı kardiyomiyositlere kardiyak fibroblastlar (CFS) Doğrudan dönüşüm (ICMS) kalp hastalıklarının tedavisi için alternatif stratejiler sunarak rejeneratif tıp için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu dönüşüm Gata4 (G), Mef2c (M) ve Tbx5 (T) gibi tanımlanmıştır faktörler zorla ifade ile elde edilmiştir. Geleneksel olarak, bu ICMS bireysel faktörlerin ifade virüslerin bir kokteyl ile üretilmiştir. Bununla birlikte, verim yeniden programlama nispeten düşük olan ve in vitro G en büyük kısmı, E, fibroblastlar zor yeniden programlama mekanizmaları incelemek için yapım tamamen yeniden programlanması olmazlar T-transdüksiyonlu. Biz son zamanlarda G, M stokiyometrisi, T verimli ICM yeniden programlama için çok önemli olduğunu göstermiştir. Bir M ve polisistronik MGT vektörü (bundan sonra MGT olarak anılacaktır) önemli ölçüde artmıştır yeniden programlama etkinliğini kullanılarak elde G ve T düşük seviyelerde göreli yüksek düzeyde G, M, T optimal stoikiometri ve in vitro olarak geliştirilmiş ICM kalitesi. Burada kalp fibroblastlardan MGT yapısı ile ICMS oluşturmak için kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Kalp fibroblastlar, yeniden programlama ve yeniden programlama sürecinin değerlendirilmesi için virüsün nesil izolasyonu da ICMS verimli ve tekrarlanabilir nesil için bir platform sağlamak için dahil edilmiştir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olmaya devam ediyor ve yılda 17,3 milyon ölüme neden oluyor1. Miyokard infarktüsü (MI) veya ilerleyici kalp yetmezliğine bağlı kardiyomiyosit kaybı morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir2. Sınırlı rejeneratif kapasite nedeniyle, yetişkin memeli kalpleri genellikle3-6 yaralanmasını takiben pompa fonksiyonunda bozulma ve kalp yetmezliğinden muzdariptir. Bu nedenle, kalp hastalığının tedavisi ve hastalık modellemesi için in vivo ve in vitro kardiyomiyositlerin verimli (yeniden) üretilmesi, ele alınması gereken kritik bir konudur.

Hücreleri pluripotent durumdan geçiş yapmadan farklılaşmış bir fenotipten diğerine doğrudan yeniden programlayan doğrudan yeniden programlamanın son gelişimi, rejeneratif tıp için umut verici bir alternatif yaklaşım sunmaktadır. Memeli kalbi, kalpteki hücrelerin yaklaşık yarısını oluşturan ve yaralanma üzerine büyük ölçüde çoğalan bol miktarda kardiyak fibroblast (KF) içerir7-9. Bu nedenle, geniş KF havuzu, doğrudan fonksiyonel CM'lere yeniden programlanabilirlerse, rejeneratif tedavi için endojen bir yeni CM kaynağı olarak hizmet edebilir. MikroRNA'lar veya küçük moleküller olsun ya da olmasın, Gata4 (G), Mef2c (M) ve Tbx5 (T) gibi transkripsiyon faktörlerinin bir kombinasyonunun, fibroblastları iCMs10-26'ya yeniden programlayabildiği gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu dönüşüm aynı zamanda in vivo olarak indüklenebilir ve enfarktüslü bir kalpte kardiyak fonksiyonda bir iyileşme ve yara izi boyutunda bir azalma ile sonuçlanır16,27-29. Bu çalışmalar, doğrudan kardiyak yeniden programlamanın yaralı bir kalbi iyileştirmek için potansiyel bir yol olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, iCM yeniden programlamanın düşük verimliliği, daha ileri mekanik çalışmalar için büyük bir engel haline gelmiştir. Ek olarak, kardiyak yeniden programlamanın tekrarlanabilirliği bu teknolojinin bir başka tartışmalı konusudur11,30,31.

