Bilgisayar Destekli Video ve Dijital Görüntü Analizi Sulu Bakır Akut Maruz Cevabı Balık Yüzme Davranışı nicel

Özet

Balık davranışları üzerindeki çevresel kirleticilerin etkilerini ölçülmesi genellikle sübjektif ve öldürücü bitiş noktaları ile uğraşırken özellikle zorlu olduğunu. Biz sırasında ve bakır çeşitli konsantrasyonlarda 96 saat akut maruz kalma sonrası erken yaşam evresi beyaz mersin (Acipenser transmontanus) yüzme davranışlarını ölçmek için video teknolojisi de dahil olmak üzere yöntemler açıklanmaktadır.

Özet

Sucul organizmaların çevresel kirleticilere verdiği davranışsal tepkiler, hayatta kalma, büyüme veya üreme gibi diğer etkilerin öncüsü olabilir. Bununla birlikte, bu tepkiler ince olabilir ve ölçüm zor olabilir. Bakır maruziyetli genç beyaz mersin balığı (Acipenser transmontanus) kullanan bu makale, bilgisayar destekli video ve dijital görüntü analizi kullanarak davranışsal tepkileri ölçmek için kullanılan teknikleri göstermektedir. Önceki çalışmalarda, bakıra akut ve kronik maruziyetler sırasında erken yaşam evresi beyaz mersin balığı arasında yüzme davranışında ciddi bozulmalar gözlenmiştir. Mersin balığı davranışı hızla bozuldu ve balıklar akıntıya karşı süpürüleceği veya avcılar tarafından kolayca yakalanacağı için tarlada hayatta kalmanın tehlikeye gireceği ölçüde. Bu araştırmanın amaçları, erken yaşam evresi gelişimi sırasında etki süresini belirlemek için bir dizi akut bakır maruziyeti sırasında yüzme aktivitesini ölçmek için protokolleri göstermek ve bu savunmasız erken yaşam evresi balıklarının hayatta kalmasına ilişkin bu tepkilerin önemini anlamaktı. Ölüm oranının bir zaman sürekliliği içinde olmasıyla, bakırın yüzme yeteneğini ilk kez ne zaman etkilediğini belirlemek, popülasyon düzeyindeki etkilerin etkilerini anlamamıza yardımcı olur. Kullanılan teknikler, diğer organizmalar ve stres faktörleri ile deneysel tasarımlara kolayca uyarlanabilir.

Giriş

kirletici poz davranışını nasıl etkilediğini anlamak bazen çok zor ve subjektiftir. Davranış genellikle santral sinir sistemi üzerinden çalışacak ve hayatta büyümek ve üreme bir organizma sağlayacak açık, gözlemlenebilir, tüm vücut bir dizi etkinlik olarak tanımlanmaktadır. Hayatta kalma ¹ ile karşılaştırıldığında nedeniyle zehiri maruz kalma davranış değişiklikleri, çevresel stres, genellikle 10-100 arası kat daha hassas en hassas göstergelerinden birisidir. Bu çalışmaların büyük çoğunluğu faaliyeti, havalandırma, yüzme ve balık ^2,3,4 davranışını yiyecek arama incelenir. Yüzme etkinliği toksisite testleri ⁵ bir kirletici karşılık olarak bir davranış değişikliği belirlenmesinde en sık kullanılan subletal uç noktasıdır. Yüzme değişkenleri sıklığı ve seyahat hareket, hız ve mesafe süresini, sıklığını ve dönüşlerin açısını, konumunu su kolonu ve yüzme desen içerir. Yüzme aktivitediryüzme davranışı etkili bir önlem Sucul Toksikoloji kitap Temelleri Rand ⁶ ile Bölüm 9'da önerilen kriterlere göre bir zehiri duyarlılığın değerlendirilmesi.

Bu yazıda erken gelişmenin çeşitli aşamalarında erken yaşam evresi beyaz mersin bakır toksisitesi (Acipenser transmontanus) Su sadece yüzme davranışı değerlendirilmiştir mersin göre maruziyet nasıl bir örnek olarak bir toksikolojik çalışma sunar ve yüzme ölçülmesine yönelik yöntemler göstermektedir davranış.

Daha önceki çalışmalarda, advers davranışsal tepkileri bakır akut ve kronik maruziyetin ilk birkaç gün boyunca erken başlangıçlı belirgindi ve maruz kalma süresi ve konsantrasyon ^7,8,9 üzerinde giderek daha şiddetli hale geldi. büyüklüğü ve bu davranışsal tepkilerin başlama zamanlaması uzun süreli sağkalım sınırlandırmak için yeterli muhtemeldir ve bu nedenle recrui için sonuçlar göz önüne alındığında endişe vardırtment hatası ^10. doğru, metal maruziyeti yöntemler ve prosedürler bu duyarlılığın önemini yorumlamak için bakır konsantrasyonları göre davranışsal bozuklukların zaman sürecini ve kapsamını ölçülmesi için geliştirilmiştir.

davranışsal fonksiyon ve gelişimi için test protokolleri poz odalarında mersin balığı havai video örnekleri analiz edilerek kuruldu. video örnekleri maruziyet süresi boyunca bakır tedaviler arasında gelişimi ve işlevi niteliksel bir değerlendirme sağladı. Davranış ve barınak arayan faaliyeti gerçekleştirmek üzere ve koordinasyon, denge ve solunum yüzme, barınak arayışı, uyuşukluk etkileyen düşüklüğü zamansal dizisi karakterize etmek zamanı belirlemek için sulu bakır konsantrasyonları maruz sırasında değerlendirildi. Buna ek olarak, video kayıtları kantitatif belgeleyen kendiliğinden yüzme ACTi amacıyla çoğaltma her birinden alt örnekler mersin yapılmıştırvity. Bu bitiş noktaları süresi tedbirleri dahil veya zaman hız ve mesafe piyasada bulunan bir dijital görüntü analiz yazılımı paketi kullanarak ^5,11 gitti, yüzme hareketli geçirdi. Bu yazılım bir görüş alanı içindeki her görüntünün ana hatlarını belirler ve bundan, her resim için merkezini tanımlar. Yazılım sonra hareketin yolları belirlemek için çerçeve arkaya bir çerçeve içinde her centroid konumunu izleyebilirsiniz.

