Yöntem makalesi

Endotoksin ve DNA İçeriği için Hava örneklenmiş Filtresi Analizi

9.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53444

⸱

7 Mart 2016

 ,  ,  , 
1Department of Earth and Planetary Sciences, Weizmann Institute of Science, 2Multiphase Chemistry Department, Max Planck Institute

Bu makalede

Özet

Hava örnekli filtrelerden atmosferik biyolojik partiküllerin iki tamamlayıcı analizi burada açıklanmıştır: endotoksin ve DNA'nın ekstraksiyonu ve tespiti.

Özet

Açık aerosol araştırmaları yaygın filtreler örneklenmiş partiküler madde kullanır. Bu prosedür, toplanan partiküllerin değişik karakterizasyonları paralel yapılmasını sağlar. Burada sunulan yöntemin amacı, filtreler çıkarılır, biyo-aerosolleri endotoksin ve DNA içeriği son derece doğru ve güvenilir bir analiz sağlamaktır. örnek filtrelerden Lipopolisakkaridler gibi yüksek moleküler ağırlıklı organik moleküllerin, ekstraksiyonu pirojensiz su bazlı ortam içinde örnek çalkalama içerir. Daha sonra yapılan analiz bir türbidimetrik ölçümü kullanılarak tespit edilebilir bir enzimatik reaksiyona dayanır. örneklenmiş filtreler üzerindeki yüksek organik içeriğin bir sonucu olarak, örneklerden DNA ekstraksiyon ilk topraklar için tasarlanmış ve DNA verimi artırmak için modifiye edilmiş bir ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Algılama ve kantitatif polimeraz zincir Reacti kullanarak belirli mikrobiyal türlerin miktar(Q-PCR) analizi tarif diğer yöntemlerden karşılaştırılmıştır.

Giriş

Filtrelerin hava örnekleme atmosferik aerosoller araştırma temel araçtır. 1 örneklenmiş filtreler çeşitli kimyasal, fiziksel ve toplanan çevre parçacıkların biyolojik karakterizasyonları için başlangıç ​​noktasıdır. 2-11 Bu yaklaşımın avantajı çeşitli analizler olabilmesidir aynı numune üzerinde off-line gerçekleştirilir. Araştırmacı tüm farklı analizler verileri etkinleştirir derlenmesi atmosfer bilimleri karmaşık sorunların çözümünde toplanan parçacıkların ve yardımların özelliklerinin iyi bir anlayış elde etmek için. 12,13 Örneğin, deniz ve iç hava örnekleri aynı sırasında alınan süresi Bu çalışma için örnek partikül toksisite ve biyolojik kompozisyon. 14 ile ilgili olarak karşılaştırılabilir, lipopolisakarit (LPS), aynı zamanda endotoksinlerin şekilde bilinmektedir gram-negatif bakteri hücre duvarları, bileşenler, kıyı-ve örneklendiği filtrelerden ekstre edildi bir iç site ve kullanılarak değerlendirildilimulus amebocyte lizat (LAL) testi. Buna paralel olarak, bakteriyel içeriğin bir genomik değerlendirme (toplam bakteri, gram negatif ve siyanobakteri kantitatif) polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) kullanılarak aynı numune üzerinde gerçekleştirilmiştir. LAL Test endotoksin içeren bir sulu çözeltiye, at nalı yengeç, Limulus Polyphemus'un gelen amebocytes sulu ekstraktının ilave edildikten sonra oluşan bulanıklık ölçümlerine dayanır. Örnek yüksek endotoksin konsantrasyonu hızlı türbidite geliştirir. 15 Q-PCR analizi, belirli bir DNA fragmanı amplifiye olarak yayılan bir floresan sinyali dayanır. 16 sinyal gerçek zamanlı izleme PCR üslü fazda standart bir eğri ile reaksiyonu ve kalibre, ilk DNA miktar olarak tespit edilebilir. Bu ikisinin kombinasyonu başka bir yerde ayrıntılı olarak, 14 endotoksin ve düzeyleri iyi bir tahmin sağlayabilir, diğerleriyle birlikte analizleriörneklerinde, kaynak bakteri miktarı.