Çok yakın zamanda, tek bir mRNA'da aynı 2A dizileri ile tüm olası birleştirme sıralarında G,M,T'yi kodlayan eksiksiz bir polisistronik yapı seti oluşturduk. Bu polisistronik yapılar, çeşitli G, M ve T protein ekspresyon seviyeleri verdi ve bu da önemli ölçüde farklı yeniden programlama verimliliğine yol açtı25. Nispeten yüksek bir Mef2c ve düşük Gata4 ve Tbx5 ekspresyonu gösteren MGT adlı en verimli yapı, yeniden programlama verimliliğini önemli ölçüde geliştirdi ve CM belirteçleri ekspresyonu, sağlam kalsiyum salınımı ve spontan atım25 ile büyük miktarlarda iCM üretti. Ayrıca, MGT polisistronik yapısını kullanarak, çalışmamız çoklu vektörlerin kullanımından kaçındı ve G, M, T homojen ekspresyon oranına sahip hücreler üretti, böylece kardiyak yeniden programlama araştırmaları için gelişmiş bir platform sağladı. Deneysel tekrarlanabilirliği artırmak için, burada fibroblastların nasıl izole edileceğini, MGT kaseti taşıyan retrovirüsün nasıl üretileceğini, iCM'lerin nasıl üretileceğini ve yeniden programlama verimliliğinin nasıl değerlendirileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada özetlenen protokol yenidoğan fareler kullanır. Hayvan bakım ve deneyleri Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Bölümü Laboratuvarı Hayvan Tıp (DLAM), Chapel Hill tarafından kurulan kurallarına uygun olarak yapılmaktadır.

Tamponlar ve Medya 1. Hazırlık

  1. Fibroblast (FB) orta hazırlayın: 100 ml cenin sığır serumu (FBS) ve 6 ml penisilin / streptomisin, 500 ml IMDM ortamı Supplement.
  2. 100 ml M199 medya ve 50 ml FBS ile 400 ml DMEM ortamı Supplement: ICM ortamı hazırlayın.
  3. B27 ortamı hazırlayın: 10 ml B27 medya ile 490 ml RPMI1640 ortam Supplement.
  4. Plat-E kültür ortamı hazırlayın: 50 ml FBS, 5 ml penisilin / streptomisin ve 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler ile birlikte 500 ml DMEM ortamı Supplement.
  5. Plat-E transfeksiyon ortamı hazırlayın: 50 ml FBS ve 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler ile birlikte 500 ml DMEM ortamı Supplement.
  6. Prepare Jelatin 24 plaka kaplanmış 24 çukurlu bir levhanın bir oyuğuna 0.5 ml% 0.1 jelatin çözeltisi ekleme, kullanımdan önce en az 10 dakika karıştırıldı ve aspirat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  7. FACS markalama tamponu hazırlayın: 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere, 10 ml FBS ve 2 mi EDTA (0.5 M) ile birlikte 500 mi DPBS Supplement. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden geçirin.
  8. Tampon sıralama MACS hazırlayın: 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere 2,5 g BSA ve 2 ml EDTA (0.5 M) ile birlikte 500 mi DPBS Supplement. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden geçirin.
  9. Transfeksiyon için 2x HBS tamponu hazırlayın: 280 mM NaCI (8,1816 g), 10 mM KCI (0,37275 g), 1.5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glukoz ile 500 mL HEPES tamponu (50 mM) ek (1,08096 g ). 7.05-7.12 pH ayarlamak için yaklaşık 650 ul 10 N NaOH ekleyin. 4 ° C'da bir 0.22 mikron gözenek filtre ve mağaza üzerinden filtre.
  10. Transfeksiyon için 2.5 M CaCI2 çözeltisi hazırlayın: 18,376 g Ca ekleCl 2 50 ml GKD 2 O. 4 ° C'da bir 0.22 mikron gözenek filtre ve mağaza üzerinden filtre.
  11. ICC (immünositokimya) sabitleme tamponu hazırlayın:% 4 bir nihai konsantrasyon elde etmek 35 mi DPBS 5 mi paraformaldehid (PFA,% 32) ekleyin.
  12. ICC permeabilizasyon tamponu hazırlayın:% 0.1 bir son konsantrasyona ulaşmak için 100 ml DPBS 0.1 ml Triton ekleyin.
  13. ICC bloke tamponu hazırlayın:% 5 oranında bir nihai konsantrasyon elde etmek 100 mi DPBS 5 g sığır serum albümini (BSA) ilave edin.
  14. ICC boyama tamponu hazırlayın:% 1 bir son konsantrasyona ulaşmak için 100 ml DPBS 1 g BSA ekleyin.