Hayvan Refahı Yasası düzenlemelerine (9 CFR) Final Kuralları geçerli tüm bölümleri ile kültür ve deney sırasında test organizmalarının insani tedavisi için tüm kurumsal kurallarına uyulması Bu çalışma. Çalışmanın sona ermesi üzerine, bütün balık US Geological Survey için Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, Columbia Çevre Araştırma Merkezi tarafından onaylanmış uygun kurallarına göre ötenazi uygulandı.

Protokol

Sulu Bakır konsantrasyonlar Larva Sturgeon Pozlama için 1. Kurulum Diluter

1. ASTM Uluslararası ^13,14,15 tarafından yönergeleri izleyerek böyle bir modifiye Dağı ve Brungs ¹² dilütör sistemi olarak akış sistemi kullanılarak kurmak maruz kalma.
2. etkileri 4-6 ug / L etrafında gözlendi önceki test sonuçlarına göre yüksek bakır konsantrasyonu 25 mg / L seçin. reaktif dereceli bakır II sülfat pentahidrat (>% 98 saflık) kullanın ve bir test stok çözelti kadar karıştırın.
   NOT: pozlama için örnek konsantrasyonu serisi 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1,0625 ve 0 ug / L bulunmaktadır. Yüksek konsantrasyon olarak 25 ug / L ile başlayan% 50 seri dilüsyonları Davranış bozukluğu neden olduğu gözlenmiştir konsantrasyonları bir dizi hedefleyecektir.
3. Bir kullanarak Seyreltici karıştırma odasını spike sunmak için maruz başlamasından 48 saat önce, bir hacimli şişe içinde deney stok çözelti hazırlayın ve setOtomatik şırınga dağıtıcı.
4. Seyreltici karışım odası Test stok çözeltisi, 1 ml ile tutturuldu edildiğinde, 25 ug / L bakır konsantrasyonu ile sonuçlanır, deiyonize su ile 1 L 'sine ilave edilmesi kimyasal ağırlığını belirlemek için bir tablo şablonu kullanın.
   Not: Şekil 1, Seyreltici toksisite testleri için kimyasal hazır hazırlanması için bir tablo şablonunun bir örneğini tasvir etmektedir.
5. bir analitik terazi kullanılarak reaktif dereceli bakır-II sülfat pentahidrat ve 195 mg tartılır ve 1 L'lik bir volumetrik şişe içine dökün ve 48.65 mg / L'lik bir stok konsantrasyonu için iyonu giderilmiş su, 1 L ile karıştırın.
6. Test stok çözeltisi içine otomatik şırınga dağıtıcıdan Giriş hortumunu ve 1 ml başak seviyesini ayarlamak ve güç anahtarını saygısız dilütör açmak ve 48 saat döngüsü çorap öncesinde gelen bakır konsantrasyonu gelmesini sağlayınız izin mersin balığı.
7. Bir de hat 4 yönlü akış splitter takın 16. Yerçekimi su besleme. Çevrim eriyik yoluyla su eriyik güç açıldığında ve bir selenoid vana su seyreltme tanklarına akmasına izin açılır. 15 ° C'ye kadar soğutma ünitesi ayarlayın ve dilütör su banyosunda su sirküle su pompası açın.
   NOT: Bu işlem, bir otomatik zamanı ile düzenlenir.
8. Otomatik zamanlayıcı kullanarak döngüsü her 30 dakikada dilütör ayarlayın ve her günde 12 hacim eklemeler sonuçlanan her döngüsü ile deney su 250 ml teslim test odası çoğaltmak için.
9. Mersin balığı boyutuna göre seçin poz test kabinleri herhangi bir zamanda herhangi bir odasında kabul yükleniyor hızını <10 g balık ıslak ağırlık / L korumak için. Örneğin, 30 gün sonrası servis penceresi (DPH) beyaz mersin (gram cinsinden ortalama ağırlığı 0.17 g) 12 x kullanabilirsiniz ile pozlama yapmak içinYan bir 4 cm'lik delik ile 21,5 cm ² cam kavanoz. Test su akışı için izin vermek için 30 mikronluk paslanmaz çelik süzgeçten ile yan kapak. maruziyet kavanoz test su hacmi L. 1
10. 12 örneklik bir toplam her konsantrasyonda, iki kopya, 50 ml su numunesinin birlikte alınması ve 100 ml'lik bir cam bardak içinde test suyu dağıtmak ve çözünmüş oksijen (DO), sıcaklık, iletkenlik, pH, alkalinite, sertliğini ölçmek 50 ml'lik plastik bir şırınga kullanılarak, toplam amonyak, büyük katyonlar, büyük anyonlar ve çözünmüş organik karbon standart ticari ekipmanlar kullanılarak ve üreticinin talimatlarına uyun.
    Not: Örnekler başlatılması ve maruz sonunda alınmalıdır.
11. kimyasal analizler için alt örnekleri toplamak için yerine bir iğne şırınga bağlı bir sipper saman kullanarak pozlama odalarından deney suyun yaklaşık 24 ml hazırlamak, bir 25 ml plastik şırınga kullanın.
12. sy gelen sipper saman kaldırringe bir polipropilen filtre kartuş yuvasının plastik şırınga 0.45 mikron gözenek boyutu, polyethersulfone membran koyun.
13. filtre içinden Test su 4 ml itin ve atınız.
14. bir aside-temizlenmiş polietilen şişeye filtre içinden Test kalan su 20 ml koyun ve% 1 hacim / yüksek saflıkta hacmi, 3 aya kadar depolama için 16 M nitrik asit asitleştirin.
    Not: kimyasal analiz için numuneler bakır konsantrasyonları teyit etmek için başlangıç, orta ve maruz kalma sonunda alınmalıdır.
15. ABD Çevre Koruma Ajansı Yöntemi 6020A ¹⁷ aşağıdaki indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi kullanılarak kimyasal analiz gerçekleştirin
16. tüm su örnekleri alınarak ve dilütör her stok 10 (rastgele, gelişigüzel) mersin bisiklet sonra deney odasına çoğaltırlar. onlar küçük örgü aşındırıcı olmayan net kullanılarak yerleştirilmiştir kültür tankından mersin toplayın. Küçük bir kepçeli içinde mersin yerleştirinKültür, su ile t. 240 balık toplam maruz başlatmak için ihtiyaç vardır.
17. pozlama sırasında balık yem etmeyin.
    NOT: dilütör düzeni görsel bir kurulum için Şekil 1'e bakınız.
18. pozlama ve kayıt balık ölümlerinin süresince her gün testi Oku ve davranışlarını yüzme izlemek.
    NOT: Diğer uç noktaları uyuşukluk, denge kaybı, solunum değişiklikleri, pigmentasyon değişiklikleri de bakmak için, pozisyon balık aktivite ve görsel tespit edilebilir başka anormallik gizleme, su kolonunda bulunmaktadır.
    NOT: tutarlılık için her gün aynı saatte testi okuyun.
19. piyasada bulunan bir dijital izleme programı kullanılarak (zaman balık, hareketli hız geçirdi ve mesafe taşındı) ölçün ve yüzme aktivitesini ölçmek.