Burada sunulan yöntemin amacı, filtreler çıkarılır, biyo-aerosolleri endotoksin ve DNA içeriği son derece doğru ve güvenilir bir analiz sağlamaktır. Aerosol fiziksel ve inorganik kimyasal özellikleri örnekleme yöntemleri ve daha yakın zamanda, yöntemler organik madde bileşeni araştırmak için geliştirilmiştir iyi bilinen iken, 17 aerosollerin biyolojik bileşeni yetersiz araştırma olmuştur. 18 akımı gerekçesi yöntem ayrıntılı olarak, ayıklanması analiz ve havadaki aerosoller biyolojik kısmını tanımlamak için sağlam bir yöntem sunarak bu boşluğu doldurmak için. 14

Burada açıklanan yöntem filtre analizini içeren biyolojik kapalı ve açık aerosol araştırma projelerinde yaygın kullanım alanı bulur bekleniyor. 20-24

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: Tüm malzemeler ve bu protokolde kullanılan araçların ayrıntılı bir listesi Malzemeler bölümünde gösterilir.

Filtreler 1. Hava Örnekleme

  1. Filtreler hazırlanması
    1. Yüksek hacimli numune alma, 20.3 x 25.4 cm 2 filtreleri kullanın. En iyi araştırma ihtiyaçlarına uygun filtre belirli tip yanı sıra filtre kesme boyutunu, varsa seçin. 1 Burada, kullanım kuvars mikrofiber filtreleri.
    2. organik ve biyolojik bileşik, örnekleme için önceden-Bake filtreler organik kısmı yok etmek. -Öncesi fırında filtreler, alüminyum folyo ile tek tek kaydırmak ve daha sonra, en az 5 saat boyunca 450 ° C'de bir laboratuar fırınında pişirin için.
    3. örnekleme kadar -20 ° C 'de fırında filtreleri saklayın.
  2. Enstrüman Taşıma ve Hava Örnekleme
    1. yüksek hacimli numune kafasından temiz kalan toz. temiz bir kağıt mendil ile silin parçaları ve hava-kuru befo için onlara izinörnekleyici tekrar takmadan yeniden.
    2. etanol ile filtre kasetini dezenfekte edin ve eldiven ve her zaman bir laboratuvar önlüğü ile çalışır.
    3. temiz filtre kaseti içinde bir ön-pişmiş filtreyi yerleştirin ve yüksek hacimli örnekleyici kılavuzuna göre hareket edin.
    4. Ve alüminyum şal uygulanabilir (örneğin yağmur, toz fırtınası), örnekleme tamamlanmasına kadar temiz bir yerde saklayın eğer, tarih ve herhangi bir olağandışı hava koşulları işaretleyin.
    5. örneklenmiş filtreyi toplayın ve örneklenmiş tarafı içe bakacak şekilde ikiye katlayın.
    6. analize kadar -20 ° C 'de, özgün alüminyum folyo ve deposunda filtre sarın.
      Not: numune alma ve analiz arasındaki zaman gecikmesi, daha 2 aydan uzun ise, organik ve biyolojik maddenin bozulmasını önlemek için -80 ° C'de örnek saklayın.

2. Endotoksin Analizi

Not:% 70 etanol An ile çalışma yüzeyi dezenfekteSadece pirojensiz tüpler, ipuçları ve reaktif d çalışır. Bardak kullanıldığında, 30 dakika boyunca 250 ° C ya da 60 dakika boyunca 200 ° C'de önceden ısıtılması gereklidir. 25, bir sınıf II biyo-güvenlik kabini tüm reaktifler hazırlamak ve eldiven ve her durumda bir laboratuar kaplama ile çalışır.