Yenidoğan Fare Kardiyak Fibroblastları 2. Nesil

  1. Eksplant kültürü yöntemi kardiyak fibroblastlar oluşturun
    1. Temiz neonatal αMHC-GFP transgenik fare% 75 etanol ile (P2 P1). Steril makas ile kafasını kesti. Sonra diğer bir koltuk altından yatay bir kesi yapmak. Steril kullanınkünt ve bükülmüş forseps kalbini incelemek ve buz gibi soğuk PBS tampon içeren 24 plaka bir kuyuya yerleştirmek.
      1. Alternatif olarak, yatay kesi sonrası kalp dışarı sıkmak.
    2. Floresan mikroskop ile göbeğinde GFP ifade edin. GFP tanımı, bir kalp-spesifik promotör olmaktadır αMHC promotörü tarafından tahrik edilir yana negatif kalp herhangi bir floresan loş iken transgenik fare kalp yeşil 15 olmalıdır.
    3. 60 mm merkez kuyu kültür çanak içine 3-4 GFP pozitif kalpleri alın ve steril makas ve forseps ile küçük parçalar boyutu 1 mm'den az 3 içine kıyma.
    4. 2 ml FB medya ile bir adet 10 cm'lik çanak içine 3-4 kıyılmış kalpleri yerleştirin. Dokular 3 saat aşağı dinlendiriniz.
    5. Yavaşça kalp dokuları içeren yemekleri 8 ml önceden ısıtılmış FB medya ekleyebilirsiniz. Üç gün boyunca dokuların rahatsız etmeyin.
    6. Her üç günde medyayı değiştirin.
    7. Gün 7, aspir Onkültür ortamı yedik ve DPBS hücreleri yıkayın. Her plaka için 3 ml% 0.05 tripsin ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C 'de özet.
    8. Tripsin gidermek için 5 ml FB Medya ekle. Yavaşça hücre kazıyıcı ile hücreleri ayırmak. Yukarı ve ileri mekanik doku ayırmak aşağı medyayı pipetle.
    9. Hücreleri toplamak ve kalp doku parçalarının kirlenmesini önlemek için 40 mikron hücre süzgeçler süzülmeye ve daha sonra 5 dakika boyunca 200 xg'de iplik pelet hücreleri.
    10. Yıkama hücreleri bir kez MACS tamponu ve hücreler sıralamak için hazırız.
  2. Enzimi sindirimi yöntemi kardiyak fibroblastlar oluşturmak
    1. Hasat GFP 2.1.1 olumlu kalpler. 10 ml buz gibi soğuk DPBS ile 10 cm'lik bir tabak içine bütün kalpleri aktarın.
    2. Kan kaldırmak ve buz gibi soğuk DPBS ile bir kez yıkayın steril forseps ile ventriküller sıkıştırın.
    3. Diğer doku ve yağ özgür olmak kalpleri Trim.
    4. Hala gevşek bağlanmış kabaca 4 parçaya her kalbi kesin.
    5. En az 20 kupa, 8 ml ılık% 0.05 tripsin-EDTA ile 15 ml konik bir tüp içine kalpleri aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      1. 20-30 kalpler varsa, 10 ml ılık% 0.05 tripsin-EDTA ile 50 ml konik tüp içine kalpleri aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    6. Tripsin atın ve HBSS ya da (20-30 kalpleri için) 10 ml ılık tip II kollajenin (0,5 mg / ml) (az 20 kalpleri için) 5 ml ilave edin.
    7. Vortex 4 ila 6 civarında bir hız seviyesinde 1 dakika boyunca vortexer tüp (sıvı kapağına kadar almazsa, o zaman hız gayet).
    8. 3-5 dakika boyunca, 37 ° C su banyosu içinde tüp inkübe edin.
