Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Summary

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Abstract

Hidrojeller, bir in vivo benzeri üç boyutlu (3D), doku yapısının sağlanması için mikro-akışkan veya micropatterning teknolojileri kullanılarak mikro ölçekte desenli olabilir. Elde edilen 3D hidrojel-bazlı hücresel yapılar gelişmiş biyolojik çalışmalar, farmakolojik tahliller ve organ nakli uygulamaları için hayvan deneylerinde alternatif olarak sunulmuştur. Hidrojel-bazlı partiküller ve elyaflar, kolayca imal edilebilir, ancak, bu doku onarımı için bunları işlemek oldukça zordur. Bu videoda, biz kontrollü hücresel mikroçevresinin ile makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturmak için kendi montaj ile birlikte, micropatterned aljinat hidrojel sayfaları için bir fabrikasyon yöntem açıklanmaktadır. 200 um ve hassas micropatterns ile - kalsiyum jelleştirme maddesinin bir sis formu, ince hidrojel levha kolayca 100 aralığı içinde bir kalınlığa sahip olarak oluşturulur. Hücreler daha sonra hidrojel yaprak geometrik rehberlik ile kültüre edilebilirduran koşullar. Ayrıca, hidrojel levha hali hazırda bir uç kesim ucu ile bir mikropipet kullanılarak manipüle edilebilir ve desenli bir polidimetilsiloksan (PDMS) kare kullanarak istifleme tarafından çok tabakalı yapılar halinde monte edilebilir. , Basit bir işlem kullanılarak imal edilebilir Bu modüler hidrojel levha, mikro ve makro ve doku yeniden üzerindeki fonksiyonel çalışmalarda da dahil olmak üzere in vitro ilaç deneylerinde ve biyolojik çalışmalar, potansiyel uygulamaya sahiptir.

Introduction

Hidrojeller özellikle biyomalzemeler umut vericidir, ve temel biyoloji, farmakolojik deneyleri ve tıpta önemli olması beklenmektedir. ¹ hidrojel tabanlı hücresel yapıları Biofabrication hayvan deneyleri kullanımını azaltmak için ileri sürülmüştür, ^{2,3, 4} transplante dokuların yerini ve geliştirmek Hücre bazlı deneyler. ^5,6 su-ihtiva eden (hidro) viskoelâstik malzemelerin (jeller), hücrelerin geniş bir sayısı kapsüllenmiş ve 3B, hücresel mikro-kontrol etmek için bir iskele yapısı içinde muhafaza edilmesini sağlar. Mikroakışkan ya micropatterning teknolojileri yönlendirmesi ile birlikte, hidrojel yapıları geometrisi kesin hücresel ölçekte kontrol edilebilir. Tarih, parçacıkların dahil hidrojellerin şekiller, çeşitli, ^7-9 lifler, ^10-12 ve levhalar, ^13-15 aşağıdan yukarıya beğenme yapı birimi olarak kullanılmıştırMakro ölçekli çok hücreli mimarilerinin imalat için ağrıyor.

Hidrojel-bazlı partiküller ve elyaflar Hem mikroakışkan cihazlar kullanılarak akışkan kontrol grubu ile, mikro ölçekli hücre ortamları gibi uygulamalar için kolaylıkla ve hızlı bir şekilde imal olmuştur. Bununla birlikte, mühendislik dokuların temel birimleri olarak, onları yeniden düzenlemek ve makro ölçekli yapıları olarak hacmini büyütmek için. ¹⁶ mikron büyüklüğünde temel modülleri üretmek için daha Makro ölçekli yapıları elde etmek daha zordur karmaşık olacaktır. Hidrojel-bazlı yapıların Levha benzeri birimler basit bir montaj işlemi ile iskeleler hacmini artırmak için de kullanılabilir. Neticesinde, hidrojel levha istiflenmiş katmanları bir hacimsel artış, aynı zamanda 3D uzayda geometrik uzantısı sadece sağlar.