  1. reaktif Hazırlama
    1. Kullanmadan önce kısa bir süre lizat rehydrate LAL kiti üreticisinin protokolünü izleyin. 26 dokunun yavaşça flakon üzerindeki şişe duvarlarında kalan LAL çıkarmak için. vakum kırmak için hafifçe stoper kaldırın. Bir iğneli bir şırınga kullanarak, tüm lizat içeriği rehidrate ve köpük oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırmak için şişeye pirojensiz su (PFW) 5 ml ilave edin.
    2. Plastik parafın film ile şişenin kapatılması değilken kadar iki gün 4 ° C sıcaklıkta kullanılması ve mağaza. en çok üç ay boyunca -20 ° C 'de kalan lisat saklayın.
      Not: Bu reaktif sadece bir kez dondurulabilir.
    3. 0.5 mikron içeren kontrol standart endotoksin (CSE), rehydrateg E. E. coli, üreticinin protokolüne uygun olarak. 27 web sitesinde belirtilen kiti için lot numarasını girerek üreticinin web sitesinden 28 den CSE şişeye ilave edilecek suyun belirli bir miktar belirleyin. E. nihai konsantrasyon (AB; burada 10 AB = 1 ng) E. coli şişede, endotoksinden ölçülür. Bu şişeyi Ed0 etiketleyin.
    4. plastik parafin film ile CSE şişeyi mühür değilken kadar 4 hafta boyunca 4 ° C'de kullanımı ve mağaza.
  2. Standart Eğri ve Çivili-filtre Hazırlık
    1. Tablo l'de gösterildiği gibi, bir sınıf II biyo-güvenlik kabini, bir çoğaltılmış endotoksin seyreltme serisi üretmek CSE (borular Ed1-Ed11) veya CSE (boş tüp sadece PFW ihtiva eden) azalan miktarları ihtiva eden 22 pirojensiz 2 ml santrifüj tüplerine hazırlanması 1.
    2. dairesel akışı ile biyolojik kabinede, bir dezenfekte 1.1 kullanarak temiz, ön-pişmiş filtre 22 dairesel parçaları kesmek 2 cm çaplı mantar delici.
    3. Steril petri kutularının içine filtre çiftleri yerleştirin.
    4. Filtrelerin karşılık gelen çifti üzerine endotoksin seyreltme serisi ED2-Ed11 her üyesinden ve boş tüp 50 ul Spike.
    5. 30 dakika kurumaya kaputun altında açık çivili filtreleri içeren Petri kapları bırakın.
    6. pirojensiz 2 ml tüp içinde, her bir filtre parçası yerleştirin.
Tüp Nihai endotoksin konsantrasyonu (AB ml -1) Standart endotoksin hacmi (mi) Pirojensiz su hacmi (ml) toplam hacmi (mi)
Ed0 2500 ana çözelti* 5
Ed1 1000 80 (Ed0 arasında) 120 200
ED2 100 20 (ED1 itibaren) 180 200
ED3 50 10 (ED1 arasında) 190 200
Ed4 25 5 (ED1 arasında) 195 200
Ed5 12.5 2.5 (ED1 arasında) 197.5 200
ED6 6.25 1.25 (ED1 arasında) 198,75 200
ED7 3.125 6.25 (ED2 arasında) 193,75 200
ed8 1,563 6.25 (ED3 arasında) 193,75 200
Ed9 0.781 6.25 (Ed4 arasında) 193,75 200
ED10 0.391 6.25 (Ed5 arasında) 193,75 200
Ed11 0.195 6.25 (ED6 arasında) 193,75 200
Boş 0 0 200 200
* üreticinin talimatlarına göre stok çözeltisi hazırlayın.
">

Tablo 1:. Endotoksin standart eğri endotoksin konsantrasyonu, standart bir endotoksin ve pirojen içermeyen su hacmi ilave edilecek ve elde edilen toplam hacim kalibrasyon eğrisinde Her seyreltme tüpünden için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

  1. Deneysel ve Çivili Filtreler Endotoksin Ekstraksiyon
    1. akış şemasına sahip biyolojik bir kabin içinde, pirojensiz 2'de, (Kademe 2.2) kirpi standart filtreler ile birlikte, dezenfekte 1.12 cm çapında bir mantar delici kullanılarak ve koyun dairesel parçalar halinde (adım 1.2 arasında) bir numune kesme filtreleri ml'lik tüpler (yani örnek tüpleri).
    2. tüplere 1 mi PFW ekleyin ve laboratuar çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca her çalkalayın.
    3. 10 dakika boyunca 375 x g'de bir mikrosantrfuj numune tüpleri santrifüjleyin. 29
    4. aktarım inciYeni bir pirojensiz 2 ml tüp içine, endotoksin içeren e yüzer.
  2. Limulus Amebocyte lisatı (LAL) Deney
    1. Düz dipli ve bir kapakla pirojensiz 96 çukurlu bir mikrolevhadaki LAL deneyi ile örneklerde endotoksin konsantrasyonunu belirler.
    2. Şekil 1'de gösterildiği gibi., Önceden plaka dizi planlayın her çalışan plakada (100-0,195 EU / ml (bölüm 2.2) konsantrasyonu aralığını kapsayan ve böylece) endotoksin standart çözümleri ED2-Ed11 doğrudan hazırlanmış bir standart eğri ekleyin . Standart eğri kuyuları satırlar A 1-10 ve plaka B işgal etmelidir. Boş numuneler için bu satırlarda kuyuları 11-12 kenara (dört boşlukları toplam yapım).
    3. mikroplaka okuyucusu açın ve 37 ° C'de mikro-enkübasyonu içeren ve 405 nm 'de absorpsiyon ölçümleri ile takip her 5 dakikada bir, çalkalama kinetik reaksiyon için programlamak. 1.5 saat boyunca 18 kez tekrarlayın.
    4. Verim belirleyincy hangi endotoksin örnek filtreler elde edilir (yani., çivili standart filtreler alınan numuneler) orijinal miktarın hesaplanan endotoksin miktarı bölünmesi yoluyla çivili.
    5. Veya çivili filtre özü ve (bölüm 2.3) kendi boşlukları (adım 2.4.2 itibaren) standart endotoksin çözümleri 50 ul koyarak tahlil başlayın, ya da deneysel numuneler ve (aynı zamanda bölüm 2.3 dan itibaren) kendi boşlukları, kapak planlanan plaka dizisi (Şekil 1) başına ve kapatın olarak.
    6. Her iyi, hızlı bir şekilde LAL solüsyonu 50 ul ekleyin ve okuyucusuna kaldırmadan önce masaya alınırken yavaşça yatay plaka sallayın.
    7. plaka okuyucu plaka koyun ve deneysel çalışma başlatmak.

