Yöntem makalesi

Kök hücre benzeri

DOI:

10.3791/53474

⸱

2 Şubat 2016

1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral gelişimin altında yatan genetik programları anlamak, gelişimsel ve kök hücre biyolojisinin önemli bir hedefidir. Amfibi blastulada, blastocoel'in çatısındaki hücreler pluripotenttir. Bu hücreler izole edilebilir ve gen ekspresyonunun manipülasyonu veya morfojenler tarafından indüksiyon yoluyla çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Bu yazıda, erken nöral gelişimin anahtar in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak Xenopus laevis blastocoel çatı eksplantlarının kullanımına ilişkin protokoller anlatılmaktadır. Bu protokoller, kader edinimi, hücre göç davranışları ve hücre otonom ve otonom olmayan özelliklerinin araştırılmasına izin verir. Blastocoel çatı eksplantları, serum içermeyen tanımlanmış bir ortamda kültürlenebilir ve konakçı embriyolara aşılanabilir. Bir embriyoya yapılan bu transplantasyon, uzun vadeli soy bağlılığının, indüktif özelliklerin ve nakledilen hücrelerin in vivo davranışının araştırılmasına izin verir. Bu tahliller, nöral gelişimin altında yatan moleküler mekanizmaları, hücresel süreçleri ve gen düzenleyici ağları araştırmak için kullanılabilir. Rejeneratif tıp bağlamında, bu tahliller, ilaç taramasında kullanılabilecek in vitro nöral kaynaklı hücre tipleri oluşturmak için bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı sinir sistemi nöroepitelyal homojen bir hücreler katmanı olarak nöral plaka ortaya çıkar. Gelişimsel programlar nöral plaka bölgeselleşme sırasında, uyarılan kodlanmış, ve kurulan nasıl anlamak, şu anda, gelişim biyolojisi önemli bir hedeftir. Diğer sistemlere göre, deneysel müsait Xenopus embriyo sinir gelişim 1,2 erken adımları analiz için tercih edilen bir modeldir. Bu embriyoların çok sayıda elde etmek kolaydır ve dış gelişme nörülasyon 3 ilk adımlar erişim sağlar. Birçok araç deneysel Xenopus laevis (X. laevis) embriyonik gelişim işlemek için kullanılabilir. Mikro enjeksiyon birlikte biyokimyasal ve farmakolojik araçlar ile indüklenebilir MOS dahil mRNA veya morpholinos (MO), bir, fonksiyon kazanç (GOF) ve fonksiyon (LOF) kaybı ve yolları 4,5 sinyal belirli değişiklik kontrollü verir. Blastocoel çatı ektoderm, bir blastulanın veya çok erken gastrula embriyo hayvan kutup etrafında yer alan ve "Hayvan Cap '(AC) olarak adlandırılır, gen ekspresyonunun önce manipülasyonu ile programlanabilir pluripotent hücreler kaynağıdır hazırlık eksplant. Bu yazıda X. kullanmak için ayrıntılı protokoller laevis AC eksplantları vitro ve in vivo moleküler mekanizmalar ve hücresel süreçleri altta yatan nöral gelişim test etmek.

Bir teknik Xenopus iribaş nöral tüp içinde gen ekspresyonu ince gözlem, kader tayini ipuçları belirlenmesinde bir ön adımı izin sunulmuştur. Düz monte dokuların gözlenmesi yaygın piliç embriyoları 6 çalışmada kullanılan Oysa, düzgün Xenopus tarif edilmemiştir. 2 veya 4 hücreli dönem embriyoların blastomer içine sentetik mRNA veya MO enjekte ederek gen ifadesinin Manipülasyon AC programlanmasına olanak tanır4 eksplant. Anti-BMP faktörü Noggin sentezlenmesiyle Kemik Morfogenetik Proteini (BMP) yolunun, örneğin inhibisyonu için, AC hücreleri 3 için bir sinir kimlik vermektedir. Protokol bir anyon değiştirme reçinesi boncuk ile doğrudan temas yoluyla dışsal uyaranlara AC eksplant yerel ve zaman kontrollü pozlama gerçekleştirmek için ayrıntılı. Son olarak bir teknik ayrılmış ve yeniden ilişkili programlanan farklı hücrelerden hazırlanan karışık eksplant nakli in vivo sinir progenitörlerin gelişim özelliklerini test etmek için bir işlem açıklanmaktadır.