Çoklu yumurtlama içine montajı ile birlikte ^{15 -} Daha önce, ¹³ micropatterned hidrojel tabakaları imal edilmesi için bir yöntem bildirmiştirola- rak hücresel mimarileri. Teknik, çok katmanlı yapıların istifleme işlemi yoluyla karmaşık micropatterning ve hücresel yapıları modüler tasarımı sağlar. Micropatterned edilir istiflenmiş modüler hidrojel levha, imalatı ile, kontrollü bir makro-ölçekte, hücresel mikro-3 boyutlu bir hücre kültür sistemi gerçekleştirilebilir. Bu video protokol insan karaciğer karsinoma hücre hattında (HepG2) göre modüler hidrojel tabakaları oluşturmak için kullanılabilen basit ama güçlü bir üretim yöntemi açıklanmaktadır. Bu tarifnamede, basit olan bu desenli modüler hidrojel tabakaların manipülasyonu ve bir çok-tabakalı yapı halinde asamblajı göstermektedir.

Protocol

1. Mikro Desenli Kalıpların ve Hidrojellerin Hazırlanması

1. PDMS kalıplarının dökümü için standart iki aşamalı fotolitografi tekniği^15,17 ile bir silikon gofretin yüzeyinde SU-8 fotorezist kullanarak istenen mikro ölçekli desenleri üretin. Gösterilen örnek, karaciğer lobül benzeri bir ağ deseni kullanır (Şekil 1).
2. PDMS'yi ve 1:5 oranında bir sertleştirici solüsyonu tartın (ör., 12.5 g PDMS ve 2.5 g sertleştirici).
3. 15 g çözeltiyi iyice karıştırın, kabarcıkları bir vakum odasında gazdan arındırın ve ardından karışık çözeltiyi bir folyo döküm kabı içinde eşit şekilde silikon gofretin mikro desenli bir yüzeyine yayın.
4. PDMS'yi sertleştirmek için silikon gofreti 65 °C'de ısıtılmış bir plakaya 90 dakika boyunca düz bir yüzeye yerleştirin.
5. Sertleşmiş PDMS'yi döküm kabından ve silikon gofretten çıkarın.
6. PDMS'nin kenarlarını kesin ve mikro desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 100 mm çapında bir petri kabına yerleştirin.
7. Birincil sterilizasyon için %70 etanol ve damıtılmış su kullanarak mikro desenli kürlenmiş PDMS'yi petri kabında yıkayın. Daha sonra 65 °C'lik bir fırında 10 dakika boyunca tamamen kurutun.
8. O / N 3 g toz iyonik noniyonik yüzey aktif maddeyi 100 ml damıtılmış su içinde çözün ve karıştırın,% 3 (a / h) bir kaplama çözeltisi oluşturun.
9. Mikro desenli PDMS kalıplarını bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve sulu sıvıların eklenmesini kolaylaştırmak için hidrofilik bir yüzey oluşturmak için 1 dakika (85 W, 0,73 mbar) temizleyin. Ardından, PDMS'nin yüzeyini bir laboratuvar rocker kullanarak en az 3 saat (veya O/N) boyunca 100 ml yüzey aktif madde çözeltisi ile kaplayın.
10. Yüzey aktif madde çözeltisini PDMS kalıplarından yıkayın ve 65 °C'de 10 dakika fırında tamamen kurutun. Ardından, her bir mikro desenli kalıbı 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) radyasyona maruz bırakarak sterilize edin.

2. Hücre süspansiyonunu bir hidrojel öncüsünde hazırlayın

1. Hidrojel öncüsünü hazırlamak için, 0.1 g sodyum aljinat tozunu 10 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün ve %1 (a/h) bir aljinat öncüsü oluşturun. Tozu tamamen çözmek için inkübe edin ve O/N karıştırın.
2. Çözeltiyi 1 ml'lik bir şırıngaya bağlı 0.22 μm'lik bir filtreden süzün.
3. HepG2 hücrelerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatörde% 70 -% 80 birleşene kadar% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile geleneksel bir doku kültürü kabında desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamındaki (DMEM) kültürleyin.
4. Hücreleri PBS kullanarak bir kez yıkayın ve ardından 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 4 dakika boyunca 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyerek tripsinize edin. Kültür kabından hasat edilen hücreleri 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve süpernatantın çıkarılmasını takiben 1 ml PBS kullanarak yeniden süspanse edin.
5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak PBS'deki tek dağıtılmış hücrelerin sayısını sayın.
6. 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjlemenin ve PBS'nin çıkarılmasının ardından, kalan hücre peletine 1 ml %1 (a/h) sodyum aljinat çözeltisi ekleyin ve pipetleme kullanarak nazikçe karıştırın. Hücrelerin son tohumlama yoğunluğu 5 x 10⁶ - 10⁷ hücre / ml olmalıdır. Hücre/hidrojel süspansiyonunu 37 °C'de %5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde inkübe edin.