figure-protocol-1
Şekil 1:. Endotoksin dizi plakası Bir eski96 çukurlu bir mikrolevhadaki bir endotoksin analizi dizi bol.

3. Genomik Analizler

Not: DNA ekstraksiyonu için,% 70 etanol ile çalışma yüzeyi dezenfekte ve sadece steril tüpler, ipuçları ve reaktifler ile çalışır. DNA'nın q-PCR analizi için, yüzey DNA temizleyici ile çalışma yüzeyi dezenfekte edin. Bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde tüm reaktifler hazırlayın ve eldiven ve her zaman bir laboratuvar önlüğü ile çalışır.

  1. DNA primerleri ve sondaları hazırlanması
    1. DNA ekstraksiyonu, ya düzen (hidroliz prob yöntemi uygulandığı takdirde) primerlerin piyasadan temin seti ve bir sonda, ya da astar bir dizi yeni ve astar hesaplama araçlarını tasarlama kullanarak bir prob tasarımı önce. 30
    2. ya da 10 mM Tris-0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (TE tamponu) ya da PCR dereceli su kullanılarak üreticinin protokolüne göre primerler rehidrate.
      Not: İlk PCR primeri st çözmek için tavsiye edilirdaha uzun süre saklandığında astar bozulmayı önler düşük EDTA (% 0.1) ile TE tampon maddesi içinde takılıp sıkıştırılmış. PCR reaksiyonları inhibe olabilir EDTA miktarlarını azaltmak için daha sonraki dilüsyonları için PCR-dereceli su kullanın.
    3. analize kadar -20 ° C'de, 50 ul hacimde veya steril 0.5 ml'lik tüplerde primer ve prob 100 ul ve mağaza hazırlayın.
  2. Standart Hücre Konsantrasyon Değerlendirme DNA Ekstraksiyon önce
    1. Uygun büyüklükteki bir santrifüj tüpünde, ilgi konusu mikrop türleri (tüp Od0, Tablo 2A) içindeki bir standart hücre solüsyon hazırlanır. Küçük delikli bir pipet kullanılarak tüp içinde pipetleme aşağı 7-10 kez hücre süspansiyonu karıştırın.
    2. Hücreler (örneğin belirli mantar sporları) renkli ise, bir boyama işlemi yapmazlar. Hücre boyaması gerekli ise, ilgi konusu hücrelerin mikroskobik saptanması için uygun bir boya hücre süspansiyonu seyreltin. 31
    3. kapak kayma ve hemocytom temizleyinetanol ile eter. Nemlendirin ve hemasitometre kapak kayma yapıştırın.
    4. dikkatlice pipet ucu ile kapak kayma kenarına dokunup kılcal hareket ile odasını doldurarak hem hemositometre odalarına hücre süspansiyonu yaklaşık 8 ul yükleyin. üzerinde / altında odasını doldurmayın.
    5. 400X büyütmede (oküler objektif ve 10X olarak 40X) bir mikroskop altında görüntüleyerek hücre sayısını belirler. Dokuz kareler 1 x 1 ölçme mm 2 ve 3 x 3 ızgara düzenlenmiş görülmelidir. ızgara dört köşe meydanlarından birinde mikroskop odaklanın (daha yüksek bir büyütme kullanılabilir). 1 x 1 mm 2 kare 16 küçük kareler içermelidir.
    6. Dört 1 x 1 ila 2 mm köşe kareler hücreleri, hem de 3 x 3 ızgara orta kare sayısı. saymak için çok fazla veya çok az sayıda hücre varsa, 15- (ya konsantre ya da uygun şekilde orijinal hücre süspansiyonu seyreltilmesi, prosedürü tekrarlayın50 hücre) bir tekleme 1 ila 2 mm alanı kaplamak gerekir.
    7. Aşağıdaki gibi hücreden standart hücre süspansiyonu Od0 hücrelerin (hücreler ml -1) konsantrasyonunu hesaplayınız beş sayılan kareler arasında ortalama sayısı: Hücre sayımı ml -1 = Ortalama hücre sayısı kare -1 Seyreltme Faktörü 10 4.
  3. DNA Ekstraksiyon Etkinliğinin Değerlendirilmesi
    1. Tablo 2A göre dokuz steril 0.5 ml'lik tüpler hazırlayın.
    2. Standart hücre çözeltisi (Od0), 20 ul (Od1) bir toplam hacim içinde yaklaşık 10 7 hücreleri ml -1 içeren seyreltin.