    9. 1 dakika boyunca tüp vorteksleyin.
    10. Doku parçaları sakinleşene kadar yerçekimi ile 1 dakika boyunca sediment, 5 ml soğuk FB ortamı içeren yeni bir tüp içine sıvı toplamak.
    11. Tekrarlayın 2.2.6-2.2.10 3-5 kez yineleyin.
    12. 40 mikron hücre süzgecinden filtreleme tüm koleksiyonları birleştirintek bir hücre süspansiyonu yapmak.
    13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
    14. Süspanse 10 ml MACS tamponu hücrelerinde ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje tabi tutulur.
    15. İsteğe bağlı: 1 ml RBC liziz tamponu (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, ve 0.1 mM EDTA) ile kan hücreleri, tekrar süspansiyon hücrelerinin bir yeri vardır, daha sonra 10 ml MACS ile seyreltilir, 1 dakika boyunca buz üzerinde tutulur tampon ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje tabi tutulur. MACS tamponu ile bir kez daha yıkanır.
  3. MACS tarafından Thy1.2 + fibroblast İzolasyonu (manyetik aktive hücre sıralama)
    1. Tripan mavisi ile canlı hücre sayısını belirler.
      1. Adım 2.2.14 10 ml'lik hücre süspansiyonu 10 ul hücreleri dışarı atın. 10 ul% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile karıştırılır.
      2. Bir hemasitometre karışımı ekleyin. 3-5 dakika boyunca ayakta ve daha sonra mikroskop altında hemen incelemeye izin verin. Mavi ve canlı hücrelerde lekeli ölü hücreler boyanmamış bulunmaktadır.
      3. hemasitometre dört 1 mm köşe meydanlarda tüm canlı hücreleri saymak. Canlı hücre sayısını belirlemek: kare x 2 (seyreltme faktörü) başına ortalama sayısı 4 x 10 10 (hücre süspansiyonu toplam hacmi) x.
    2. Az 1 x 10 7 hücreleri için, 90 ul 10 ul Thy1.2 mikro ile tekrar süspansiyon hücreleri MACS tamponu soğutulmuş. 1'den fazla x 10 7 hücre vardır orantılı ise daha çok boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca bir buzdolabı (2-8 ° C) 'de inkübe edilir.
    3. 10 ml MACS tamponu ve sıkma örnekler 5 dakika boyunca 200 xg'de ekleyin; Tekrar 10 ml MACS tamponu ve santrifüj ile bir kez yıkanır.
    4. MACS tamponu içinde 2 ml hacim getirin.
    5. Bir MACS ayırıcı kaputu ayarlayın. Ayırıcı bir LS sütun ekleyin. MACS sütun tampon 3 ml bunu dengelenmeye uygulayın.
    6. Dengelenmiş LS sütunu içinden hücre süspansiyonu geçirin.
    7. Her tampon, 2 ml MACS ile 3 kez yıkanır.
    8. T off LS sütun alınO Ayırıcı ve MACS yeni bir 50 ml tüp içine tampon 2 ml ile 3 kez Zehir.
    9. 5 dakika boyunca 200 xg'de Spin.
    10. 10 ml FB medyada yeniden süspanse hücreleri, hücre sayımı ve uygun yoğunlukta plakalara tohum. Eksplant kültürü yöntemiyle üretilen fibroblastlar için, tohumlama hücreler yoğunluğu 2-3 x 10 4 hücre / kuyu 24 plaka olabilir. Enzimi sindirimi yöntemi elde fibroblastlar için, hücreler yoğunluğu yaklaşık 4-5 x 10 4 hücre / kuyu 24 oyuklu plaka olabilir.

