Yöntem makalesi

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

DOI:

10.3791/53478

⸱

20 Ocak 2016

 , 
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Bu protokol, belirli bir genomik bölge ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması için tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyonu (enChIP) gerçekleştirme prosedürlerini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Belirli bir genomik ilgi alanıyla etkileşime giren moleküllerin önyargısız bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için, yakın zamanda tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyon (enChIP) tekniğini geliştirdik. Burada, belirli genomik bölgeleri izole etmek ve ilişkili proteinleri ve RNA'ları tanımlamak için enChIP'nin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. İlk olarak, bir genomik ilgi bölgesi, bir transkripsiyon aktivatörü benzeri (TAL) protein veya katalitik olarak aktif olmayan bir Cas9 formu ve bir kılavuz RNA'dan oluşan kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) kompleksi ile etiketlenir. Daha sonra, kromatin çapraz bağlanır ve sonikasyon ile parçalanır. Etiketli lokus daha sonra immünopresipite edilir ve çapraz bağlama tersine çevrilir. Son olarak, izole edilen kromatin ile ilişkili proteinler veya RNA'lar, sırasıyla kütle spektrometrik veya RNA dizileme analizlerine tabi tutulur. Bu yaklaşım, genomik bir ilgi bölgesi ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların başarılı bir şekilde tanımlanmasına izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özel ilgi genomik bölgeleri ile ilişkili moleküllerin belirlenmesi gibi transkripsiyon ve epigenetik düzenleme gibi genomik fonksiyonların düzenlenmesinde mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler özel genomik bölgelere 1-7 biyokimyasal analizi için geliştirilmiş olmasına rağmen, bunlar, çünkü bu tür sınırlı bir uygulama (örneğin, sadece tekrarlar yüksek kopya sayısı lokusları veya lokus için) ve bunların iç sorunlar bu aşamada yaygın olarak kullanılmamaktadır çok fazla zaman ve çaba gerektiriyordu.

Kolayca belirli genomik bölgelerin biyokimyasal analizini gerçekleştirmek amacıyla, biz 14-17 iki lokus spesifik kromatin immunoprecipitation (ChIP) teknolojileri, yani sokma ChIP (iChip) 8-13 ve mühendislik DNA bağlayıcı molekül aracılı ChIP (enChIP) geliştirdik . IChip olarak, ilgi konusu bir lokus gibi Lex gibi dışsal bir DNA-bağlama proteini sokulması tanıma sekansları tarafından etiketlenmişA. lokusu sonra etiketli bir DNA-bağlama proteini kullanılarak afinite saflaştırma ile izole edilmektedir. EnChIP olarak, örneğin çinko parmak proteinleri, transkripsiyon aktivatörü gibi (TAL) protein gibi DNA-bağlama molekülleri, yapay ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa palindromik tekrarları (CRISPR) kompleksleri, (Şekil 1) ilgi konusu bir lokusu etiketlemek için kullanılır. Daha sonra, genomik bölge ile işaretlenmiş DNA-bağlama moleküllerinin afinite saflaştırma ile izole edilmektedir.

IChip fazla enChIP avantajlarından biri bir ekzojen DNA-bağlama proteini tanıma sekansları sokulması gerekli değildir olmasıdır. Cas9 (dCas9) içindeki bir katalitik aktif olmayan biçimini kapsayan CRISPR kompleksleri ve bir kılavuz RNA (gRNA) ile lokusların Hedefleme TAL ve çinko-parmak proteinleri kullanılarak iChip veya enChIP bu bölgelerin hedeflemeyi çok daha kolaydır. Burada, kütle spektrometrisi ve RNA dizi analizi ile kombine enChIP için adım adım protokol açıklar (RNA-Seq) lokusa Associa tespit etmekted proteinleri ve RNA'lar sırasıyla.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedef lokusun tanıma Engineered DNA-bağlama Moleküllerin 1. Tasarım