2. Pozlama sırasında Gözlemler ve Ölüm Sayıları

1. Görme Her test ch incelemekkehribar ve not mortalite ve tercihen sabahları, 96 saat maruz kalma sırasında günde yaklaşık aynı anda bilgi formu üzerinde bir davranış kontrol listesi (Tablo 1) kullanılarak anormal davranış gözlemleri.
   NOT: çarpıcı, alışılmadık, subjektif, kontrollerden niteliksel olarak farklı anormal olarak kabul edilir edilir Davranışlar. Optimal gözlemci tedavilerin farkında değildir.
   NOT: Denge kaybı su sütunu içinde dik konumunu korumak için balık yetersizlik olarak tanımlanır ve hareketsizlik taşımak veya kışkırtılması sürece yüzmek balık yetersizlik olarak tanımlanır. Böyle uyuşukluk, hiperaktivite, artış ya da solunum azalmalar, renk değişiklikleri, titreme, spazmlar, şişirilmiş abdomens, pozisyon su kolonu ve diğer olağandışı yüzme desenler gibi diğer anormallikler de bilgi formunda kayıt altına alınmalıdır.
   NOT: Anormal örnekler için video 1 bakınızdavranış.
2. Tutanak ve günlük ölü mersinbalığı kaldırın.
3. Prob ile Çözünmüş Oksijen (DO) metre düzenlenen bir el kullanarak veri sayfasında her maruziyet konsantrasyonu ve kaydın iki tekrarlı in situ ve kayıt suyu sıcaklığında çözünmüş oksijen ölçmek.

3. videoya Yüzme Etkinliği

1. Bir el video kamera kullanarak yakalama video veri örnekleri davranışsal anormallikler belgelemek için test odasının doğrudan havai konumlandırılmış bir tripod monte.
2. Yüzme aktivitesini ölçmek için, çapı PVC boru 13 cm bir parça kesip ve uzun boylu 13 cm Test arena (Şekil 1) olarak kullanmak için. Her gelen bakır konsantrasyonu maruz kalma tanklar içinde eriyik PVC boru yerleştirin. mersin balığı hakkında serbestçe yüzmeye için bu büyük olduğu gibi deney alanı olarak PVC boru içinde alanını kullanın.
3. 96 saat maruz kalma sonunda rastgele her bakır concentratio gelen mersin balığı kalan 5 alt örnekn yüzme faaliyeti için ölçmek ve küçük bir örgü ağı kullanarak test arenaya yerleştirmek.
   Not: mersin ölüm yaygın olduğu daha yüksek bir test konsantrasyonu olarak, herhangi bir geri kalan kalan mersin yüzme etkinliğini ölçmek için kullanılmalıdır ve bazı durumlarda en az 5 olabilir.
4. Test arenaya balık yerleştirdikten sonra, balık, 30 dakika bir süre için gelmesini sağlar.
   NOT: Başarılı, video hatasız analiz belirsiz veya balık görüntüyü gizlemek olabilecek yapının en az bir arka plana karşı balık yüksek kontrastlı bir görüntü gerektirir. balık görüntüsü iyi odak olmalı ve yüzey parlama serbest veya dilütör sistemi kapalı olmalıdır, böylece su hareketli nedeniyle çarpıklıkları arındırılmış olmalıdır.
5. 30 dakika sonra, video kamera AÇIN ve 2 dakika süreyle yüzme aktivitesini kaydetmek için REC ayarlayın.
6. olmak belirlemek için video kayıtları aldıktan sonra balık euthanizehavior.
7. solungaç hareketinin durdurulması için izin vermek için en az 10 dakika boyunca tricaine metansülfonat (MS222) su, konsantre edilmiş bir çözelti içinde mersin yerleştirin.
   Not: en az 250 mg / L lik bir konsantrasyon ve belirli türler için çok daha yüksek olabilir.
8. daha sonraki bir zamanda bertarafı için dondurucuda bir plastik zip kilit çanta ve yerinde ötenazi mersin yerleştirin. video kamera kapatın ve dijital izleme yazılımı kullanarak sonrası işleme için bir bilgisayara tüm video dosyalarını aktarın.

