Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yapısal ve biyofiziksel çalışmalar için salgılanan memeli proteinlerinin üretimi zorlu, zaman alıcı ve maliyetli olabilir. Burada, memeli hücrelerinde salgılanan protein ekspresyonu için zaman ve maliyet açısından verimli bir protokol ve nikel afinite kromatografisi kullanılarak bir adımlı saflaştırma açıklanmaktadır. Sistem, ekspresyon virüsleri geliştirme veya kararlı eksprese edici hücre hatları oluşturma gibi adımları ortadan kaldırdığı için protein üretme süresini büyük ölçüde azaltan, süspansiyon halinde memeli hücrelerinin büyük ölçekli geçici transfeksiyonuna dayanmaktadır. Bu protokol, basit kimyasal modifikasyonla kolayca yapılabilen ucuz transfeksiyon ajanları veya artan transfeksiyon verimliliği ve azalmış sitotoksisite yoluyla verimi artıran orta fiyatlı transfeksiyon ajanları kullanır. Ortam glikoz seviyelerinin dikkatli bir şekilde izlenmesi ve sürdürülmesi protein verimini artırır. Ekspresyon adımında doğal glikanların olgunlaşmasının kontrol edilmesi, X-ışını kristalografisini sürdürmek için ideal özellikler olan uygun şekilde katlanmış ve fonksiyonel memeli proteinlerinin nihai verimini arttırır. Bazı durumlarda, tek aşamalı saflaştırma, kristalizasyon için yeterli saflıkta protein üretir, bu da burada örnek bir durum olarak gösterilmiştir.
Giriş
Atomik düzeyde protein yapısını anlamak biyolojik yollar ve hastalıkların moleküler temelini açığa çıkarmak için bir anahtardır. X-ışını protein kristalografisi makromoleküler yapıları belirlemek için en yaygın olarak kullanılan / uygulanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin en önemli sorun uygun bir şekilde katlanmış, saf protein yeterli miktarda elde edilmesidir. Bu durum, özellikle, belirli post-translasyonel modifikasyonlar maruz salgılanan memeli proteinlerinin birlikte çalışan bir sorun haline gelir.
Bakteriyel-ifade proteinler Protein Bilgi Bankası 1 yatırılır kristalize proteinlerin başlıca kaynağıdır. Bunların pahalı olmay....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Büyük ölçekli geçici Transfeksiyonu için Plazmid DNA Miligram metrajlarının 1. Üretim
- Kısıtlama alanı klonlama ya da diğer uygun teknik kullanılarak yüksek bir kopya sayısı memeli ifade vektörüne ilgili proteini klonlama.
- En iyi sonuçlar için, sahip pHLsec 7 vektörü, kullanmak yerleşik C-terminal 6His-etiketi, güçlü bir promotör Kozak dizisi ve optimize salgılama sinyali.
- Yetkili hücreleri üzerine plazmid Transform.
- Plazmid DNA 1 ug üzerine E. coli hücreleri 20 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 42 ° C'de ısı şoku hücreler 35 sn için, daha sonra 2 dakika süreyle buz ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada miyeloid hücreler 2 (hTREM2, kalıntılar 19-132) ifade insan proteini tetikleme reseptöründen salgılanan 13 kDa immünoglobin (Ig) etki uygulandığında, bu sentezleme sisteminin sonuçlar izler. TREM2 iki disülfid bağları ve iki tane N-bağlantılı glikosilasyon sitesi olan tek bir hücre dışı Ig alanı içeren bir tip I transmembran proteindir. Birçok Ig proteinleri 8 farklı olarak, TREM2 bakteriyel inklüzyon cisimcikleri 9'dan yeniden katlama için uygun değildi. Daha sonraki mutagenez teyit N b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
HEK 293F hücreleri post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren proteinlerin üretimini sağlam sunuyoruz. Bu sistem disülfıdlere, glikosilasyon, aksi takdirde daha rutin ifade araçlarını kullanarak yokluğunda olacağını fosforilasyon içeren özgün katlanmış proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir bir ifade verir. Buna ek olarak, bu sistem, sadece birden fazla plazmidin birlikte transfeksiyonu ile ekspresyonu ve çoklu protein kompleksleri saflaştırılması için de kullanılabilir. TREM2 Bunun yanı sıra, bu sistem yoğun bir labor.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH R01-HL119813 (TJB'ye), Amerikan Akciğer Derneği RG-196051 (TJB'ye), CIMED Pilot ve Fizibilite hibesi (TJB'ye), Amerikan Kalp Derneği Doktora Öncesi Bursları 14PRE19970008 (Z.Y.'ye) ve 15PRE22110004 (DLK'ye) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kültür Şişeleri | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Yaşam Teknolojileri | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Yaşam Teknolojileri | 35050-061 | Glutamin |
| Hype 5 transfeksiyon reaktifi | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fektin transfeksiyon reaktifi | Yaşam Teknolojileri | ||
| PEI transfeksiyon reaktifi | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kiti | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amiloz Reçine | NEB | E8021S | |
| Hücre Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Hücre Kültürü Takviyesi |
| GlucCell | CESCO Biyomühendislik | DG2032 | Glikoz İzleme Sistemi |
| Opti-MEM | Yaşam Teknolojileri | 519850.91 | Serumsuz Ortam DNA transfeksiyonu için |
| Luria Suyu (LB Media) | Yaşam Teknolojileri | 10855-001 | |
| GC10 Yetkili Hücreler | Sigma-Aldrich | G2919 |
Kaynaklar
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674(2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