  1. CRISPR kompleksleri kullanılarak enChIP için, daha önce, 18 olarak tanımlanan ilgili genomik bölgenin aday gRNA hedef sekanslarını tespit etmek CRISPRdirect web aracı (http://crispr.dbcls.jp) kullanın. Bu web aracı formunun 23 bp genomik siteleri döndürür 5'-N 20 NGG-3 'hedef bölge içinde.
  2. U6 promotör sekansı ve 5'-N 20 sekansına ticari hizmetlerin kullanılarak 5'-N 20 NGG-3 'içeren bir gBlock sentezlenmesi 19,20 (bakınız Şekil 2). Amaçlara alt klonlama için gBlock dışındaki uygun kısıtlayıcı enzim sitelerinin içerir.
  3. Daha önce tarif edildiği gibi 16, uygun bir vektör içine gBlock yerleştirin. GBlocks için çeşitli retroviral vektörler (Malzeme) mevcuttur.
  4. TAL proteinler kullanılarak enChIP için Targ tanıyan TAL proteinleri tasarımet loci. Ticari hizmetlerini kullanarak TAL proteinleri kodlayan plazmid oluşturun. Daha önce tarif edildiği gibi 15 3 x FLAG bir veya daha fazla etiketleri ile kaynaşık TAL proteinleri ihtiva eden ifade vektörlerini oluşturmak.

EnChIP Analizi Hücre 2. kurulması

  1. 3 x FLAG-dCas9 ve gRNA (CRISPR bazlı prosedür) ya da Express 3, daha önce tarif edildiği gibi 14-17 x FLAG-TAL hücrelerinde (TAL protein bazlı prosedür) analiz edilecek.
    1. Transfeksiyon verimi yüksek ise geçici transfeksiyon kullanın. 3 x FLAG-dCas9 CMV promotörü ihtiva eden bir ekspresyon vektörü (Malzeme) mevcuttur.
    2. Geçici transfeksiyon verimliliği düşükse geleneksel yöntemler kullanılarak stabil transformantların kurulması düşünün. GBlock için yukarıda belirtilen retroviral vektörler ek olarak, 3 x FLAG-dCas9 retroviral vektörler (Malzeme) mevcuttur.
  2. , Daha önce tarif edildiği 14-17 gibi bir anti-FLAG antikoru (Ab) kullanılarak bağışıklık beneklenme analizi ile transfekte edilmiş hücrelerde 3xFLAG-dCas9 ya 3xFLAG-TAL proteininin ifadesini teyit edin.
    Not: Bu etiketli proteinlerinin ekspresyonu, aynı zamanda, anti-FLAG-FITC ve daha sonraki bir FACS analizi ile hücre içi boyama ile teyit edilebilir. Hücre içi boyama için bir protokol bizim ana (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html) indirilebilir.
  3. Standart RT-PCR tekniği ile gRNA ifadesini onaylayın.
  4. Ilgili genomik bölge ile etkileşime giren proteinlerin kantitatif belirlenmesi için, hücre kültürü (SILAC) enChIP (enChIP-SILAC) ile birleştirildi analizinde amino asitlerle stabil bir izotop işaretleme kullanımını dikkate.
    Not: SILAC analizi için Media ticari satıcılardan temin edilebilir. SILAC belirli etkileşimleri tespit güçlüdür.
    1. SILAC ağır ortam kültür hücreleri. Hücreler Cultu hazırlayınBir negatif kontrol olarak SILAC ışığı ortamı olarak verilmiştir. (Ağır veya hafif) her SILAC ortamı için en az 5 x 10 7 hücreleri kullanın. Etkili bir etiketleme için, her iki L-Lizin-2HCI, 13 ° C 6 ve L-Arginin-HCl, SILAC Ağır ortam içinde 13 ° C 6, 15 N 4 ekleyin. Not: en az beş hücre bölünmesi etiket protein için gereklidir.
      1. Örneğin, kararlı bir şekilde Lizin-2HCI artı L-Arginin-HCl (Işık ortamı) SILAC için DMEM ortam ve diyalize edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu, 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde 3xFLAG-dCas9 ve gRNA ifade kültürün insan fibrosarkoma HT1080 hücreleri ya da 13C 6 L-Lizin-2HCI artı 13 Cı 6 15 N 4 L-Arginin-HCl (Ağır ortam) 16 (Malzeme). Ortamın 500 ml hafif ya da ağır bir L-Lizin-2HCI ve L-Arginin-HCl, 50 mg ekleyin.
      2. Hücreler üslü growt muhafaza böylece tripsinize ve replate hücreler konfluent hale gelmeden önceh.