ICM yeniden programlanması için retrovirüsün 3. Nesil

Not: steril koşullar altında BSL2 Biyolojik Güvenlik kabinesinde aşağıdaki adımları uygulayın. Transfekte hücreler, pipet uçları ve tüplerin doğru atılması, çevre ve sağlık tehlikeleri riskini önlemek için tavsiye edilir.

  1. 1 ug / ml puromisin ve 10 ug / ml ile takviye edilmiş b Plat-E medya Plat-E hücreleri korumak% 5 CO2 ile 37 ° C 'de lasticidin.
  2. 2 gün, puromisin ve blastisidin eksik Plat-E kültür ortamı ile orta yerine.
  3. 0. günde, 10 cm'lik kaplar yaklaşık Transfeksiyondan bir önceki gün plaka başına 4-5 x 10 6 hücre içine Plat-E hücreleri bölme. Hücreler ~ transfeksiyon günü% 80-90 ortak akışlı olmalıdır.
  4. 1. gün önce transfeksiyondan 1 saat içinde hücreler üzerinde transfeksiyon medya değişiklik kültür ortamı. Şöyle transfeksiyon prosedürü şöyledir:
    1. Ticari kitler kullanılarak transfeksiyonu
      1. 20 ul transfeksiyon reaktifi (örneğin, Lipofectamine) ve 500 ul karıştırın düşük serum ortamı (örneğin, Opti-MEM). Serum medya azaltılmış bir 500 ul retroviral plazmid 10 mikrogram ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) her karışımın inkübe edin.
      2. Yavaş yavaş transfeksiyon karışımı plazmid karışımı ekleyin. Bu adım 15-30 sn sürebilir. (Çözelti bulanık görünebilir) oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı.
      3. Hücrelere bilge karışım damla ekleyin.
      4. Bir 37 ° C inkübatör içinde gece boyunca inkübe edin.
    2. Kalsiyum Fosfat ile transfeksiyonu.
      1. 40 ul 2.5 M CaCl2 ve 440 uL GKD 2 O, daha sonra retroviral plazmid 20 ug (toplam hacim 500 ul böylece GKD 2 O miktarını ayarlamak) ekleyin karıştırın.
      2. 15 ml konik tüp HBS 2x 500 ul ekleyin.
      3. HBS vorteks ve bu arada HBS Kalsiyum-DNA karışımı damla damla ekleyin. Bu adım, her numune için 30 saniye sürer. Yani maksimum eşzamanlı 3-4 örnekleri yok.
      4. Daha uzun bir zaman bir çökelti alacak daha geniş ve daha az çökelti hücrelere yol açar 3 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübasyon için inkübe edilir.
      5. Karışım hücrelere damla damla ve 20X mikroskop altında gözlemlemek ekleyin. İnce çökeltiler (küçük olanlar bir sürü iyi ama birkaç büyük olanları iyi değildir) görülmelidir.
      6. 37 ° C inkübatör gecede inkübe.
  5. 2 gün, kültür ortamı önceden ısıtılmış 8 ml hücreler üzerinde ortamı değiştirmek. 24 saat süreyle inkübe edin.
  6. Gün 3 ve 4. günde, 0.45 mikron gözenek boyutlu selüloz asetat filtre boyunca, 10 ml steril bir şırınga kullanılarak ve 50 ml'lik bir tüp içine aktarılarak yemekler kültür süpernatan toplamak. Her 8 ml virüs içeren süpernatan için retrovirüs çökeltme çözeltisinin 2 ml ilave edilir. Yavaşça karıştırın ve 4 ° C'de gece boyunca kuluçkaya yatmaktadır.
  7. 5. günde, 30 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de viral karışımı dönerler. Viral parçacıklar tüpün alt kısmında beyaz pelet görünmelidir.
  8. Süpernatantı atın. 5 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile bir artık çözeltinin dönerler. Pelet Çöken retroviral parçacıklar rahatsız etmemek için büyük bir özen, aspirasyon yoluyla sıvının tüm izlerini silmek.
  9. Her 8 ml viral süpernatan için 100 ml DPBS tamponu ile retroviral pelet yeniden süspanse edin. TümbölenBuz üzerinde virüsü. Hemen kullanın veya -80 ° C'de saklayın.

Kardiyak Fibroblastları 4. yeniden programlanması

  1. 10 ml ICM ortama 10 mg / ml polybrene solüsyonu 4 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe karıştırın. Polibren nihai konsantrasyonu 4 ug / ml'dir.
  2. Fibroblastlar ile tohumlanmış 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna 500 ul ICM ortam ihtiva eden polybrene ekleyin.
  3. Eksplant kültürü veya enzimi sindirimi yöntemi 4-5 x 10 4 hücrelerinden içeren her birini 2-3 x 10 4 hücrelere 10 ul retrovirüs ekleyin. Virüs miktarı orantılı olarak, farklı kültür plakaları ya da bulaşıklar için artmış bir hücre sayısı ile yükseltilmelidir. Viral enfeksiyon izin vermek için 24-48 saat için 37 ° C inkübatör plaka koyun. Kalp yeniden programlama için zaman çizgisi Şekil 1'de gösterilmiştir.
  4. Viral iletimi sonrasında 500 ul düzenli ICM medya ile virüs içeren medya değiştirin.
  5. 2-3 günde ortamı değiştirmek. Viral transduse hücreleri, pozitif seleksiyon için, hedef hücrelere 2 ug / ml'de puromisin ile desteklenmiş ICM ortamı eklenir. Üç gün boyunca tutun. Bundan sonra, 1 ug / ml konsantrasyonunda da ICM ortam içinde puromisin korumak.
  6. Üç gün viral enfeksiyondan sonra, inkübatör dışarı plaka almak ve GFP ifade gözlemlemek için bir ters floresan mikroskop (20X) altına yerleştirin.
    Not: On gün viral enfeksiyondan sonra, hücreler, FACS analizi ve yeniden programlama etkinliğini belirlemek için ICC analizi için hasat edilebilir (adım 5 ve 6).
  7. Ondört gün viral enfeksiyondan sonra, B27 medya ile ICM ortamı değiştirin. Her üç günde ortamı değiştirmek. Spontan dayak hücre loci üç (enzim sindirim yöntemi hücrelerin) veya viral transdüksiyon sonra dört (eksplant kültürü yöntemiyle elde edilen hücreler) hafta görünebilir.