Kurbağa embriyo erken omurgalı nöral gelişimini incelemek için güçlü bir modeldir. Gen ifadesinin manipülasyonu birleştiren in vitro kültürleri eksplantasyona için neuroepithelium bölgeselleşme, çoğalması ve morfojenezinin 7-12 çalışmada önemli bilgiler sağlar. AC eksplant programlama ex vivo 13,14 fonksiyonel kalp gelişimini izin verdi. Kullanımaşılama eksplant 15 nöral tepe farklılaşma programı 16 indükleyici az transkripsiyonel anahtarın tanımlamasına yol açmıştır. Zona limitans intrathalamica (ZLI) kaudal ön beyin gelişimini ve bölgeselleşme kontrol sonik kirpi (Sus) salgılar bir sinyal merkezidir. Sürekli Shh maruz kaldığında, üç transkripsiyon faktör genleri coexpressing nöroepitelyal hücreler - barH benzeri homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) ve Iroquois-3 (irx3) - ZLI bölmenin iki özelliklerini kazanmak: yeterliğinin şşş ifade ve ön nöral plak hücrelerden ayırmak yeteneği. Bir model sistem olarak, nöroepitelyal hücrelere bir ZLI kaderin indüksiyonu 8 sunulacaktır.

Bu protokoller temel mec keşfetmek için gelişimsel biyologlar ve diğer araştırmacılar için basit, ucuz ve verimli araçlar sağlamayı amaçlıyorAnahtar nöral hücre davranışları hanisms. Bu protokoller çok yönlü ve dışsal ve içsel nöral belirleme ipuçları geniş bir ürün yelpazesi soruşturma izin verir. Bu sinir soy bağlılığı, endüktif etkileşimleri ve hücre davranışlarının in vivo analizlerde uzun vadeli izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneyler bilimsel amaçlarla ve yedek, azaltılması ve arıtma uluslararası kurulan ilkeleri ile kullanılan hayvanların korunması konusunda ulusal ve Avrupa yönetmelik ile uyumlu.

Xenopus 1. Düz montaj sonrası Tadpoles Anterior Sinir Tube laevis in Situ Hibridizasyon Tüm montaj

