Ateroskleroz Hızlı Algılama Demir Oksit Nanopartiküller Mikrodalga odaklı sentezi

Özet

Mikrodalga teknolojisi ateroskleroz plak karakterizasyonu için demir oksit nanopartiküllerinin son derece hızlı bir sentez edilmesine imkan verir. nanoparçacık dış tarafında bir aminobisfosfonat kullanımı aterosklerotik alanda hızlı bir birikim sağlar.

Özet

Hızlı ve tekrarlanabilir mikro-dalga ile tahrik edilen bir protokol neridronate işlevselleştirilmiş nanopartiküllerin sentezi için geliştirilmiştir. hidrofobik nanopartiküllerin sentezi başlayarak, bizim yöntem mikrodalga tahrik senteze termal ayrıştırma yöntemi bir adaptasyon dayanmaktadır. Yeni metodoloji geleneksel usullere göre reaksiyon süreleri bir azalma oluşturur. Ayrıca, mikrodalga teknolojisinin kullanımı, klinik uygulamalar açısından önemli bir şey reaksiyonlarının tekrarlanabilirliği arttırır. Bu demir oksit nanoparçacık yenilik Neridronate eklenmesidir. Bu molekülün kullanımı aterom plağının in vivo, in vitro ve seçici birikimi özelliklerini bağlayıcı ²⁺ Ca sağlar Nanopartikülün dışına doğru bir bisfosfonat parçasını açar. protokol Kurumu'nun yayınladığı gelen ilk sentez beri yaklaşık 3 saat içinde sentezini ve plak algılanmasını sağlarCı ön. en az 1 saat, aterosklerotik alandaki birikimi, klinik uygulamalar için özellikle uygun olan bir kontrast maddesini içerir.

Giriş

Ateroskleroz kuralsız lipid metabolizması ve kusurlu inflamatuvar yanıt kaynaklanan arter duvarının bir çok faktörlü kronik inflamatuar bir hastalığıdır. Nedeniyle yaygınlığı ve bu ve ilgili kardiyovasküler hastalıklar ekonomik ve sosyal maliyetlere nanoteknoloji en umut verici biri olan yeni araçları ile patolojiyi ele artan bir ilgi var. ^1-3 Ancak hızlı çok az örnek vardır kliniğe çeviri için temel üretim ve prob karakterizasyonu ⁴ bir bifosfonat ile ve ApoE aterosklerozun in vivo tespiti daha işlevsellik için demir oksit nanoparçacık mikrodalga sentezini kullanın Bu protokolde ^{-. / -.} 1 saat içinde fareler ⁵ demir oksit nanopartiküllerinin (IONP) iyi bilinen bir nano malzeme ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için kontrast maddesi olarak kullanımı, farklı hastalık saptanması için kurulmuştur olanSon yıllarda s. ^6-8

Mikrodalga sentezi (MWS), yüksek tekrarlanabilirlik ve gelişmiş verimleri ile son derece kısa sürelerde nanopartiküller sentezleyerek sağlar. Protokolde ^9,10 biz plak üç adımda hedefleme yetenekleri ile IONP edinin. Nihai bir nedeniyle kalsiyum-bağlayıcı özellikleri stratejimizin önemli bir aminobisfosfonat, Neridronate, bir ektir. Doğal analog pirofosfat (PPi) dolayı, Neridronate osteogenesis imperfekta (Ol) ve Paget hastalığı, kemik mineral yönelik yüksek afinite (PDB) tedavisinde kullanılmaktadır. ^11-13

protokol üç adım 1. Adım bir ve iki mikrodalga teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmektedir şemasında özetlenmiştir. İlk adım, yayınlanan yöntemler modifikasyonla Oleik asit ile kaplanmış demir oksit nano-tanecikleri (OA-IONP) bulunur. ¹⁴ protokolü tradit mikrodalga sentezine bir uyarlamauğratarak termal bozunma sentezi. ^15,16 Fe (acac) ihtiva eden bir karışım, _3, oleik asit, oleilamin ve 1,2-dodekandiol benzil alkol içinde çözündürülür ve iki ısıtma işlemlerinde tabi tutulur. Saflaştırma, EtOH ile yıkama ve süpernatan içinde yüzey aktif maddelerin fazlasının ortadan kaldırmak için bir Nd-Fe-B, mıknatıslı parçacıkların toplanması gerçekleştirilir. Daha sonra, OA-IONP _CHCI3 içinde stabilize edilir. Çok hızlı ısıtma, beklendiği gibi, beklenen sonuçlar mikrodalga ile sentezlenen nanopartiküller çekirdek (3.7 ± 0.8 mil) ve geleneksel, termal ayrışma ile karşılaştırıldığında hidrodinamik boyutu (7.5 mil) açısından daha az olduğunu gösterdi; Ancak, nanopartiküller hala mükemmel bir kristalliği sunuyoruz.