Video Oynatma dan Yüzme Faaliyet 4. Ölçüleri

1. Deney analiz edilecek veri levha ve video veri dosyalarını bulun. Dijital analiz yazılımı işleyebilir uyumlu bir biçime video dosyalarını dönüştürme.
2. Yükle tüm dosyalar yazılımı içine işlenecek. ikonuna tıklayarak açın izleme yazılımı. "Yeni bir deneme oluştur" o altında "Yeni varsayılan deney" i tıklayınana ekranda ption.
3. Ekranda "Yeni Experiment" iletişim kutusunda deney adını girin. Konumu deneme dosyasını seçin kaydedileceği. "Tamam" ı tıklayın. "Video Kaynağı" başlığı altında "bir video dosyasından" "Kur" .Choose altında "Deney Ayarları" seçeneği seçin.
4. "Arenalarda Sayısı" için "1" seçeneğini seçin. "Arena başına konuların sayısı" için "3" seçeneğini seçin. "Paletli Özellikleri" başlığı altında "Merkez noktası algılama" seçeneğini seçin. İstenilen birimleri seçmek.
5. "Setup" altında "Deneme listesi" seçeneğini seçin. Ekranın üst kısmındaki "Video Ekle" yi tıklayın. Ekranda "Video Ekle" iletişim kutusunda "Sıralama düzeni" seçeneği altında "Alfabetik düzeni" seçiniz. "Gözat" ı tıklayın. Video dosyalarının bulunduğu klasörü gidin.
6. tüm video dosyalarını vurgulayın. "Aç" ı tıklayın. Click ekranın üst kısmındaki "Değişken Ekle". "Içine" Konsantrasyon "EnterEtiket "kutu. Enter" Açıklama "kutu" içine "mikrogram / L Bakır konsantrasyonu.
7. "Tür" için aşağıya açılan listesinden gelen "sayısal" seçiniz. "Önceden tanımlanmış Değerler" kutusuna tıklayın. görünen "Sayısal Değerler önceden tanımlayabilirsiniz" iletişim kutusunda seçeneğini "Bireysel değerler tanımlama" seçin.
8. Enter "0", "3", "6", "13", "25" ve "Önceden tanımlanmış değer" uzayda "50". Click her numara ek arasına ">> Ekle". seçeneği "diğer değerler izin ver" seçeneğinin işaretini kaldırın. "Tamam" ı tıklayın.
9. "Deneme" birini seçin "Kapsam" kutusuna açılan menüden. sağlanan kutulara her deneme için uygun konsantrasyon girin. Click ekranın üst kısmındaki "Değişken Ekle". Enter "Etiket" kutusuna "Çoğalt". "Açıklama" kutusuna "numarasını Replicate" girin. "Tür" için aşağıya açılan listesinden gelen "sayısal" seçiniz.
10. P "üzerine tıklayınen yeniden Değerler "kutusunu işaretleyin. Seç" Sayısal Değerler önceden tanımlayabilirsiniz "seçeneğini" Bireysel değerleri belirleyin >> ". uzay tıklayın" 1 "," 2 "," 3 "ve" 4 Önceden tanımlanmış bir değer "" "iletişim kutusunu. Enter" Ekle "her numara ek arasındadır. seçeneğinin işaretini kaldırın" diğer değerleri izin ver "option.Click" Tamam ".
11. "Deneme" birini seçin "Kapsam" kutusuna açılan menüden. sağlanan kutulara her deneme için uygun çoğaltmak numarasını girin. Ekranın üst kısmındaki "Ayarlar" sekmesi altında "Arena Ayarları" nı seçin. İlk ayar "Deneme 1" olarak adlandırın. "Arena Ayarları (Deneme 1)" iletişim kutusundan "Kepçe Background Image" seçeneğini tıklayın.
12. "Kepçe Background Image" iletişim kutusunda "Gözat" ı tıklayın. Deneme 1 video dosyasını bulun ve "Aç" a tıklayın. Video göründükten sonra "tut Background Image" iletişim kutusunda "Kepçe" seçeneğini tıklayın. Ekran und üst kısmına yakın beyaz daire simgesini tıklayın"Arena Ayarları" er.
13. tüm yüzme alanı daire içine alınır ve böylece görünen daire işleyin. arena alanı tanımlanır nerede ambar işaretleri görünüyor. "Arena Ayarları" altında ekranın üst kısmına yakın "Kalibrasyon Ölçeği" simgesine tıklayın. Arenada bir kenarından sol tıklayın. Tutun ve arena karşı ucuna üzerinde sürükleyin fare. sol tıklama serbest bırakın.
14. Enter "10.5" görünür "Kalibrasyon uzaklık" diyalog kutusunda "Gerçek dünya mesafe" kutusuna. "Tamam" ı tıklayın. Gerekirse dairesel arenada tüm çapını kapsayan, böylece kalibrasyon hattını ayarlayın.
15. "Arena Ayarları (Deneme 1)" diyalog kutusunda "Validate Arena Ayarlar" seçeneğini tıklayın. ayarlar valide değilse herhangi bir sorunları gidermek. Ekranın sol ve menüden "Yeni" seçeneğini sağ "Deney Explorer" araç çubuğundan "Setup" seçeneği altında "Arena Ayarlar" ı tıklatın.
16. arena h ayarları kadar tekrarlayın 4.11-4.15 adımlarıHer deneme için yaratılmış ave. Her deneme için uygun video dosyasını seçtiğinizden emin olun. Ekranın sol "Deney Explorer" araç çubuğundan "Setup" seçeneği altında "Algılama Ayarları" nı seçin.