  1. X edinin standart prosedürler 4 ve 26 ve üzeri (Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17 neurula sahne ulaşana kadar onları yaş göre embriyolar laevis.
  2. Fix X. % 4 paraformaldehit (PFA) içindeki bir çözeltisi içinde inkübe edilerek kurbağa yavrularını laevis. 38 embriyolar, daha sonraki aşamalarda embriyolar için oda sıcaklığında 2 saat sahne sahne 26 için, 1 saat oda sıcaklığında 1.5 Kaya ve 2 ml cam şişe embriyolar döndürün.
    DİKKAT: PFA temas ve şüpheli karsinojen tarafından toksiktir. Bir başlık altında manipüle edilmelidir.
    NOT: Bir X laevis damızlık olduğunugenellikle 2 ml'lik bir cam şişe içinde sabit, ancak daha büyük bir cam şişe kullanılabilir.
  3. Iki kez,% 0.1 Tween (PBT) ile 1x PBS kullanarak aynı şişe içinde embriyolar, oda sıcaklığında 3 dakika yıkayın.
    NOT: Aksi kullanılan PBS belirtmek sürece veya kalsiyum ve magnezyum olmadan.
  4. Aynı şişe içinde oda sıcaklığında en az 12 saat süre ile 100% metanol (MeOH) içerisinde embriyolar kurutmak. Plastik mikropipet kullanarak başlık altında en az iki kez MeOH% 100 olarak değiştirin.
    NOT: MeOH içinde çözündürülmüş lipitlerin hafif sarı bir döner. MeOH Solunduğunda toksik ve bir başlık altında manipüle edilmelidir Dikkat.
  5. PBS, MeOH PBS içinde% 50, iki kez PBS, PBS içinde% 25 MeOH, oda sıcaklığında her banyo 5-10 dakika içinde MeOH 75:% kademeli MeOH banyolarının dizi, aynı şişeyi kullanarak embriyolar rehidrate. MeOH çözümleri plastik mikropipet kullanarak başlık altında değiştirilir.
  6. Plastik bir pipet kullanarak, embriyo PBT üstüne dolu bir 60 mm Petri kabındaki disseke transfer. İki ince forseps bakım kullanmaTamamen optik sapı düzeyinde, gözler ve nöral tüp arasındaki tek ince forseps takarak gözlerini çıkarın. Nöral tüp gözleri ayırın. Dikkatle nöral tüp örten ektoderm altında forseps tanıtmak. Bakım ile, başın arkasında başlayarak ektoderm soyulabilir ve atın.
  7. Kullanarak bir çift veya tek ISH gerçekleştirme digoksigenin işaretli ya da daha önceden olarak fluoresan etiketli problar 18,19 tarif.
  8. ISH PBT plastik pipet kullanarak üstüne dolu yeni bir 60 mm Petri kabındaki embriyoların transferi sonrasında.
  9. Ince forseps kullanarak dikkatlice embriyo geri kalanından nöral tüp ayırın. Bu aşamada, ön nöral tüp posterior nöral tüp ayırır. Dikkatle nöral tüp, gevşek nöral tüp, otik veziküller ve mezodermin kalan parçaları aşağıda bağlı olduğu Notokordun örten ektoderm kalan kısımlarını ayırın. Nöral tüp herhangi ekler yoksun olduğundan emin olunbu aşamada.
    NOT: Gerekirse ucunda bir uç kesim ile plastik transfer pipet yardımıyla tüm nöral tüp / embriyo transferi veya bir mikropipet gerçekleştirmek nöral tüp zarar görmesini önlemek için. Burun ucunun çapı nöral tüpün büyüklüğü ayarlanır.
  10. Parçalara nöral tüp transfer PBS içinde seyreltilmiş 50% gliserol ile doldurulmuş, 1.5 ml bir tüp içinde (not adım 1.9). Nöral borular gliserol çözeltisi altına düşene kadar 4 ° C 'de, genellikle O / N, dur.
  11. % 50 gliserol çözeltisi kaldır / PBS mikropipet P1000 ile aynı 1.5 ml tüp içinde bir mikropipet P1000 olarak% 90 gliserol / PBS çözeltisi ilave edilir. Nöral tüpler 4 ° C'de, genellikle,% 90 gliserol / PBS çözeltisi altına O / N düşene kadar bekleyin.
    NOT: Uzun süreli depolama için, bakteri gelişimini önlemek için% 90 gliserol / PBS artı antibiyotik kullanımı.
  12. Bir cam plaka, ya da bir plastik transfer pipet yardımıyla bir mikroskop lamı üzerinde sinir tüpleri aktarın.
  13. Disdorsal ve tungsten iğneler kullanılarak ventral midlines boyunca sinir tüpleri mezhep. Bu adım sırasında sinir tüpleri% 90 gliserol / PBS tutulur.
  14. Bir cam lamel ile kaplı takviye halkaları kullanılarak% 90 gliserol / PBS nöral tüpün iki tarafını monte edin.
  15. Vernikle lamelleri düzeltmek ve 4 ° C'de tutun.