İkinci adım KMnO _4, grubumuz MW koşulları için değiştirildiği geliştirilen orijinal metodolojisi gibi güçlü bir oksitleyici kullanılarak, oleik asit içinde mevcut olan çift bağı, doğrudan bir kimyasal modifikasyonu oluşur.Ve çift bağ ^- 17 Birinci aşama MnO ₄ arasındaki kompleksleri oluşturur. Daha sonra, asidik koşullarda bir ikinci aşama, azelaik asit IONP veren oleik asit molekülünün bölünmesini üretir. 9 dakika her biri bu iki aşamasından sonra, numune MnO ₄ fazlalığını azaltmak için NaHSOa ile, _3% 1 ilk yıkama saflaştırılır ^- MnO ₂ ve daha sonra% 1 NaOH ile asidi nötralize etmek için.

saflaştırma adımından sonra, azelaik-IONP 10 mM fosfat tamponu pH = 7.2 içinde stabilize edilmiştir. Bu tampon benzer şekilde orijinal, termal reaksiyon ne kadar parçacıkların koloidal istikrar için en iyi ortamdır. ¹⁸ OA-IONP bulunan çift bağın doğrudan oksidasyonu için mikrodalga kullanımı avantajları çok iyi bir örnektir nanopartiküllerin sentezinde bu teknolojiyi kullanarak. Reaksiyon 24 saat sürer klasik yöntemle, mikrodalga kullanımı Reacti azaltmak18 dakika zamanında. Ayrıca, mikrodalga odaklı protokol 4 tekrarlar sonra hidrodinamik boyutu 30 ± 5 nm ile nanopartiküller veren mükemmel bir tekrarlanabilirlik göstermektedir. hidrodinamik boyutu değişikliği dışında, zeta potansiyeli hızla reaksiyon başarılı kontrol etmek iyi bir parametredir. Nedeniyle Azelaik-IONP yeni karboksilik grupların varlığına bağlı olarak, zeta potansiyeli değeri ısı yaklaşım ile elde edilen değer yaklaşık -44 mV çok benzer.

Azelaik-IONP için neridronate bağlanması için geleneksel EDC / sülfo-NHS konjügasyon kullanılır. Bu sentetik yaklaşım iyi kurulmuş ¹⁹ aktive edilmiş bir karboksilat kullanılarak yana sülfo-NHS, reaksiyon sırasında kolloidal kararlılığı sağlar. fosfat tamponu ortadan kaldırılması neridronate, reaksiyon, 1 mM HEPES tampon içinde gerçekleştirilir sonra (pH 7). Reaksiyon, dar bir boyut Distr 40 ± 4 nm'lik bir hidrodinamik boyutu Neridronate-IONP vermektediribution ve zeta potansiyeli gibi -24,1 mV.

Yöntemin uygulanabilirliği aynı koşullar kullanılarak, serbest aminlerin herhangi bir peptit / antikor bağlanmasını sağlar, ancak Prosedür T ₂ -ağırlıklı kontrast maddesi MRI içinde farklı amaçlar için, aterosklerotik plak in vivo görüntüleme için IONP hızlı sentezi için tarif edilmektedir alanı.

Protokol

Reaktiflerin 1. Hazırlık

1. 1 mM HEPES tamponu damıtılmış su, 100 ml HEPES 23.8 mg eritilmesi hazırlayın. pH 7'ye ayarlayın.
2. % 10 NaHSOa ₃ damıtılmış su, 100 ml NaHSOa ₃ 10 g çözülmesi hazırlayın. 15 dakika boyunca karıştırın.
3. 100 ml su içinde NaOH, 1 g eritilmesi NaOH çözeltisi hazırlayın. 10 dakika boyunca karıştırın.
4. 1 L su NaH ₂ PO ₄ 600 mg eritilmesi 10 mM fosfat tamponu hazırlayın. fosforik asit dikkatli bir şekilde 0.34 ml ilave edilir ve 30 dakika boyunca karıştırın. 2.9 pH (kabul aralığı 2.7-3.0) ayarlayın.
5. 1 L'lik bir hacmi pH'ı 7.2'ye ayarlayın yapmak NaH ₂ PO ₄ 269 mg ve damıtılmış su Na ₂ HPO ₄ 1.09 g çözülerek 10 mM fosfat tamponu hazırlayın.