17. ": Algılama Ayarları 1 Algılama Ayarları" diyaloğa "Konu Kimlik" başlığı altında her konu için farklı dolgu renklerini appears.Choose: "Algılama Ayarları 1 Algılama Ayarları" iletişim kutusunda açılır menüden "Yöntem" başlığı altında "Dinamik Çıkarma" seçiniz kutu.
18. "Select video" seçin ve "Video" altında "örnek oranı" kutusundan Deneme 1.Click "Aç" .Select "5,9941" için videonun yerini "Algılama Ayarları: Algılama Ayarları 1" iletişim kutusunda. ": Algılama Ayarları 1 Algılama Ayarları" iletişim kutusunda "Algılama" başlığı altında "Referans görüntü" seçeneği için "Ayarlar" ı tıklayın.
19. Click "Öğrenme (C) Başlangıç4; Referans görüntüsünü öğrenmek için program için "Referans Görüntüsü" diyalog box.Wait seçeneği. "Referans Görüntüsü" diyalog kutusunda görüntü hayvanlar olmadan göründüğünde, tıklayın diyalog kutusu içindeki "Toplama ayarları" altında "dinamik referans görüntü kullanın".
20. "Kapat" düğmesini tıklatın. ": Algılama Ayarları 1 Algılama Ayarları" diyalog kutusu için açılır menüden "Koyu" seç "Algılama" başlığı altında "Konu" dedi. Algılama Ayarları 1 "diyalog kutusu:" Algılama "" Algılama Ayarları altında "Karanlık kontrast" için "33" için daha az sayıda ve daha büyük bir sayı için "153" olarak ayarlayın.
21. ": Algılama Ayarları 1 Algılama Ayarları" diyalog kutusunun sağ alt köşesindeki "Değişiklikleri Kaydet" i tıklayın. "Oynatma Kontrol" diyalog kutusunda play butonuna tıklayın ve gölgeler ya da enkaz aksine bu yazılımı başarıyla hayvanları izliyor onaylayın. "Karanlık kontralara için numaraları ayarlayınt "gerekmez.
22. ": Algılama Ayarları 1 Algılama Ayarları" iletişim kutusunda izleme uygun olduğunda, sağ alt tarafındaki "Değişiklikleri Kaydet" i tıklayın. Ekranın sol "Deney Explorer" araç çubuğundan "Setup" seçeneği altında "Toplama" seçiniz.
23. "Toplama Ayarlar" diyalog kutusunda "Parça sonraki planlı deneme" tıklayın. Doğru deneme, görüntü ve arena ayarı "Acquisition Ayarlar" diyalog kutusunda "Ayarlar" altında görüntülenir onaylayın.
24. "Toplama Kontrol" diyalog kutusunda "Algılama hızını belirler" seçeneğini işaretleyin. satın alma işlemine başlamak için bir beyaz kare içine yeşil daire ile düğmesine tıklayın. Tüm denemeler takip edilene kadar tekrarlayın 4,22-4,23 adımları.
25. screen.Choose "Time" solda o "yuvalama" altında "Deney Explorer" araç çubuğundan "Analiz" seçeneği altında "Veri Profiller" tıklayın"Bileşenler" Araç çubuğundaki ption. "Zaman" diyalog kutusunda başlığı "Parçanın seçilmesi zaman aralığında" altında "Kime" için "00:02:00" ayarlayın. "Tamam" ı tıklayın.
26. Ekranın sağ tarafındaki "Veri Profilleri" alanında "Başlat" kutusuna ve "Sonucu 1" kutusu arasındaki "Nest" kutusunu sürükleyin. Ekranın sol "Deney Explorer" araç çubuğundan "Analiz" seçeneği altında "Analiz Profili" tıklayın. Görüntülenen "Bağımlı Değişkenler" araç çubuğundaki başlığı "Mesafe ve Zaman" altında "Hız" tıklayın.
27. Click "Velocity" diyalog kutusunda "Ekle". Click "Bağımlı Değişkenler" araç çubuğundaki başlığı "Mesafe ve Zaman" altında "uzaklık taşındı". "Mesafe taşındı" diyalog kutusunda "Ekle" düğmesini tıklayın. "Bireysel Davranış", "Bağımlı Değişkenler" başlığı t altında "Hareketi" tıklayınoolbar.
28. "Hareket" diyalog kutusunda başlığı "Aykırı filtre" altında "Averaging aralığını" için "1" yapın. "Hareket" diyalog kutusunda başlığı "Eşik" altında "2.00" ve "Dur hızı" "hız Başlat" "1,75" ayarlayın.
29. "Hareketli" ve "Hareket" diyalog kutusunda başlığı "için hesaplayın istatistik" altında "hareket değil" için her iki kutuları işaretleyin. Click "Hareket" diyalog kutusunun altındaki "Ekle". Ekranın sol "Deney Explorer" araç çubuğundaki "Sonuçlar" seçeneği altında "Analiz Output" tıklayın. Ekranın üst kısmındaki "Hesapla" tıklayın.
30. bağımlı değişkenler hesaplanır sonra, ekranın üst kısmında "Export" düğmesine tıklayın. "İhracat Analizi Çıktı" diyalog kutusunda hedef klasörü seçin. "İhracat Analizi Outpu" Dosya türü "açılır menüsünden" Excel "i seçint "Tamam" diyalog kutusu. Click ".
31. Ekranın üst kısmındaki "Dosya" sekmesi altında "Kaydet Experiment" tıklayın. Dijital izleme yazılımı kapatın. Bir tablo dosyasına veri almak ve ticari istatistiksel analiz yazılım paketi kullanarak analiz eder.