3. Hücre/Hidrojel Süspansiyonunun Yüklenmesi ve Çapraz Bağlanması

1. Bir çapraz bağlama reaktifi üretmek için 1.47 g kalsiyum klorür dehidratı 100 ml_ddH2O'daçözün (ör., ddH₂O içinde 100 mM CaCl₂ · 2H₂O).
2. Bir nemlendiricinin içini% 70 etanol kullanarak ultrasonik dönüştürücü ile durulayın ve 200 ml çapraz bağlama reaktifi ile doldurun. Nemlendirici 110 mm genişliğinde, 300 mm uzunluğunda ve 170 mm derinliğindedir (yani 110 mm x 300 mm x 170 mm (G x Y x D)).
3. Mikro desenli PDMS kalıplarını bir plazma temizleyiciye yerleştirin ve hidrofilik bir yüzey oluşturmak için 85 W'ta 1 dakika boyunca temizleyin.
4. Kalıptaki mikro desenin kenarına 7,2 μl'lik iyi karıştırılmış hücre/hidrojel süspansiyonunu sabit bir şekilde yükleyin. Gösterilen örnek, karaciğer lobül benzeri bir ağ deseni kullanır (Şekil 1). Süspansiyonun hacmi topografik desene bağlıdır.
5. Hücre/hidrojel süspansiyonunun jelleşmesini sağlamak için, nemlendiriciyi açın ve nemlendiricinin çapraz bağlama reaktifinden bir sis ürettiğini doğrulayın. Çapraz bağlama reaktifini, PDMS kalıplarının topografik yüzeyini 5 cm.
   aralığında kaplayacak şekilde hidrojel öncüsü üzerine püskürtün Not: 5 cm'den daha uzun ve daha kısa mesafeler sırasıyla eksik ve düzensiz jelleşmeye neden olabilir. Nemlendiricinin 250 ml/saat püskürtme hızına sahip olduğundan ve 5 dakikada 20 ml çapraz bağlama reaktifi sisi ürettiğinden emin olun.
6. Çapraz bağlama işleminin ardından nemlendiriciyi kapatın ve PDMS kalıplarını PBS ile doldurun.

4. Tek Modüler Hidrojel Levhaların Kullanımı

1. 200 μl'lik bir pipet ucu kullanarak PBS'yi hidrojel tabakasının etrafına nazikçe pipetleyerek sertleştirilmiş her bir hidrojel tabakasını mikro desenli kalıplardan ayırın.
2. Her bir yüzen hidrojel tabakasını, uçtan kesilmiş 1.000 μl'lik bir pipet ucu kullanarak alın. Her karaciğer lobül benzeri ağ hidrojel tabakası 8 mm x 8.7 mm boyutlarındadır ve 100 - 200 μm kalınlığındadır.
3. Hidrojel tabakasının tek bir katmanını 12 oyuklu bir plakada 1 ml DMEM'e aktarın ve hücreleri in vitro olarak kültürleyin hidrojel yapısını 12 oyuklu plakada bir birim bileşen olarak bir hafta boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde bir bileşen olarak kullanın. Kültür ortamını her gün değiştirin.