    3. OD2-Od8 ve boş tüp, Od9 20 ul tüpler steril nükleaz içermeyen PCR dereceli su (NFW) 18 ul ekleyin.
    4. Aktarım OD2 içine Od1 hücre çözeltisi 2 ul. Pipet hafifçe karıştırın ve Od3 için tüp OD2 2 ul aktarmak. o kadar Od8 kadar tüplere boyunca aynı şekilde hücreleri seyreltilmesi ve tüp dahil Devam10 7 -10 0 hücreleri ml bir seri seyreltme btain -1.
    5. dairesel akışı ile biyolojik kabinede, bir dezenfekte 1.12 cm çapında bir mantar delici kullanarak, temiz, ön-pişmiş filtrenin 18 yuvarlak parçalar kesin. steril petri çanaklarına çiftler halinde filtreleri yerleştirin.
    6. Her bir standart hücre konsantrasyonuna karşılık gelen bir filtre çifti olduğu şekilde, eşleştirilmiş filtrenin her biri üzerine Od8 ve boş bir tüp Od9 dilüsyonlar Od1 10 ul başak.
    7. kaputun altında açık Petri kapları bırakın ve 30 dakika boyunca kurumaya bırakın.
    8. steril vida üst 2 ml tüp her filtre parçasını yerleştirin ve bölüm 3.4 detaylı prosedüre göre DNA ayıklayın.
  4. Deneysel ve Çivili Filtreler DNA Ekstraksiyon
    Filtreyi DNA ekstraksiyonu için aşağıdaki değişikliklerle birlikte üreticinin protokolüne uygun olan toprak DNA ekstraksiyonu için tasarlanmış ticari kitler kullanın.
    1. Her fil içinter örneği (Od1-Od8), 0.5 mi steril tüp içinde asitle yıkanmış cam boncuklar bir karışım hazırlanması. ≤106 um bir çapa sahip olan 425-600 um ve 0.3 g boncuk bir çapa sahip 0.1 g boncuk kullanın.
    2. dairesel akışı ile biyolojik kabinede, bir dezenfekte 1.12 cm çapında bir mantar delici kullanarak her filtre örnek üzerinde rastgele seçilmiş yerlerden üç yuvarlak parçalar kesip, ve vida-üst, 2 ml tüp koyun.
    3. tüplere cam boncuk karışımı ekleyin.
    4. üreticinin protokolü belirtilen miktarda biyolojik kabine her tüpe ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen hücre lisis tamponu ekleyin.
    5. bir kova buz hazırlayın ve mekanik bir boncuk çırpıcı kullanarak hücrelerin bozabilir.
    6. 1 dakika boyunca boncuk yendi ve daha sonra 1 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Beş kez tekrarlayın.
    7. post-parçalama adımı kit tedarikçinin protokolü ile devam edin.
    8. verilen elüsyon tamponu ile elüsyon sonra (10 mM Tris B içerenUffer) ya da NFW DNA verimini artırmak için daha kolonu boyunca örnek yeniden.
      Not: DNA ekstraksiyonu ile aynı gün analiz edilmemiştir, numuneler, analiz edilinceye kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
Standart Hücre Seyreltme Serisi A- Hazırlanması
Tüp Nihai hücre konsantrasyonu (hücre mi-1) Standart hücre hacmi (mi) Nükleazlar serbest su hacmi (ml) Toplam hacim (mi)
Od0 Hem ile belirlemeksayım odası ocytometer
Od1 10 7 hücre ml aralığına elüt olmalıdır -1 20
OD2 10 -1 Od1 Od1 2 18 20
Od3 10 -2 Od1 OD2 2 18 20
od4 10 -3 Od1 Od3 2 18 20
Od5 10 -4 Od1 Od4 2 18 20
Od6 10 -5 Od1 Od5 2 18 20
Od7 10 -6 Od1 Od6 2 18 20
Od8 10 -7 Od1 Od7 2 18 20
Boş 0 0 20 20
DNA Standart Eğrisi B- Hazırlanması
Tüp Nihai DNA konsantrasyonu (mg mi-1) Standart DNA hacmi (mi) Nükleazlar serbest su hacmi (ml) Toplam hacim (mi)
NanoDrop ile belirlemek
DD1 10 1 mg ml aralığına elüt olmalıdır -1 20
Dd2 10 -1 DD1 DD1 2 18 20
DD3 10 -2 DD1 DD2 2 18 20
DD4 10 -3 DD1 DD3 2 18 20
DD5 10 -4 DD1 DD4 2 18 20
Dd6 10 -5 DD1 DD5 2 18 20
DD7 10 -6 DD1 Dd6 2 18 20
DD8 10 -7 DD1 DD7 2 18 20
Boş 0 0 20 20
1 "style =" height: 21px; "> DD0