Anyon Değişim Reçine Boncuk kullanma 2. Hayvan Cap Eksplantlar İndüksiyon

  1. Mikropipet P1000 kullanılarak 2 ml tüp içine anyon değiştirici reçine boncuk 100 ul aktarın. Steril damıtılmış su ile boncuk en az beş ardışık kez yıkayın. Boncuk tüpün dibinde tortu ve mikropipet P1000 kullanılarak steril distile su yerine izin verin. Boncuk dokunmayın.
  2. Boncuklar, 4 ° C'de Sığır Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) ile steril damıtılmış su ile dolu bir 2 ml tüp içinde, O / N ıslatın.
  3. İki saat yeni bir 1.5 ml komisyonlarda, boncuk yeri yarısını toplayarak öncemikropipet P1000 kullanılarak tüp. Molekülünü içeren bir maddenin 500 ul de endüktif potansiyeli için test ya da belirli bir kaderi indüklediği bilinen steril damıtılmış su değiştirin. Bir negatif kontrol olarak kullanılmak gibi, boncukların diğer yarısını tutun.
  4. En az 2 saat süreyle 4 ° C'de inkübe edin boncuklar.
  5. Stereomicroscope altında sonraki tüm adımları uygulayın ve bir mikropipet ile tüm AC transferini gerçekleştirmek.
  6. Plastik bir transfer pipeti kullanılarak% 0.2 BSA ile tamamlanmaktadır kalsiyum ve magnezyum ile PBS içine Blastula ya da çok erken gastrula embriyolar aktarın.
    NOT: Embriyolar 20 ila 24 saat içinde 12 ° C ulaşmak blastula ve gastrula aşamalarında geliştirilmesi.
  7. Daha önce açıklandığı gibi 20 forseps kullanarak embriyonun vitellin membran çıkarın. Tek forseps ile embriyo sabitleyin. Diğer forseps tarafı vitellin membran sıkıştırın. Zarının Holding, yavaş yavaş embriyo onu sıyırın. Ven bu yordamı gerçekleştirmekEmbriyonun tral (bitkisel) taraf. Embriyonun hayvan tarafını zarar vermeyin.
  8. Daha önce açıklandığı gibi 21 küçük komisyonlarda izole edin. Hayvan kutup embriyonun pigmentli bir parçasıdır. Kullanımı ince forseps hayvan kutup dışarı doku küçük bir kare kesip. AC dokusu sadece ektodermal hücreler içerir. Doku muntazam kalınlıkta olduğundan emin olun. Değilse, analize AC kaldırın.
  9. Barth'ın Salin (MBS) 4 Değiştirilmiş 0.5x bir Terasaki multiwell plakalarda her ac yerleştirin. Iyi yuvarlak alt ile temas halinde, aşağı pigmentli hayvan tarafı ile kuyunun içine ac yerleştirin.
    NOT: Bir% 0.1 BSA çözeltisi ile kaplama pipetler plastik yapışkan doku küçük parçalara yapışmasını önler.
  10. Mikropipet P20 kullanarak her kapakta tek boncuk yerleştirin. Gerekirse, dikkatle kapağın ortasına boncuk yerleştirmek için forseps kullanabilir.
    NOT: klimalı ortamda batırılmış zaman boncuk pembe renklidir. En co Seçinlored boncuklar.
  11. Terasaki oyuklu bir plaka hareket RT'de 6 saat boyunca (18 22 ° C) inkübe edin. Boncuk az 2 saat ac yapışıyor.
  12. Su ile ıslatılmış kağıt üstünde Terasaki çukurlu bir levha yerleştirin. Plastik bir kap ile plaka örtün.
    NOT: Bu 'nem odası' kuyuların erken buharlaşmasını önler.
  13. Kardeş embriyolar senin faktörün etkisini test etmek doğru aşamaya kadar Kültür 0.5x MBS veya 3/4 NAM ACs 15-20 ° C'de nem odasında (adım 4.1).
  14. Taze hazırlanmış% 4 PFA 1 saat komisyonlarda düzelt. Daha önce (Adım 1.4) açıklandığı gibi% 100 MeOH içinde komisyonlarda kurutmak.