Formaldehit ile Hücreler 3. çapraz bağlanması

  1. Süspansiyon kültüründe hücreler, transfer 2 x 10 7 3xFLAG-TAL proteinler veya 3xFLAG-dCas9 artı gRNA eksprese eden hücreler ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde düzenli bir kültür ortamında 30 ml asılır. Daha fazla hücre kullanıldığında, orantılı reaktif hacimleri ve miktarlarını artırmak. SILAC deneyleri için, ağır ortam veya hafif ortamında (5 x 10 7 hücreleri her) kültüre hücrelerin karışımı ve 2 x 10 7 hücre ihtiva eden 5 tüp içine 1 x 10 8 hücre bölün.
  2. Hücre süspansiyonu (nihai konsantrasyon% 1) 30 ml% 37 formaldehit 810 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Yapışık hücreler için, doğrudan kültür ortamında 30 ml% 37 formaldehit 810 ul ekleyerek kültür kapları içinde hücrelerin tespit.
  3. 1,25 M glisin çözeltisi (nihai konsantrasyon 127 mM) 3.1 ml ekleyerek çapraz bağlanmasını durdurmak ve10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  4. Santrifüj (4 ° C 'de 5 dakika süre ile 300 x g) hücreleri toplamak. Dikkatle süpernatant dahil formaldehit atmak ve uygun bir atık şişe içinde saklayın.
    1. Yapışık hücreler, bir 50 ml tüp içinde, bir hücre kazıyıcı ile hasat hücreleri ayırmak ve bu aşamada tarif edildiği gibi hücreleri toplamak.
    2. SILAC deneyleri için, ağır, orta veya hafif orta (5 x 10 7 hücre her) kültüre müstakil hücrelerin karışımı 2 x 10 7 hücre içeren 5 tüpler içine 1 x 10 8 hücrelerinin toplam bölmek ve bu tarif edilen hücreleri toplamak adım.
  5. Tüp başına iki kez PBS ile 30 ml hücre pelletini yıkayın. Dikkatle formaldehit içeren süpernatant atın ve kimyasal güvenlik yönergelerine göre formaldehit atık bottle.Handle uygun bir atık saklayın. Sabitlenen hücreler dondurulmuş ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir.

Kromatin 4. Hazırlama (başına 2 x 107 hücreleri)

  1. Hücre lisis tamponu, 10 ml (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA,% 0.5 IGEPAL CA-630 ve 1 x proteaz inhibitörleri) sabit süspanse edilir ve 10 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın.
  2. Santrifüj örneği (8 dakika boyunca 4 ° C'de 830 x g) ve dikkatli bir supernatant atın.
  3. Nükleer lizis tamponu 10 ml pelet Askıya (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl,% 1 Triton X-100,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.5 loroilsarkosin ve 1x proteaz inhibitörleri). 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe ve her 2-3 dakikada bir vorteks.
  4. (830 × numuneyi santrifüj 8 dakika boyunca 4 ° C'de g) ve dikkatli bir şekilde supernatant atın.
  5. 10 ml PBS pelet yıkayın. Pelet (kromatin fraksiyonu) sıvı azot içinde hızlı soğutma, -80 ° C'de saklanabilir.

Kromatin 5. Sonication (2 x 10 7 hücre başına)

  1. 800 ul kromatin fraksiyonu Askıyadeğiştirilmiş lisis tamponu 3 (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 0.1 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS ve 1x proteaz inhibitörleri) ve 1,5 ml tüp içine aktarılır.
  2. Çıktı: (Malzeme) bir sonikatör kullanılarak kromatine ve aşağıdaki koşulları ses dalgalarına maruz 3; görev:% 100 (sürekli); ve saati: ücretsiz. 10 saniye boyunca, sonikasyon 10-18 döngü gerçekleştirmek ve 20 saniye süreyle buz üzerinde soğutuldu. Aşırı ısınmayı önlemek 2 dakika her 5-6 devir için buz üzerinde örnekleri inkübe. Köpük önlemek için, 0.5 cm tüpün tabanından sonikasyon probunun ucu konumunu tutun.
  3. Santrifüj örneği (10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g) ve 1,5 ml tüp içine süpernatant aktarın. Sonike kromatin sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma işleminin -80 ° C'de saklanabilir.