Tablo 2:., DNA, standart eğri, standart hücre hacmi NFW hacmi ve her çözücüden bir tüp içinde toplam hacmi için ayrıntılı bir standart mikroorganizma hücresi seyreltme serisi (A). Standart DNA hacmi NFW hacmi ve her çözücüden bir tüp içinde toplam hacmi için ayrıntılı bir DNA, standart eğri hazırlanması, (B).

  1. DNA, standart eğri hazırlanması
    1. Aşama 3.4 deneysel filtreleri için anlatılan ile aynı prosedür kullanılarak ilgi mikroorganizma (DD0) bir örneğine şirketinden DNA ekstrakte edin.
    2. 260 nm'de standart DNA numunesi (DD0) DNA konsantrasyonu belirlemek için bir spektrofotometre kullanarak.
    3. Tablo 2B'de gösterildiği gibi, bir DNA standart eğri hazırlamak için olan, dokuz, steril 0.5 ml tüpler hazırlayın.
    4. Gerekirse, 20 ul toplam hacim içinde 1-10 ug ml -1 ilk tübün (DD1) 'de bir konsantrasyon aralığı içinde, standart DNA solüsyonu DD0 seyreltin.
    5. Dd2-DD8 ve boş tüpe 20 ul tüpler için NFW 18 ul ekleyin.
    6. Aktarım Dd2 içine DD1 standart DNA çözeltisi 2 ul. Pipet hafifçe karıştırın ve sonra DD3 için Dd2 2 ul aktarın. Tüpler boş boru containi ile 10 0 -10 arasında bir seri seyreltme -7 tüplerde Dd2-DD8 elde etmek için birlikte aynı şekilde DNA seyreltilmesi devamng sadece NFW.
      Not: analiz edilinceye kadar -20 ° C'de, ekstraksiyon aynı gün deposu örnekleri analiz değilse.
  2. Nicel PCR analizi
    1. ısınmak için önceden q-PCR aleti açın.
    2. Tablo 3'te ayrıntılı olarak yeni bir program dosyasında cihaz çalışan yazılım çalıştırmak Q-PCR için ayrıntıları yerleştirin.
      Not: Farklı enstrümanlar her bir termal döngü adım için farklı optimum zamanlama var. Bu giriş cihazın kılavuzunda belirtilir.
    3. Yüzey DNA temizleyici ile çalışma yüzeyi dezenfekte ve sadece steril tüplere, ipuçları ve reaktifler ile çalışır.
    4. Bir sonraki çalışma tezgah bir kova buz hazırlayın. Buz üzerinde muhafaza edin Taq polimeraz karışımı.
    5. plaka işgal edilecek reaksiyon toplam kuyu sayısını hesaplayın. İlave reaksiyonlar için teorik yardımı (% 5) yapmak ve toplam reaksiyonunun hesaplamak için reaksiyon başına hacim ile reaksiyonlar büyütülmüş çarpınn hacmi.
    6. NFW, primerler, prob, ve son olarak da, Taq polimeraz karışımı başlayarak Reaksiyon karıştırılır havuz hazırlayın. Tablo 4'te karışık havuzu için hacim hesaplamalarında örneğe bakın.
    7. kullanılıncaya kadar reaksiyon karanlıkta karışımı ve buz üzerinde saklayın.
    8. üçlü olarak Q-PCR mikrotablada kuyu içindeki (negatif kontrol olarak) standart DNA, örnek DNA veya NFW 1 ul koyun.
    9. plaka çalışma yüzeyi dokunmadan engellemek için ve temiz tutmak için bir plaka sahibi olduğundan emin olun.
    10. Her bir reaksiyon Karma havuz (Tablo 4) 9 ul ekle.
    11. Optik yapışkan film ile plaka Kapak ve her taraftan sıkıca kapatın.
    12. q-PCR cihazında yerleştirmeden önce 1000 xg'de 1 dakika boyunca plaka kova ile bir santrifüj plaka aşağı doğru döndürün.
    13. aracı haline plaka koyun ve çalışan bir programı etkinleştirin.
Parametre ayrıntılar Yorumlar
algılama yöntemi Kantitatif hidroliz prob
Termal döngü koşulları
Başlangıç ​​denatürasyonu ve enzim aktivasyon 10 dakika boyunca 95 ° C
denatürasyonu 15 saniye için 95 ° C 45 kez tekrarlayın
Tavlama ve uzatma 60 saniye için 60 ° C
plaka dizisi
standart eğri DD1 - DD8 ilk 3 satır da 1-8 kuyularda seyreltme başına 3 tekrarlar
Sigara şablon kontrolü (NTC) Nükleazlar serbest su (NFW) 3 9'da tekrarlar inci iyi üst3 satır.
analiz örnekleri DNA filtrelere ekstrakte Geri kalan kuyular da numune başına 3 tekrar.
primer seti her biri göz başına
örnek hacmi 10 mi