3. Hayvan Cap Hücre Ayrılma ve reaggregation bir Xenopus laevis neurula içinde Aşılama önce

  1. Kaplama petri kaplarına (60 mm) ya da kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS, steril su içinde ya da% 3 agaroz ile 12 kuyucuklu plak. B karşılamak için yeterli agaroz eklepetri veya kuyunun ottom. RT (18-22 ° C) plakaları ön ısıtmak. İsteğe bağlı olarak, su kaybını önlemek için 4 ° C'de birkaç gün için tabak saklı.
  2. Hazırlama kalsiyum içermeyen Holtfreter tuz (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 4.6 mM HEPES,% 0.1 BSA (A-7888 Sigma pH 7.6)) ile Holtfreter tuzlu su (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.9 mM CaCl2, 4.6 mM HEPES,% 0.1 BSA, pH 7.6) 5. Not: CaCI2 çözeltisi Otoklava.
  3. Agarozun kaplı Kalsiyum içermeyen Holtfreter tuzlu su ile üstüne de doldurun.
  4. Daha önce açıklandığı gibi kendi komisyonlarda izole etmek blastula veya çok erken gastrula embriyolar hazırlayın (2.7 2.5 adımları).
  5. En az 15 ya da 30, küçük bir ACs 21 kadar izole edin. Kullanımı ince forseps hayvan kutup dışarı doku küçük bir kare kesip. AC dokusunun sadece ektodermal hücreler içerir ve bu nedenle aynı kalınlığa sahip olan. Değilse, analize AC kaldırın.
    NOT: Hayvan kutup Embry olduğunuo'in en pigmentli kısmı.
  6. Bir içine komisyonlarda aktarın iyi Kalsiyum içermeyen Holtfreter tuzlu su ile üst dolu agaroz kaplı. Onların pigmentli tarafı yukarı bakacak şekilde komisyonlarda yerleştirin.
    NOT: ayrışma süreci kalsiyum ücretsiz Holtfreter tuzlu su içinde hızla başlar.
  7. Hücreler dissociating başlamak için birkaç dakika bekleyin. Dokuların ayrıştırma ile bu gözlemleyin. Ince forseps kullanarak, AC geri kalanından pigmentli tabakayı ayırmak ve bir mikropipet P20 ile atın. Tam hücre ayrışma işlemi birbirinden hücrelerinin ayrılmasını belirtir.
    NOT: Bir veya iki pigmentli katmanları aşılama sırasında görselleştirme yardımcı olmak için yeniden toplanmış eksplant içinde bırakılabilir.
  8. Plaka dairesel hareketler kullanarak hücreleri merkezi. Bir mikropipet kullanarak dikkatle mümkün olduğunca orta kaldırmak P1000. Hücreleri dokunmamaya özen gösterin.
  9. Çukuruna kalsiyum ile Holtfreter tuzlu su 1 ml ilave edilir. Ayrışmış komisyonlarda aktarın1.5 ml tüp içine.
    NOT: 2 ml tüpler da yuvarlak tabanlı nedeniyle kullanılamaz.
  10. Bir tezgah santrifüj (500 xg) için 2000 rpm maksimum hızda santrifüj, 5 dakika ile pelet hücreleri. Mikropipet P1000 ile dikkatlice süpernatantı.
  11. Ayrışmış hücrelere kalsiyum ile Holtfreter tuzlu su (60 mM NaCI, 0.7 mM KCI, 0.9 mM CaCI2, 4.6 mM HEPES 20 ul ekle,% 0.1 BSA (Sigma A-7888 pH 7.6) 5.
  12. Ayrışmış komisyonlarda, 3 (18-22 ° C) oda sıcaklığında saat 6 tutun.
    NOT: Bu hücreler yeniden agrega için gerekli zamandır. Hücreler tüpün dibinde küçük bir top form olarak yeniden toplanma görülebilir.
  13. 0.5x MBS ya da 3/4 NAM 1 ml 1 ml ekleyerek tüp alt dikkatle ayırın eksplant (adım 4.1). Plastik transfer pipet kullanarak bir un kaplı levhada eksplant aktarın.
  14. Kendi kontrol kardeşleri ile eksplantlar Sahne. Uzun süreli kültür kullanımı antibiyotik: kanamycin (50 ug / ml), ampisilin (50 ug / ml) ve gentamisin (50 ug / ml).