Nanopartiküller Kaplı Oleik Asit 2. Sentezi (OA-IONP)

1. Mikrodalga uyarlanmış bir şişe içinde Fe (acac) _3, 0.5 g, ekleme olei 1.4 miCı asit, oleilamin, 0.6 ml 1,2-hexadodecanediol 1.19 gr. kademeli bir pipet kullanarak dikkatli bir şekilde bir şişe duvarından fenil eter 10 ml.
2. mikrodalga reaktöründe balon tanıtılması ve mikrodalga protokolü başlar.
   Not: Mikrodalga yazılımı sıcaklık, basınç, karıştırma hızı, güç ve reaksiyon süresi gibi değişik parametreler için büyüklüğü tercih sağlar. Ayrıca, ayarlanabilir sentezine izin veren aynı protokolde üç farklı aşamaları yüklemek imkanı vardır. Yüklenen sentetik protokol başladığında, mikrodalga mümkün (ramping süreci) kadar hızlı örnek ısıtır ve seçilen reaksiyon süresi (işlemi çalıştıran) sırasında korur. iktidar Seçim eğimleme zamanını belirler.
3. mikrodalga dinamik bir çalışma yükleyin. protokol üç aşama içerir:
   1. Aşama 1: 60 ° C, süresi 2 dakika, basıncı 250 psi ve güç B 150 sıcaklığını ayarlamak. Stir hızı yüksek bir konumda ve ON maksimum güç olmak zorundadır.
   2. erkeklere özele 2: 200 ° C, süre 20 dakika, basıncı 250 psi ve güç B 300 sıcaklığını ayarlamak. Stir hızı yüksek bir konumda ve ON maksimum güç olmak zorundadır.
   3. Aşama 3: 250 ° C, süre 10 dakika, basıncı 250 psi ve güç B 300 sıcaklığını ayarlamak. Stir hızı yüksek bir konumda ve ON maksimum güç olmak zorundadır.
4. protokolü bitirdikten sonra, şişe, oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
   NOT: Soğuma işlemi ile ya da gaz akımında olmadan yapılabilir. Her iki durum da aynı sonuçları vermektedir. Agrega karıştırma çubuğu görünür ve şişenin duvarında, EtOH ile yıkayın ve Erlenmeyer'den üzerine koydu.
5. Cam bir pipet kullanarak bir Erlenmeyer Reaksiyon karışımı aktarın ve EtOH% 98 10 ml. , Şişesi altında Nd-Nb-B mıknatıs koymak 5 dakika bekleyin ve bir cam pipet ile süpernatant kaldırmak.
6. EtOH 10 ml ekleyin 2 dakika ve 40 kHz için oda sıcaklığında örnek sonikasyon, mıknatıs üzerinde örnek koymak ve süpernatant ortadan kaldırır. leas bu adımı yineleyint üç kez.
7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 40 kHz _CHCI3 sonikasyon 30 ml oleik nano partikülleri dağıtılır. üreticinin talimatlarına göre ZETASIZER hidrodinamik boyutunu kontrol edin. Cam küvet içinde OA-IONP 0.5 ml koyun ve _CHCI3 0.5 ml ekleyin. Kabul aralığı 7-10 nm yoğunluğu Z-ortalama boyutu olarak ifade edilmiştir.
   Not: OA-IONP heksan içinde iyi dağıtılabilir.

Azelaic Asit Nanopartiküller 3. Sentezi (Azelaic Asit-IONP)

1. _CHCI3 (3: 2 mi) KMnO ₄ 44.3 mg ve _H2O karışımı içinde BTACl bölgesinin 150.4 mg çözülür. Mikrodalga balonu adapte OA- IONP bir 5 mi kana elde edilen çözüm ekleyin.
2. Azelaic asit-IONP için mikrodalga protokolünü başlatın. 105 ° C 'ye ayarlanmış sıcaklık, zaman 9 dak, 300 W basınç 250 psi ve güç şişeye fosfat tampon maddesi pH 10 ml = 2.9 koyun ve mikrodalga protokolü tekrarlayın. adım soğutulduktan sonra, nano-tanecikleri geriBir mıknatıs kullanarak ve süpernatant ortadan kaldırır.
3. Bir mıknatıs kullanarak parçacıkları toplar, 25 ° C'de 2 dakika süreyle 40 kHz'de bir Erlenmeyer şişesi, sonikasyon% 10 NaHSOa ₃ 5 ml ilave edilir ve yüzer ortadan kaldırır. (Aşama 2 kez tekrarlanır.),% 1 NaOH ile nano-tanecikleri, üç kez daha yıkanır ve son olarak fosfat tampon maddesi, pH, 5 ml = 7.2 içinde yeniden dağıtılır.
4. hidrodinamik boyutu ve zeta potansiyeli kontrol edin. atılabilir katlanmış kılcal hücreye Azelaic-IONP 0.7 ml koyun ve ZETASIZER üzerine takın.
   NOT: yoğunluk Z-ortalama boyutu olarak ifade nm boyutunda 25-35 için kabul aralığı. Z-Potansiyel -45 ± 5 mV için kabul aralığı. Daha büyük nanopartiküller (~ 70 mil) fosfat tampon maddesi, pH> 7 yerine, pH = 2.9 (ref Chem Eur J 2008) elde edilebilir.