Yeniden programlanması Verimliliğinin 5. İmmünositokimyasal Analizi

  1. Durulayın hücrelerüç kez PBS soğuk buz ile; Fazla çözüm kaldırmak.
  2. 24 oyuklu plakalar, her çukuruna 0.5 ml ICC sabitleme tamponu ekleyin. 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak.
  3. PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
  4. 24 oyuklu plakalar, her çukuruna 0.5 ml ICC permeabilizasyon tamponu ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreleri geçirgenliği.
  5. PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
  6. 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna bloklama tamponu, 0.5 ml ICC ekleme, 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.
  7. ICC lekeleme tampon maddesi ile seyreltilmiş birincil antikorlar. De 200 ul her bir antikor çözeltileri ilave edin ve gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. Antikor seyreltme faktörleri Malzeme listelenmiştir.
  8. Bir sonraki gün, PBS ile üç kez yıkama hücreleri.
  9. Hücrelere 200 ul ikincil antikor çözüm ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
  10. Üç kez PBS ile hücrelerin yıkayın.
  11. Solüsyonu her bir çukura DAPI içeren montaj 150 ul ekle. 1 dakika boyunca çekirdekleri leke izin verin. Daha sonrayuvarlak cam kapak slip ile her iyi kapak ve yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için bir forseps ile taban yüzeyine karşı kayma basın.
  12. Fazla solüsyonun aspire ve örnekler görüntüleme için hazırdır. D14 de ifade yeniden programlanan hücreleri kalp işaretleyici cTnT ve αActinin gösteren temsili resim Şekil 2B'de gösterilmektedir.

Yeniden programlanması Verimliliği 6. FACS Analizi

  1. İyice DPBS ile bir kez yıkama hücreleri. Her oyuğa 0.3 ml tripsin (% 0.05) ilave edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Yavaşça hücreleri kaldırma kolaylaştırmak için plaka dokunun. Mikroskop altında hücre ayrışması edin. En hücreleri kesilerek zaman, her bir kuyucuğa 1 mi FACS tampon ekleyin. Pipet yukarı ve ileri mekanik hücreleri ayırmak için aşağı.
  3. Kuyuya bir 96 derin oyuklu plakaya 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de Spin hücreleri toplamak için.
  4. Bir kez yıkayın hücreleriFACS tamponu.
  5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca hücreler tekrar süspansiyon 100 ul sabitleme / permeabilizasyon çözümler ekleyin.
  6. 1x yıkama solüsyonu, pelet ile iki kez hücre yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
  7. 1x yıkama tamponu GFP ve cTnT karşı birincil antikor çözüm hazırlayın. İyice 50 ul antikor çözeltisi ile her bir örnek tekrar süspansiyon ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  8. 1x yıkama solüsyonu, pelet kez hücreleri yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
  9. Her bir örnek için Alexa Fluor 488 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-fare IgG içeren 50 ul ikincil antikor solüsyonu ilave. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
  10. 1x yıkama solüsyonu, pelet kez hücreleri yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
  11. 400 ul sabitleme tampon maddesi (% 1 PFA ile DPBS) içinde süspanse edin hücreleri. Hücre süzgecinden kapaklı FACS tüpü hücreyi aktarın. Numuneler, FACS tespiti için hazırdır. Yeniden programlama efficienc temsili FACS analiziy pMxs-puromycin MGT Şekil 2A gösterilmiştir veya puromisin seçimi olmadan inşa kullanarak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeniden programlama adımlar. Şekil 1'de şematik özetlenmiştir MGT transdüksiyon sonra, hücreleri yeniden programlama GFP ifade gibi erken transduced hücrelerin 3. Puromycin seçimi 3 gün başlar ve ilk iki haftasında korunur gün olarak tespit olabilir eğer PMX-puro -MGT yapı kullanılır. Gün 14 10. günde, cTnT ve αActinin gibi kardiyak markerlerinin ifadesi başlangıç ​​fibroblastlar, bir kalp hücre doğru yeniden programlamayı geçiren belirten iki ICC (Şekil 2B, adım 5) ve FACS (Şek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü kullanarak başarılı ICM nesil için, genel verimliliği üzerinde bir etkiye sahip birkaç önemli faktör vardır. Özellikle başlangıç ​​fibroblast koşulları ve retrovirüs kodlama MGT kalitesini büyük ölçüde yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir.