Sonuçlar

El ile işleme görsel gözlemsel veriler 2 gün sonrası ambar (DPH) mersin (Şekil 2) ile başlatılan maruz kalma sadece 72 saat sonra artan bakır konsantrasyonu artmış yüzde anormallik saptandı. video örnekleri mersin balığı yüzme davranışları üzerindeki bakır maruz aşırı etkisi (Video 2) belgelenen ve bunun sonucunda davranış bozukluğu tanımlanmasında destekli. Bir başka örnekte, 30 DPH de mersin mortalite ancak göre 40.3 ug / L arasında 96 saat ortalama letal etki konsantrasyonu (LC50) bakır maruz duyarlı olduğunu kanıtladı. Ancak, denge ve immobilizasyon kaybı sublethal davranış uç noktaları mortalite ile birlikte dahil edildiğinde 2.4 ile 5.0 ug / L arasında değişen tahmini 96 saat medyan etki konsantrasyonu (EC50) ile duyarlılık artar. Kaydedilen davranışsal anormallikler Video belgeleri bu öldürücü etkileri yakalanır ve daha doğrulanmış insan gözlemlermaruz kalma sırasında. yüzme aktivitesini analiz ederken dijital izleme yazılımı kullanımı önemli ölçüde sonrası işlem süresi azalır. Balık yüzme hızı, zaman hareketli geçirdi ve mesafe tüm önemli ölçüde artan bakır konsantrasyonu ile (Şekil 3) azalmıştır seyahat. Yüzme yolları da artan bakır konsantrasyonu (Şekil 4) ile indirgendi.

Şekil 1:.. Test stok solüsyonu konsantrasyonu hedef konsantrasyonuna dayalı bir tablo şablonunu kullanarak tespit edildi dilütör toksisite testleri için kimyasal stok hazırlama belirlemek için kullanılan bir tablo şablonunun Bilgisayar ekran bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Diluter kurulumu ve deneysel tasarım beyaz mersin çeşitli yaşam evreleri bakır maruz bırakıldı. pozlama için kullanılan eriyik boyutu balık büyüklüğüne göre seçildi. (A) Erken yaşam evresi mersin balığı büyük dilütör kurulumu kullanarak maruz bırakıldı, küçük bir dilütör kurulum ve (b) eski yaşam evresi mersin balığı kullanılarak maruz bırakıldı.

Şekil 3: (30 gün sonrası ambar [DPH] balık ile başlayan) bir erken yaşam evresi beyaz mersin (Acipenser transmontanus) 72 saat bakır maruz itibaren yüzme davranış sonuçları. Beyaz mersin DPH 30 arasında hareket Yüzme aktivitesi bitiş noktaları (a) süresi; (B) yüzme hızı; ve (c

Şekil 4:. Erken yaşam evresi beyaz mersin (Acipenser transmontanus) 96 saat bakır maruz sonuçları bir 72 saat sonra denge ve immobilizasyon kaybı sergileyen 2 DPH beyaz mersinbalığı Yaşayan (2 gün sonrası ambar [DPH] balık ile başlayan) bakır konsantrasyonu artan 96 saat maruz kalma. Asterisk kontrolünden anlamlı bir farkı belirtir, Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler.