Animal 4. Tırnak X'in Sinir Plate eksplantlar Caps laevis Embriyo

  1. 3/4 NAM hazırlanması (110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0.2x PBS, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C'de diseksiyon ve mağaza için fazla 1 hafta tutmayın. Yaşlı NAM agaroz kaplı diseksiyon yemekler (aşağıda) hazırlanması için kullanılabilir.
  2. Coat petri küçük delikler silikon kalıp veya bir masa tenisi raketi kapağını kullanarak yapılmış içine 3/4 NAM% 3 agaroz ile (60 mm).
    NOT: Agaroz petri alt kapsar. Petri 3/4 NAM ile doldurmak, böylece biraz boşluk bırakın. Alternatif kurutmayan modelleme kil ile diseksiyon yemekleri yapmak. Kil içinde diseksiyon işlemi sırasında hafifçe embriyolar sıkın. Küçük delik kazmakagaroz yuvarlak forseps Bu 'diseksiyon çanak' kullanarak diseksiyon işlemi sırasında embriyoların tutmak için yardımcı olur.
  3. Diseksiyon araçları toplayın: plastik transferi pipetler, 22, iki ince diseksiyon forseps, P1000 mikropipet ve ipuçları, büyütme 8-40X bir stereosmicroscope (cam Pasteur pipeti ucundaki parafin gömülü kaş saç ile yapılan) bir 'kaş bıçak', fiber optik kılavuzları ile parlak bir ışık kaynağı. Temiz bütün kesme aletleri tutun; Her deneyden sonra, bir kez% 100 etanol ile, distile su ile iki kez yıkayın ve kurumaya bırakın. Metal kesme aletleri tozdan ve gerekli otoklav eğer uzakta saklayın.
  4. Let ayrışmış ve yeniden toplanan Klimalar (protokol 3) ve onların kardeşleri X. Onlar sahne 13 (neurula) ulaşana kadar laevis embriyoların Nieuwkoop ve Faber gelişimsel tabloya göre 17 gelişir. 15 embriyolar sahne nöral plak aşamasında 13 içinde nakil için kullanılır.
  5. Tüm yürütmekstereomicroscope altında sonraki adımlar.
  6. Plastik bir transfer pipeti kullanarak,% 0.2 BSA ile tamamlanmaktadır kalsiyum ve magnezyumlu PBS içine embriyo aktarımı. Daha önce açıklandığı gibi 20 embriyonun vitellin membran çıkarın. Tek forseps ile embriyo sabitleyin. Diğer forseps tarafı vitellin membran sıkıştırın. Sıkıca zarı Holding, yavaş yavaş embriyo onu sıyırın.
    NOT: Embriyonun ventral (bitkisel) tarafında bu yordamı yapın. Embriyolar nöral plakayı zarar vermeyin. Embriyolar Vitellin zar çıkarma aşaması sırasında zarar görmüş ise, plastik bir transfer pipet kullanarak 3/4 NAM içeren 60 mm petri kabına embriyo transferine ve 15 dakika, iyileşme süreci gerçekleşmesi için yeterli bir süre bekleyin.
  7. Taze 3/4 NAM üstüne diseksiyon çanak doldurun.
  8. Plastik bir transfer pipet kullanarak, diseksiyon çanak içine kendi vitellin membran olmadan embriyo transferi. Içine embriyolar dorsal yüzü koyunkuyular. Transfer işlemi sırasında embriyo X beri hava-sıvı arayüzü ile temas girmesine izin yok laevis yüzey gerilimi ile lize edilmiştir.
  9. AC eksplant aktarın plastik transfer pipet veya mikropipet P1000 kullanılarak diseksiyon plaka içine aşılı olması. Pipet sıvı içinde sonra, eksplantlar yavaş yavaş yerçekimi tarafından aşağı lavabo, ya da çok hafifçe itin izin verir.
  10. Yuvarlak forseps ile embriyolar koruyun. Kaş bıçak ile size eksplant taşının greft niyetinde sinir tabak içine bir kesi yapmak.
    NOT: Nöral plakasının ön bükme bir dönüm noktası olarak kullanmak olabilir aşamada 14 anda, diencephalon toprakları (Şekil 4) işaretler.
  11. , Neuroepithelium küçük bir parça kesip yuvarlak forseps ve bir kaş knive kullanarak. Kaş bıçakla eksplant küçük bir parça kesin.
    NOT: eksplant parçası neuroepithelium ablasyon alanı olarak aynı boyut ve şekil konusunda olmalıdır.
  12. Kaş bıçak ve ince forseps kullanarak neuroepithelium kesi içine eksplant parçası yerleştirin. Eksplant hızla embriyo verdiği emin olun.
  13. Alternatif yerinde greft korumak için aşılı embriyo üzerine cam lamel bir parça yerleştirin. Bunu yapmak için, kaba forseps kullanarak çok küçük parçalar halinde ince bir cam lamel kesti. Boyutu yaklaşık 1,5 mm 2 olduğundan emin olun. 3/4 NAM veya PBS kullanarak forseps içeren bir Petri kabı içine parçaları bırakın. Hasar görmesini önlemek için embriyo daha büyük bir cam parçası seçin. Embriyo biraz basık olacaktır.
  14. Taşımadan en az 30 dakika bekleyin, ya da sadece hafifçe diseksiyon plakasını taşıyın. Embriyo 2 saat 30 dakika için kurtarmak ve gerekirse yavaşça lamel kaldırmak edelim. Dikkatle plastik transfer pipet kullanarak, 3/4 NAM dolu temiz bir çanak içine aşılı embriyolar pipetle.