Kromatin Parçalanma 6. Değerlendirilmesi

  1. Distile su 85 ul parçalanmış kromatin 10 ul karıştırın.
  2. 4 ul ekleve 5 M NaCI, 65 ° CO / N inkübe edin.
  3. 10 mg / ml RNase A 1 ul ilave edin ve 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 M Tris (pH 6.8) 4 ul, 20 mg 1 ul / ml proteinaz K 2 ul ekleyin ve daha sonra 1,5 saat süre ile 45 ° C'de inkübe edin.
  5. Örneğin SYBR Green I boyama boyalar içermeyen bir% 1 agaroz jeli içinde elektroforez ile numunenin ayrı ayrı 10 ul.
  6. Parçalanmış kromatin uzunlukları dağılımını değerlendirmek için jel leke. 0.5-2 kbp (0,2-4 kbp'lik aralığı) ortalama uzunluğu üreten şartlar tavsiye edilir.
  7. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ile veya bir DNA çıkarma kiti (Malzeme) kullanarak, kalan örneklerinin DNA saflaştınlır. Saflaştırılmış DNA enChIP analiz verimlerini (8.11) tahmin etmek için, giriş DNA olarak kullanılabilir.

Antikorlar ile Dynabeads Konjuge 7. Hazırlama (2 x 10 7 hücre başına)

  1. Önİki 1,5 ml tüpler, normal fare IgG kullanılarak ön-temizleme için ve bir anti-FLAG Ab ile inkübasyon diğer pare. Her bir tüp, Protein G-konjuge manyetik boncuk 150 ul (Malzemeler bakınız) ekleyin.
  2. Bir mıknatıs standına tüpler koyun ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın.
  3. PBS% 0.01 Tween-20 (PBS-T) içeren 1 ml boncuk süspanse edin. Manyetik bir stand üzerinde tüpler koyun ve 2 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın ve sonra adımı tekrarlayın.
  4. % 0.1 BSA içeren PBS-T 1 ml boncuk süspanse edin.
  5. Normal fare IgG veya anti-FLAG Ab 15 ug ekleyin ve 4 ° CO / N dönmektedir.
  6. Daha sonra, kısa bir süre aşağı Spin bir mıknatıs standına tüpler koyun ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın.
  7. PBS-T 1 ml boncuk süspanse edin. Örnek birkaç kez ters çevirin ve kısaca aşağı doğru döndürün. Daha sonra pipetleme süpernatant atın, bir mıknatıs standında tüpler koyun ve 3 dakika bekleyin. Yıkama tekrarlayınPBS-T (üç yıkama adımları toplamı) ile iki kez daha.

8. Kromatin immünopresipitasyonu (2 x 10 7 hücre başına)

  1. Hacminin beşte biri% 5 Triton X-100 (% 1 Triton X-100 nihai konsantrasyon) ihtiva eden tadil edilmiş liziz tamponu 3 (yaklaşık 200 ul) ile 5.3 hazırlanan parçalanmış kromatin) (yaklaşık 800 ul) karıştırın.
  2. Normal fare IgG'si ile konjüge edilmiş Protein G-konjuge manyetik boncukları hazırlandı edildiği tüp kromatin solüsyonu ekleyin. 1 saat süre ile 4 ° C 'de döndürün.
  3. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin.
  4. Anti-FLAG Ab konjüge edilmiş Protein G-konjüge edilmiş manyetik boncukları hazırlandı edildiği tüp içine süpernatant aktarın. 4 ° CO / N at döndürün.
  5. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme süpernatant atın.
  6. Düşük tuzlu tampon (20 mM Tris (pH 8.0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% Tri 1 ml boncuk Askıyatonluk X-100,% 0.1 SDS ve 1x proteaz inhibitörleri) ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de döner. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Pipetleme Süpernatantı atın ve yıkama adımı tekrarlayın.
  7. Iki kez yüksek tuzlu tampon (20 mM Tris (pH 8.0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCI,% 1 Triton X-100,% 0.1 SDS ve 1x proteaz inhibitörleri) ile boncuk yıkayın.
  8. Iki kez LiCI tampon maddesi (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCI,% 0.5 IGEPAL CA-630,% 0.5 sodyum deoksikolat ve 1 x proteaz inhibitörleri) ile boncuk yıkayın.
  9. Bir kez TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI,% 0.1 IGEPAL CA-630 ve 1 x proteaz inhibitörleri) ile boncuk yıkayın.
  10. Elüsyon tamponu 200 ul boncuk Askıya (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl,% 0.1 IGEPAL CA-630, 1 x proteaz inhibitörleri ve 500 ug / ml 3 x FLAG peptidi), ve 37 ° C'de inkübe edin 20 dakika. Bir mıknatıs stand üzerinde tüp yerleştirin ve 3 dakika bekleyin. Yeni 1.5 ml tüp içine süpernatant aktarın ve ELUT tekrariyon adım.
  11. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ile veya bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak sıyırma sıvısının DNA küçük bir kısmı (örn, 5%) saflaştınlır (Malzeme). Saflaştırılmış DNA spesifik primer enChIP daha önce tarif edildiği gibi 14,16 Aşama 6.7'de hazırlanan giriş DNA ile karşılaştırarak analiz verimlerini tahmin etmek için ayarlar, PCR için kullanılabilir.