Tablo 3:. Q-PCR işletim yazılımı Ayrıntılar analiz parametrelerinin Detayları q-PCR programı dosyası içine girilmelidir.

reaktif Reaksiyon başına hacim (ml) Reaksiyonların sayısını Hata karşılığı(% 5) Toplam hacim karışımı (mi)
Taq polimeraz karışımı 5 50 52.5 262.5
F primerinin (10 mM) 0.5 50 52.5 26.25
R, primer (10 mM) 0.5 50 52.5 26.25
Nükleazlar ücretsiz su 3 50 52.5 157.5
DNA, - 1 mi 96 plakasının hedef oyuklara direkt olarak eklenir.

Tablo 4:. Kantitatif PCR Reaksiyonu Mix Hesaplama reaksiyon başına Cilt, reaksiyonların sayısı, ödenek hata için, ve toplam hesaplanan hacim reaktif başına reaksiyon karışımı içine ilave edilmesi detaylandırılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu "off-line" örneklenmiş filtreleri analizleri kullanılarak atmosferik aerosoller incelemek için yaygındır (Şekil 2). 32 Kimyasal örneklenmiş madde, organik (örneğin protein, hidrokarbon molekülleri, sakkaritler) ve inorganik (örneğin metaller, tuzlar) dahil içeriği analizleri . Biyolojik analizler uygulanabilir ve cansız mikroorganizma içeriği, bir DNA ya da yaklaşımı mikroskobu kullanarak tür tanımlamak, hem de DNA tabanlı ölçümü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma Filtreler üzerinde toplanan aerosol örneklerinde endotoksin ve DNA hediyesi hem ölçülmesi için çıkarma ve algılama yöntemleri anlatılmaktadır. yöntemler doğru rutinleri gerektiren ve uzun Deneyciler Burada tartışılan birkaç temel ve önemli noktaları yapışır gibi kolayca yapılabilir.