4. Neridronate nanopartiküllerin sentezi (Neridronate-IONP)

1. Azelaic-IONP 2 ml kısım ile bir santrifüj EDC 12 mg ve Sülfo-NHS 15 mg ekleyin. koymak35 dakika boyunca oda sıcaklığında bir girdap karışım.
2. Nanopartiküller destabilize süpernatan aspire ve HEPES, 1 mM, pH = 7 tampon 1.5 ml parçacıkların yıkama santrifüj altında bir mıknatıs koyun. (Bu adım iki kez tekrarlanır). Daha sonra, neridronate, 5 mg ilave edin ve 2 saat boyunca bir girdap karışımı çalkalanır.
3. 1 mM HEPES pH = 7 tampon maddesi ile bir mıknatıs ve yıkama (3 x 2 mi) ile ayrı nanopartiküller. Son olarak, 1 mM HEPES pH = 7 tampon, 2 ml Neridronate-IONP dağıtılır.
4. hidrodinamik boyutu ve zeta potansiyeli kontrol edin. (Ekipman kurulumu bölümüne bakınız) atılabilir katlanmış kılcal hücreye Neridronate-IONP 0.7 ml koyun ve ZETASIZER üzerine takın.
   NOT: yoğunluk Z-ortalama boyutu olarak ifade nm boyutunda 40-45 için kabul aralığı. Z-Potansiyel -20 ± 5 mV için kabul aralığı.

ApoE ateromlar Plak Vivo Algılama 5. ^{- / -} MRG ile Fareler

1. MRI Acquisition Hazırlık
   NOT: Birkaç eskihayvan deney için tra sistemlerine ihtiyaç vardır. Böylece, bu gerektirecektir:
   1. hayvanları uyutmak için uygun ekipman kullanın.
   2. Hayvan istikrarlı sıcaklığını korumak için harici sıcak hava ile yakın devre dolaşan sıcak su sistemi edinin.
      NOT: Bu durumda MR uyumlu izleme ve yolluk sistemi MRG mıknatıs içinde hayvanın ısısını kaydeder.
   3. hayvanın yakınında dış sıcaklığı Monitör, hayvan, MR konsolunda entegre arabirimini kullanarak toraks yakın hayvanın bünyesinde bulunan solunum sensörünün gövdesi (rektal termometre) sıcaklığı.
2. MR Deney
   1. Bir% 100 oksijen hattı ile (iki ya da üç dakika ve MR deney sırasında bakım için 1-1.5% sırasında indüksiyonu için% 2) buharlaştırılmış izofluran hayvanların anestezisi.
   2. Bir profil edinme yardımı ile mıknatısın merkezinde hayvan yerleştirin.
   3. Adım 5.2.2 sonra ayar RF 300 MHz (7 T) rezonans frekansına bobin ve optimum sinyal alımı için 50 Ohm bobinin karakteristik empedansını maç.
      NOT: Harici kablolama ve bireysel verici bobin her parçası için adaptör / splitter üzerinden ölçüm sistemi olacak bağlantılara dikkat edin (bizim durumumuzda bir kareleme bobin idi).
   4. ayarlama ve bobinler eşleşen sonra, tarayıcıya bobinler takın.
   5. RF darbe kalibrasyonu (şekil ve uzunluk) ve orta frekans ayarı için nabız kalibrasyon ve elle frekans merkezini hem gerçekleştirin. elle 90 ° darbe kalibrasyonu, kaba layneri (aşağıya bakınız), orta frekans ve alıcı kazanç ayarlamaları yapın.
   6. eksenel, koronal ve sagital da denilen tripilot: Bir gradient eko (FLASH veya GRE) yerelleştiricisinin tarama (3 uçak izci edinme kullanarak tam konumunu gerçekleştirin.
   7. cen manyetik alan homojenliği optimize etmek için mıknatıs terazi ayarı gerçekleştirinmıknatısın ter. bir ya da tek darbe FID sırasını kullanarak (5.2.3 bakınız) manuel bu adımı gerçekleştirin ve sisteme dahil birinci ve ikinci siparişleri şimleri ya da herhangi bir otomatik layneri dizisi ayarlamak
      NOT: İyi shimmed manyetik alan, kolayca tanınan ve T2 * ile ölçülür (daha iyi daha büyük) ya da spektrumları dar FWHM.
3. Plak ⁵ MRG Veri Toplama
   1. Intravenöz kuyruk damar içine 100 ul neridronate nanopartiküller (1 mg [Fe] ml ^-1) enjekte edilir ve görüntüleri 1 saat sonrası enjeksiyon kazanır. abdominal aort (böbrek çatallanma) bakarak aterosklerotik plak MRG edinimi için parametreleri yükleyin.
   2. eserler en aza indirmek için araya ekleme modunda, 10 ila 20 dilim çok dilimli koyun.
   3. 30 x 30 mm (eksenel) (koronal) x 30 mm FOV 60, küçük degrade bobin işbirliği ile (kalınlığı 0.8 mm dilim: yüksek çözünürlüklü hızlı spin eko T1 ağırlıklı aşağıdaki parametrelerle koronal veya eksenel görünümünde MRG Edinmenfiguration bu 0.6 mm), 400 msn TR, 8 msn TE, 5-8 dk ortalama satın alma süreleri için 8 (küçük gradyan) sinyali ortalamalara 256 x 256 edinimi ve yeniden matris verileri, 6 (büyük gradyan) indirgenebilir.
      NOT: TE özellikle kritik ve uygulamaları kısıtlayabilir kan sinyal ve akışı ve kimyasal kayma eserler varlığıdır. Bu durumlarda duyarsız fast spin eko T2 IR plak karakterize etmek için yardımcı olabilir eserler ve aynı yerde tamamlayıcı verilerin edinilmesini azaltmaya yardımcı olabilir akar. Ayrıca, bir presaturation darbe duvar ve kimyasal kayma eser azaltma dış sınırının daha iyi belirlenmesi için arter duvarını çevreleyen yağ dokusu azaltmak için kullanılabilir.
   4. ^5: uygun yazılım (Tıbbi Görüntüleme Veri Examiner örneğin OsiriX Görüntüleme Yazılım veya amid) gibi Dicom olarak standart bir format kullanarak görüntüleri ve görünümü aktarın. el ves sınırlayan kontrast etkisini ölçmeksel alanı, duvar kalınlığı, lümen alanı ve plak yükü ^5.