9. SDS-PAGE, Boyama ve Kütle Spektrometrik Analizi

  1. 1 2-propanol ml 3M sodyum asetat (pH 5.2), 50 ul ve 20 mg / ml glikojen 5 ul eluat (400 ul) karıştırın. -20 ° CO / N de kromatin çöktürün.
  2. Santrifüj örneği (30 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g) ve süpernatan atılır. (10 dakika boyunca 4 ° C'de 16.000 x g),% 70 etanol ve santrifüj yeniden 1 ml pelet durulayın. Pipetle tamamen süpernatant atın.
  3. 2x numune tamponu (125 mM Tris (pH 6.8),% 10 2-merc 40 ul pelet Askıdaaptoethanol,% 4 SDS,% 10 sakroz ve% 0.004 bromofenol mavisi). 5 dakika vorteksleyin, tamamen pelet çözülür ve daha sonra proteinleri denatüre ve çapraz bağlantıyı ters döndürecek 30 dakika boyunca 100 ° C 'de inkübe etmek.
  4. Boya çok altında 1 cm ulaşana kadar SDS-PAGE için jel üzerinde numunenin 40 ul çalıştırın. Not: Genellikle% 4-20 gradyan jelleri, ancak diğer% jeller kullanılabilmektedir.
  5. Coomassie Brilliant Blue veya gümüş boyası ile jel Leke.
  6. Beş adet (2 mm yükseklik) içine jel kesti.
  7. Daha önce tarif edildiği gibi jel 13-16 sindirim ve kütle spektrometresi ile analiz gerçekleştirir.
  8. 5 x 10 7 hücreleri, her (1 x 10 8 hücrelerin toplam) ile SILAC deneyleri için, 2x numune tampon maddesi 40 ul, ilk beş borunun (o kadar büyütmek için gerekli değildir) pelet askıya.