endotoksin algılama adım için, lizat çözüm oldukça viskoz ve pipetleme üzerine kabarcıkları üretmek eğiliminde olduğunu unutmayın. Sana kabarcıklar kaldırmak zordur, ve onlar mikroplaka okuyucu değerle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, destek ve tavsiyeleri için Weizmann Enstitüsü Kimya Fakültesi'nden Dr. Yoav Barak'a teşekkür eder. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe # 913/12) ve Federal Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın finansmanıyla Minerva Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Filtre örnekleme
HiVol 3000 - Yüksek Hacimli Hava ÖrnekleyiciEcotech
Kuvars Mikrofiber FiltrelerWhatman1851-865203 mm x 254 mm
ELF - Laboratuvar Odası FırınlarıKarbolitELF 11 serisi
Alüminyum folyoOpal
< strong>NameCompanyKatalog NumarasıComments
Endotoxin
EthanolSigma Aldrich16368 Laboratuvar Reaktifi, %96
Airstream Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini AC-4E1ESCO10011712
Pyrotell -TAssociates of Cape Cod, Inc.T0051
Cape Cod, Inc.Kontrol Standardı EndotoksinE0005-1 Escherichia coli  O113: H10, 0.5 ve mikro; g/flakon 1 Paket
LAL Reaktifi CapeCod, Inc. Su OrtaklarıW0051
Luer-Lok Uçlu 10 ml steril şırıngaBecton-Dickinson & Co.
BD Precisionglide şırınga iğnesiBecton-Dickinson & Co.305129Steril 
Parafilm-M sızdırmazlık bandıParafilmP7543Sigma katalog numarası
Mikrotüpler AxigenMCT-200-C2 ml, pirojen içermez
1,12 cm çap Mantar DeliciBoekel Scientific1601 BD Serisi - ÇelikÇeşitli çaplarda deliciler içeren bir mantar delici setinin parçası.
50 mm Petri KabıMiniplast Ein-Shemer72050-01Aseptik
Vorteks Cini 2 Bilimsel Endüstriler, Inc.SI-0297
Mikrosantrifüj 5415 DEppendorf22621408
TC MicroWell 96 F SI, kapaklıNunc167008Düz tabanlı kuyular (kapaklı (ayrı ayrı sarılmış)), steril, pirojen içermez
Synergy HT Çok Algılamalı Mikroplaka OkuyucuBiotek7091000
İsim< / güçlü >< güçlü > Şirket< / güçlü>Katalog NumarasıComments
DNA
DNA uzaktaSigma Aldrich7010
İlgilenilen mikrobiyal türlerin standart DNA'sıATCC veya diğer kültür koleksiyonuekstraksiyonu için uygun mikrobiyal suş veya ekstrakte edilen DNA
Neubauer ile geliştirilmişMarienfeld640030hemositometre
TE tamponu, Düşük EDTA'lıLife Technologies12090-01510 mM Tris-HCl (pH 8.0)  0.1 mM EDTA 
Nükleaz içermeyen PCR sınıfı su Sigma Aldrich3315959001
PCR primerleriSigma Aldrichİlgilenilen mikrobiyal türleri
Çift Etiketli ProblarSigma Aldrichİlgilenilen mikrobiyal türleri hedefler
Vidalı kapaklı tüplerAxigenST-200-SS2 ml & nbsp;
PowerSoil DNA ekstraksiyon kiti Mo Bio Laboratories12888-100
Cam boncuklar, asitle yıkanmış 425-600 & mikro; mSigma AldrichG8772-100G
Cam boncuklar, asitle yıkanmış < 106 ve mikro; mSigma AldrichG4649-100G
PowerSoil Çözeltisi C1Mo Bio Laboratories12888-100-1Hücre lizis tamponu, Güç toprak Kiti
Magic Touch buz kovasıBel-Art18848-4001
Mini-Boncuk Çırpıcı-16BioSpec607EUR
StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR SistemiUygulamalı Biyosistemler4376600
Hızlı SYBR Green Master Mix UygulamalıBiyosistemler4385612
TaqMan Gen İfadesi Master MixUygulamalı Biyosistemler4370048
MicroAmp Hızlı Optik 96 Kuyulu Barkodlu Reaksiyon Plakası, 0.1 mlUygulamalı Biyosistemler4346906
MicroAmp Sıçramasız 96 Kuyulu BazUygulamalı Biyosistemler4312063
MicroAmp Optik Yapışkan FilmUygulamalı Biyosistemler4311971
Santrifüj 5810 REppendorf5811 000.010Rotor A-4-62, MTP kovaları ile 
Associates309605 DNA hedefler

Kaynaklar

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938(1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endotoksin AnaliziDNA EkstraksiyonuFiltre rneklemesiT rbidimetrik l mKantitatif PCRCam Boncukla Par alamaPirojen ermeyen SuSantrif gasyon ProtokolBiyog venlik KabiniMikroplaka Okuyucu

İlgili makaleler