    NOT: Aşılı embriyolar bakteri veya mantar kontaminasyonu geliştirmek eğilimindedir. Uzun vadeli ckanamisin (50 ug / ml), ampisilin (50 ug / ml) ve gentamisin (50 ug / ml ug): ulture antibiyotik kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı türler, embriyolojik manipülasyonları ve düzenleyici genlerin ifade deseninde morfolojik değerlendirmeler dayanarak, bir kavramsal model nöral plak farklı histogenez alanları üreten bir gelişimsel ızgara tanımlayan enine ve boyuna parçalara bölünür savunur. Nöral plaka olarak, ön beyin, orta beyin, Beyin ve omurilik taslakları tüm zaten (23-25 ​​gözden) gastrulasyon sırasında ön-arka (AP) ekseni boyunca kurulmuştur. Nörülasyon sırasında histogenez alanları gen ifadesini...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral gelişim (3,31,32 yılında yorum) çevre dokulardan hücresel gelişim programları ve sinyaller arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. Burada X kullanılabilecek protokoller kümesini tarif dışsal ve sinirsel kader tayini ve in vitro ve in vivo nöral morfogenez katılan içsel faktörlerin keşfetmek için embriyolar laevis. Bu protokoller, X'te gibi kullanılabilir tropicalis embriyolar, ancak X. tropicalis embriyolar X<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, yardımları ve tavsiyeleri için Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef ve Anne Hélène Monsoro-Burq'a ve Institut Curie'nin Hayvan Tesisi'ne teşekkür eder. Yazar, el yazması üzerindeki düzenleme çalışmaları için Paul Johnson'a teşekkür eder. Bu çalışma, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) ve "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 ve ARC 5115; FRC DOC20120605233 ve LABEX Memolife) ve Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ParaformaldehitVWR  20909.290Toksik
anyon değişim reçine boncuklarıBiorad140- 1231
Sığır Serum Albümini SIGMAA-7888Hayvan kap kültürü içinpH 7.6
Gentamisin GIBCO15751-045 antibiyotik
Sığır Serumu AlbüminSIGMAA7906  boncuk hazırlama için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
  2. Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
  3. Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
  4. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  5. Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
  6. Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
  7. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
  8. Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
  9. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
  10. Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
  11. Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
  12. Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
  13. Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
  14. Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
  15. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
  16. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  18. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
  22. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
  23. Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
  24. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  25. Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
  26. Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
  27. Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
  28. Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
  29. Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
  30. Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
  31. Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
  32. Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
  33. Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
  34. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
  35. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  36. Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
  37. Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
  38. Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27(2013).
  39. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
  40. Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Blastos l Tavan EksplantlarHayvan Kapa EksplantN ral Geli im DeneyiKader Kazan m AnaliziH cre G DavranH cre Otonom zelliklerOtonom Olmayan zelliklerIn Vitro K lt rIn Vivo Greftleme

İlgili makaleler