Mümkün olduğunca taze ve sağlıklı fibroblastlar oluşturmak için önemlidir. Eksplantlar yedi gün sonra tabaklara önce eksplant kültürü yöntemi için, fibroblastlar kullanılabilir. Enzimi sindirim yöntemi için, fibroblastlar gibi erken...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UNC Akış Sitometrisi Çekirdeği ve UNC Mikroskopi Çekirdeği'nden uzman teknik yardım için minnettarız. Qian laboratuvarı ve Liu laboratuvarı üyelerine, el yazması ile ilgili yararlı tartışmalar ve eleştirel incelemeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Dr. Liu'ya NIH/NHLBI R00 HL109079 hibesi ve Amerikan Kalp Derneği (AHA) Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi 13SDG17060010 ve Dr. Qian'a Ellison Tıp Vakfı (EMF) Yeni Akademisyen Hibesi AG-NS-1064-13 tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-kardiyak troponin TThermo ScientificMS-295-POFACS için 1:200 ve ICC için 1:400
anti-GFPYaşam TeknolojileriA11122Hem FACS hem de ICC
anti-aActininSigma-AldrichA7811Hem FACS hem de ICC için 1:500
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 için  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441: 1.000 ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biyoteknolojisc-1237ICC için 1:200
anti-Tbx5Santa Cruz Biyoteknolojisc-178661:200 ICC
Alexa Fluor 488– konjuge eşek anti-tavşan IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 hem FACS hem de ICC
için Alexa Fluor 647– konjuge eşek anti-fare IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 hem FACS hem de ICC için
Hücre içi boyama için Cytofix/Cytoperm kitiBD Biosciences554722
Rhod-3 Kalsiyum Görüntüleme KitiYaşam TeknolojileriR10145
Thy1.2 mikro boncuklarMiltenyi Biotec130-049-101
DAPIile Vectashield çözümüVektör laboratuvarlarıH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Tripsin-EDTA (% 0.05)Corning25-052
PRMI1640 ortaYaşam Teknolojileri11875-093
B27 ekiYaşam Teknolojileri17504-044
IMDMYaşam Teknolojileri12440-053
Opti-MEM Azaltılmış Serum Orta YaşamTeknolojileri31985-070
M199 ortaYaşam Teknolojileri10-060
DMEM, yüksek glikozYaşam Teknolojileri10-013
Penisilin-streptomisinCorning30-002
Esansiyel olmayan amino asitlerYaşam Teknolojileri11130-050
Lipofektamin 2000Yaşam Teknolojileri11668500
blastisidinYaşam TeknolojileriA11139-03
puromisinYaşam TeknolojileriA11138-03
Kollajenaz IIWorthingtonLS004176
polibrenMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl< alt>2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlikozSigma-AldrichG6152
Sığır serum albüminiFisher9048-46-8
paraformaldehitEMS15714
Retrovirüs Çökeltme ÇözeltisiALSTEMVC-200
%0.4 Tripan mavisi çözeltisiSigma-AldrichT8154
jelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco'nun CaCl içermeyen PBS'si2< / sub> ve MgCl2< / sub> (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi)Corning21022
LS sütunuMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 &; M Selüloz Asetat Filtresi Thermo Scientific190-2545
24 oyuklu plakalarCorning3524
10 cm Doku kültürü kapları Thermo Scientific172958
60 mm merkez kuyu kültür kabı   Corning3260
96 Kuyu Şeffaf V-Tabanlı 2 ml Polipropilen Derin Kuyu PlakasıDenville ScientificP9639
Hücre süzgeç kapaklı polistiren yuvarlak tabanlı tüpler BD Biosciences352235
SantrifüjEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Otomatik Hücre Görüntüleme SistemiYaşam TeknolojileriAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-302
Yuvarlak cam kapak kaymaElektron Mikroskobu Bilimleri72195-15
için 1:500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced CardiomyocytesCardiac FibroblastsPolycistronic ConstructGata4 Mef2c Tbx5Retroviral ReprogrammingCell IsolationFlow Cytometry AnalysisImmunochemistry DetectionPurmycin SelectionGFP Expression

Related Articles