Şekil 5: Erken yaşam evresi beyaz mersin Örnek yüzme yol sonuçları (Acipenser Transmontanus) 96 saat bakır poz (30 gün sonrası ambar [DPH] balık) ile bakıyordu. mersin Yüzme yolları (n = 5 balık) ve (b) yüksek tedaviden (50 (a) kontrol tekrarında dijital izleme yazılımı kullanılarak sayısallaştırılmış 96 saat maruz bırakıldıktan sonra ug / L), tekrarlanan (n = 3 balık). Bazı balık inaktif çünkü odasında balık mevcut sayısını temsil etmiyor yüzme yolları sayısını not edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ölçülebilir Parametre	gözlemsel Parametreler
hız	Uyuşukluk / Hiperaktivite
Mesafe taşındı	Denge kaybı
zaman süresi alanında geçen	Spazmlar / titreme / başaşağı
Seçilen bölgeler arasındaki kere organizma hareket Zone geçiş sayısı	su sütununda pozisyonu
başlığı ilgi noktasına doğru hayvanın yolunun sapmasını noktası hesaplar	Solunum (hızlı / yavaş)
Başlık seçilen vücut noktasının başlığını hesaplar	renklendirme
İki örnek arasındaki kısımdaki açı farkını açmak	gizleme
Açısal hız hesaplanan örnek aralığına göre dönüş açısını bölerek
taşındı mesafeye göre dönüş açısını bölerek Menderes hesaplanır. farklı hızlarda hareket eden hayvanlarda dönüm karşılaştırmak için kullanılır
Zaman hareketli geçirdi
Hareketlilik bile yüzde ise, tam alan hayvan değişiyor olarak algılanan süreyi devlet hesaplarer noktası aynı kalır
Seçilen vücut noktası 360 ° kümülatif dönüş açısına sahip olduğunda rotasyon-bir dönüş tamamlanır. göz ardı edilir eşikten az zıt yönde döner.
Hareketlilik merkez noktası aynı kalsa bile, tespit edilen hayvanın tam alan için hareketlilik yüzdesini sürekli hesaplar.
arasındaki mesafe tüm aktörlerin ve seçilen alıcıları arasındaki mesafeyi konular hesaplar
aktör veya alıcı yakınlık değildir süreyi Yakınlık-hesaplar
Nispi hareket
aralarındaki mesafeye göre ağırlıklı net ağırlıklı hareket-(pozitif) için aktör hareketi ve gelen (negatif) alıcı,
Ağırlıklı hareket dan-MOVEME aralarındaki mesafeye göre ağırlıklı alıcıdan aktör, bir nt.
aralarındaki mesafeye göre ağırlıklı alıcıya aktör hareketi to Ağırlıklı hareket,
İki Deneme Kontrol elemanlarının olaylar, ya da bir eleman içinde arasındaki Deneme kontrolü devlet dönemi
Bir elemanın içinde bir olay Deneme Kontrol tanımlanan aldığınız Deneme kontrol olay anı oluşur.

Tablo 1:. Dijital izleme yazılımı aracılığıyla sayısal Davranış uç noktaları Bu bitiş noktaları bireyler veya gruplar üzerinde kullanılan ve aynı zamanda pozlama sırasında davranışsal bozukluk görsel gözlem kontroller için bir liste olarak hizmet edilebilir.

"/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi> Video ^1:. Etkilenen beyaz mersin tarafından sergilenen anormal davranış Görsel tanımı günlük gözlem kontrol listesi anormallikleri belgelemek için kullanılan (Sağ indirmek için tıklayın). denge ve immobilizasyon kaybı maruz. Calfee ark Modifiye gözlenen en yaygın anormallikler vardı. ⁷

Video 2: Beyaz mersin balığı yüzme davranış örneği vurgulayarak Görsel belgeler. (Sağ indirmek için tıklayın) Beyaz mersin balığı yüzme etkinliği büyük ölçüde artan bakır konsantrasyonuna maruz kalma ile indirgendi. Bu video tasvir mersin Bir kontrol olarak, orta düşük, ve 96 saat sulu bir bakır sonunda yüksek bir tedavi olduğumaruz kalma. Beyaz mersin balığı hala hayatta olmasına rağmen balık büyük kontrollerle karşılaştırıldığında tedavilerde engelli edildi belirgindir. Calfee ve ark Modifiye. ⁷

Tartışma

nedeniyle kirletici maruz kalma davranış değişiklikleri genellikle alt öldürücü toksisite için bir son nokta olarak kullanılır, ancak ölçmek zor olabilir. Genellikle, davranış yanıtları işlemek için çok fazla zaman gerektiren görsel gözlem ve manuel veri analizi ile ölçülmektedir. Ancak ilerleyen teknolojiyle birlikte, ölçülmesi yüzme faaliyeti için yöntemler işleme ve analiz süresini kısaltır videography ¹⁸ ve hareket analizi veya dijital izleme yazılımını kullanarak odaklanmıştır. Videonun analizi sırasında yani mersin balığı yüzme davranışlarını analiz için daha etkin ve verimli bir şekilde sağlanan video veri kayıtları ve balık izleme yazılımı kullanımını alıcı elle çok zaman olurdu yüzme değişkenler miktarının, verileri ele geçirdi. Prosedür böyle basit değişiklikler gerektirecektir Kurbağa ve sucul omurgasızlar gibi diğer canlılar için özelleştirme, bir balığın davranışlarını yüzme vurgulanan rağmen. Ne davranışsal endpoin bağlıts deneysel tasarım ve kamera sistemleri hemen hemen her piyasada mevcut izleme yazılım paketi ile kullanılmak üzere geliştirilmiş olabilir, ele alınmaktadır.

yöntem çözünmüş bakır kullanılarak ortaya, ama diğer sulu kirletici veya sıcaklık veya oksijen içeriği gibi özelliklere uygulanabilir olduğu. Bu yazıda geliştirilen ve sunulan protokoller kayıt cihazı gibi basit bir dijital video kamera kullandı. Dijital dosyaları kolayca bir bilgisayara aktarılır ve hareket analiz yazılımı olarak yüklenir. yöntemler sürekli değiştirilmiş ve miktar süreci hızlandırmaya yönelik rafine ediliyor. Video kalitesi izleme için her balık tanımlamak için analiz yazılımı için sırayla yüksek çözünürlükle olması zorunludur. veri dosyalarını işlemek için çalışırken balık ile kontrast olmayan herhangi bir arka plan sorunlara neden olur. İki boyutlu bir video izleme ile diğer ortak sorunu tanımlayan bireyler olduğunuyüzme yolları geçerken. Bu yol geçişi sırasında her balık belirlenmesi ve yazılım içindeki yol parçalarını birbirine bağlayan el düzeltilebilir. Seçenek olarak ise, toplam etkinlik, bir grup ortalaması olarak, her çoğaltma bölmesinden belirlenebilir. bir balık içeren her biri ile birkaç ayrı odaları tek tek balık hareketlerini hesaplamak için aynı görüş alanında filme olabilir.