Sonuçlar

Bu protokol, üç farklı IONP sentezi tarif edilmektedir. hidrofobik OA-IONP başlayarak sulu dengeli nanopartiküller mikro-dalga ile tahrik edilen sentez yardımıyla elde edilir. Çok dar bir boyut dağılımı (Şekil 1c) tüm nanopartiküller sunulan çok küçük hidrodinamik boyutu (Dh <50 nm). mikrodalga teknolojisi kullanımı temel boyutları açısından çok küçük nano-tanecikleri oluşturur. mikrodalga yana hızlı bir ısıtma, nanopartiküllerin çekirdek küçük boyutları vererek başka...

Tartışma

Demir oksit nanopartiküllerinin (IONP) önemli nano biri olan ve uzun zaman önce, farklı uygulamalar için kullanılmaktadır. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI) için kontrast maddesi olarak bu maddelerin kullanımı, iyi kurulmuş bir alandır. Ancak, sentez yolları genellikle birkaç zaman alır ve kompozisyon karmaşıktır. dramatik reaksiyon sürelerini azaltmak ve tekrarlanabilirlik artırır nedeniyle mikrodalga odaklı sentezi kullanımı yüksek kaliteli nanopartiküllerin üretimi için iyi bir alternatif gibi görünüyor. Yukarıda t...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mikrodalga Gezgini/Discover Hybrid-12	CEM Corporation, ABD		Kimyasal sentez için herhangi bir mikrodalga kullanılabilir
Tek kullanımlık PD-10 tuz giderme kolonları	GE Healthcare yaşam bilimleri	17-0851-01	Herhangi bir boyut hariç tutma sütunu çalışacaktır
Amicon® Ultra-0.5 ml	Merck Millipore Ltd
Kalibre edilmiş pH metre	SI analitiği	285105127
Neodimyum mıknatıs	Aiman Gz	ND010B
Girdap Dehası 3	IKA	3340000
ZetaSizer Nano ZS	Malvern Instruments
Standart (makro) hücreli Optik cam	Labbox	11718
Zetasizer nanoseries disponsable katlanmış kılcal hücreler DTS1070	Malvern
Bruker Minispec mq60	Bruker