5. Çok Katmanlı Hidrojel Levhaların Montajı

1. 18 mm x 18 mm x 4 mm (G x Y x D) boyutlarında ve alt yüzeyinde 170 μm yüksekliğinde sütun yapıları içeren bir PDMS çerçevesi oluşturmak için 1.1 ila 1.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Adım 1.2'deki ile aynı oranda 42 g PDMS ve sertleştirici madde karışımı kullanın. 8 mm x 9 mm x 2 mm (G x Y x D) boyutlarında bir iç çerçeve oluşturmak için PDMS çerçevesi için silikon gofret üzerine özel bir polikarbonat kalıp yerleştirin.
2. PDMS çerçevesini ve 180 μm gözenekli naylon filtre kağıtlarını damıtılmış su ve cımbıza batırılmış halde otoklavda 121 °C'de 15 dakika sterilize edin.
3. Sterilize edilmiş PDMS çerçevesini 60 mm çapında bir petri kabında çeyrek parça naylon filtre kağıdına (5 cm çapında) yerleştirin.
4. Uçtan kesilmiş 1.000 μl'lik bir pipet ucu kullanarak modüler bir hidrojel tabakayı PDMS çerçevesinin içine aktarın. Montaj için kullanılan hidrojel levhalar, imal edildikten sonra en az bir gün kültürlenmelidir.
5. Boş bir 200 μl pipet ucu kullanarak her modüler hidrojel tabakanın kenarını PDMS çerçevesiyle hizalayın.
6. 4 - 6 katmandan oluşan bir yığın oluşturmak için modüler hidrojel levhalar kullanarak 5.4 ve 5.5 adımlarını tekrarlayın.
7. Kültür ortamını, PDMS çerçevesinin altındaki sütun yapılarından dışarı akıtarak çıkarın. Daha sonra çok katmanlı yapının bir köşesine 2 μl aljinat çözeltisi (a/h% 2) ekleyin.
8. Her katmanın kenarlarını diğerininkilerle tutturmak için çok katmanlı yapıya 30 saniye boyunca çapraz bağlama reaktifinden bir sis püskürtün. Çapraz bağlama reaktifinden 2 ml sis kullanın (250 ml / saat püskürtme hızında).
9. Çok katmanlı yapıyı 400 μl DMEM ile nazikçe durulayın ve cımbız kullanarak PDMS çerçevesini çıkarın.
10. 4 ml DMEM ilavesini takiben bir hücre kaldırıcı ile hafifçe silerek çok katmanlı yapıyı filtre kağıdından ayırın.
11. Çok katmanlı yapıyı, filtre kağıdı kullanarak 3 ml DMEM içeren 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve hücreleri in vitro olarak yüzer bir şekilde kültürleyin, hidrojel yapısı 6 oyuklu plakada çok ölçekli bir hücresel iskele olarak bir hafta boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde Kültür ortamını her gün değiştirin.

Results

Bağımsız hücresel hidrojel levhaların imalatını ve manipülasyonunu anlattık. Şekil 1'de gösterildiği gibi, mikro desenli PDMS kalıpları ürettik ve hücre içeren hidrojel, bu kalıpların hidrofilik yüzeyine yüklendi ve aerosol haline getirilmiş bir jelleştirici madde sisi oluşturmak için bir nemlendirici kullanılarak çapraz bağlandı. Kalıplardan serbest bırakıldıktan sonra, HepG2 hücreleri, çeşitli desenlere sahip bağımsız hidrojel tabakalar halinde kültürlendi (Şeki...

Discussion

Bu protokol, modüler hidrojel levhaların üretilmesi ve bunların 3 boyutlu hücresel yapı iskeleleri oluşturacak şekilde birleştirilmesi için basit bir yöntem sağlar.

Kısa sürede net desenli aljinat yapıları oluşturmak için, kalıptaki karmaşık mikro desenleri korumak ve ayrıca hücre canlılığını ve metabolizmasını sürdürmek için yeterince sert yapılar oluşturabilen bir çapraz bağlama süreci tanımlamalıyız. Sis şeklinde bir nemlendirici kullanarak çapraz bağlama reaktifini püskürtmek için sol-jel ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Toz halinde noniyonik yüzey aktif madde
Aljinik asit sodyum tuzu, düşük viskoziteli	Alfa Aesar	B25266
Kalsiyum klorür dihidrat	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonik nemlendirici	MediHeim	MH-2800	Modifiye ekipman, Maksimum püskürtme hızı: 250 ml / saat
Naylon net filtre hidrofilik, 180 & mu; m	EMD Millipore	NY8H04700
Polikarbonat kalıp			PDMS çerçeve deseninin imalatı için özelleştirilmiş kalıp