Şu anda biz yüksek çözünürlüklü dijital video kayıt cihazı (HD-DVR) bağlı kalma odaları üzerinde havai güvenlik kameraları bir dizi kullanarak yükselttiniz. Ancak, yüksek tanımlı MPEG-4 video kaydedebilirsiniz herhangi bir kamera sisteminin kullanımı çalışacaktır. HD-DVR belirli bir zamanda kayıt ayarlanır ve 7 güne kadar programlanabilir. yaklaşım otomatik Bu hands-off balık davranışları tehlikeye atabilecek dış bozuklukları en aza indirerek tutarlılığı korumak için aynı anda birkaç video yakalama sağlar. HD-DVR sistems bir iç ağa bağlı, dosyaların aktarılması oldukça basittir. Otomatik kamera sistemi yüzme davranışını ölçülmesi için bir çok gelişmiş teknik olmasına rağmen, yine de toksisite testleri sırasında davranışsal bozukluk belgelenmesi için ek destek bilgileri sunmak için görsel incelemelerde bulunmak amacıyla faydalıdır.

1960'ların başında ^19,20,21 kadar uzanan metallere maruz kalma sonucu literatür belgeleyen değişmiş balık davranışlarının uzun bir geçmişi vardır. Bakır gibi Bluegill ²² hipoaktivite olarak aktivite düzeyleri değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir (Lepomis macrochirus rafinesque) ve lokomotor değişiklikler ve alabalığı ²³ beslenme aktivitesi (Salvelinus fontinalis). En azından bazı yavru balık algılamak ve predatör önlemek ve bakır kaynaklı kimyasal-duyusal yoksunluk tespit alarm kimyasallar ^24,25,26 ilgili davranışları etkileyebilir için koku alma duygusu güveniyor . Koku epiteli nedeniyle böylece oryantasyon bozukluğu, davranış kaçınma, azaltılmış beslenme ve olfaction ²⁷ tarafından yönlendirilir başka davranışlar neden olabilir duyusal mekanizmaların etkileyen bakır maruz kalma hasar görmüştür. Bunlar değişmiş davranışlar poz sırasında gözlemlenen ne ile uyumlu idi.

beyaz mersin yüzme davranışı büyük ölçüde Bu sonuçlar davranış bakır öldürücü olmayan konsantrasyonlarında etkilenir ve toksik stresin bir göstergesi olarak nasıl kullanılabileceğini göstermek .. sulu bakır konsantrasyonlarına öldürücü pozlama sırasında etkilendi. Video tabanlı analiz yüzme davranışı miktarının etkili olduğunu kanıtladı ve aynı zamanda bakır maruz mersin balığı üzerinde ciddi etkileri kalitatif görsel belgeler olarak görev yaptı. analiz yazılımı da diğer çeşitli davranışsal uç noktaları miktarının yeteneğine sahiptir. Listesi için Tablo 1'e bakınız. poz sistemi her bir son nokta için değiştirilebilirGerçek zamanlı mod ve endişe, çeşitli kirletici maddelere maruz kalma ile bağlantılı davranış farklılıkları ölçmek için kullanılabilir.

Sudaki toksikolojik araştırmalarda davranış uç noktaları kullanımı giderek istihdam ve adaptif davranış fonksiyon çevre yaralanma ⁹ belirlenmesinde çok önemlidir, çünkü kirleticilerin etkilerini değerlendirirken dikkate alınmalıdır. Balık davranışına çevresel kirletici etkileri genellikle sübjektif ve standart yöntemlerle yokluğunda öldürücü olmayan bitiş noktaları ile uğraşırken özellikle zorlu olduğunu ..

titizlikle izlenebilir bu yöntemleri kullanarak sayısal olarak yüzme etkinliği, organizmaya az stres ile tahribatsız ve tekrarlanabilir. Davranışı Yüzme standart toksisite testlerinin ⁵ hassasiyetini genişletmek için deney protokolleri dahil edilmelidir öldürücü toksisite geçerli ve tutarlı endeksidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
bakır II sülfat pentahidrat	Sigma-Aldrich		kirletici endişe
şırınga dağıtıcısı	Hamilton MicroLab 600 Serisi		kimyasalı çivilemek için aparat
Stok çözeltisini tutmak için	2 L hacimsel şişe
24-1.5 L cam kavanoz			test odası 2 dph mersin balığı
video kamera	Sony Handycam HDR-CX550V
dijital izleme yazılımı	Noldus Ethovision
3-17" düz ekran monitörler
24 gözetleme kameraları	Model CL101
3-16 kanallı dijital kayıt cihazları
DO metre	YSI
pH metre	Orion 940
ph probu	Orion
amonyak metre
amonyak probu	Orion
soğutucu ünitesi
devridaim su pompası