RNA ve RNA-Seq Analizi 10. saflaştırılması

  1. EnChIP sonra RNA'yı saflaştırmak için RNaz inhibitörü 5 U / ml ilave (seTampon çözelti tüm e malzemeler), değiştirilmiş lisis tamponu 3 ve elüsyon tamponu dışında olan RNaz İnhibitörü 40 U / ml ekleyin.
  2. 5 M NaCI, 16 ul eluat (400 ul) karıştırın ve 2 saat süre ile 65 ° C'de inkübe edin.
  3. Örnek asit guanidinyum-fenol bazlı bir tepkime maddesi 1 ml (Malzemeler bakınız) ekleyin. Daha sonra 15 saniye vorteksleyin ve 5-15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 12.000 x g ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
  4. Yeni 1,5 ml tüp süpernatantı aktarın ve p-bromoanisol 5 ul ilave edin. Daha sonra 15 saniye vorteksleyin ve 3-5 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. 12.000 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Yeni 2 ml'lik bir tüp içine süpernatant (yaklaşık 1 mi) aktarın ve 2-propanol 1 ml. Tüp ters çevirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. (Malzeme) bir RNA saflaştırma kiti bir kolona karışımı yerleştirin. 12.000 × 1 dakika boyunca santrifüj sütun g RT.
  6. Yıkamabir RNA saflaştırma kiti RNA Yıkama Tamponu 400 ul (Malzeme) ile kolon.
  7. DNase I (1 U / ul), 10 x DNase I Reaksiyon Tamponu ve 8 ul, DNase / RNase içermeyen su 3 ul, ve RNA Yıkama Tamponu 64 ul içinde 5 ul DNaz I kokteyl 80 ul ekle (karışım sütun bir RNA arıtma kiti (Malzeme)). 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra numune 12.000 x g ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca santrifüj.
  8. Iki kez bir RNA saflaştırma kiti RNA Ön Yıkama Tamponu 400 ul (Malzeme) ile sütun yıkayın.
  9. DNase / RNase içermeyen su, 50 ul RNA Zehir. Elüt RNA, RNA sıralaması için kullanılabilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, bir hedef genomik bölgelerinden% 1-30. EnChIP kullanılarak arıtılmış, 3 enChIP verimlerini gösteren temsili verileri içermektedir Şekil edilebilir telomerlerin ve interferon (IFN), düzenleyici faktörü-1 (IRF-1) gen promotörü hedef analizleri. Tipik sonuçlar, Tablo 1, örnek olarak enChIP-SILAC, Tablo tarafından tanımlanan bir IFNy özgü bir şekilde IRF-1 promotör ile ilişkili proteinler 2 listeler ile kütle spektroskopisi enChIP tarafından tanımlanan telomer bağlayıcı proteinler (enChIP-MS) ve Tablo 3 enChIP-RNA-Sek tarafından belirlenen telomerlerin ilişkili RNA'lar.

figure-results-1
EnChIP 1. Genel Bakış Şekil. enChIP kullanılarak CRISPR (A, B) ve TAL (C, D, E Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
GBlock Şekil 2. Sıra. U6 organizatörü (siyah), G nükleotid before kılavuz dizisi (mavi), kılavuz dizisi (kırmızı) (gRNA boşluk), (yeşil) iskele dizisi ve (turuncu) terminatör dizisi gösterilir.

figure-results-3
Temsili enChIP analizleri 3. Bir Getirisi Şekil. Hedefe IRF-1 odağı ve hedef olmayan Sox2 lokus için (A) Yüzde girişi. Hedef telomer ve hedef olmayan γ-uydular için (B) Yüzde girişleri. Rakamlar uyarlanmış ve önceki yayınlardan 15,16 den modifiye edilmiştir.

Kategoriler Proteinler
Transkripsiyon DDX1, PARP1'i, CKAP4, Pescadillo homologu, PURβ,
aktive edilmiş RNA polimeraz II transkripsiyonel aktivatör p15,
BTF3, Myb bağlayıcıProtein 1A
Histon deasetilasyonu,
corepressor bileşenleri 		RBBP4, PA2G4, TBL3
Asetiltransferaz Protein arginin, N-metiltransferaz 1
DNA topoizomeraz DNA topoizomeraz 2α
Histonlar Histon H2A.Z histon H3.2

Tablo 1:. EnChIP-SILAC tarafından tanımlanan bir IFNy-spesifik bir şekilde insan IRF-1 promotör bölgesi ile ilişkili proteinlerin örnekleri tablo önceki yayın 16 adapte edilmiştir.

Kategoriler Proteinler
Memeli telomer-bağlayıcı proteinler PML, RPA, CDK1, PARP1'i, PCBP1
Telomer-biMayada nding proteinler
ya da diğer organizmalar 		IMP4
Ile etkileşim Proteinler telomer bağlayıcı
proteinleri [ilişkili telomer bağlayıcı protein] 		DNA polimeraz α (POLA1) [Cdc13p],
ARMC6 [TRF2] CTBP1 [FoxP2-POT1],
exportin-5 [TERT] GNL3L [TRF1],
exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Heterokromatindir için lokalize Proteinler BEND3
Proteinler epigenetik işaretleri düzenleyen KDM5C
Kimin mutasyonlar telomer fonksiyonunu etkileyen Proteinler DNA polimeraz α (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
Glutamat-sistein ligazı, glutaredoksin, SMRC1

Tablo 2:. EnChIP-MS yolu ile teşhis fare telomerlerin ilişkili proteinlerin örnekleri, Tablo adaptö olmuşturBir önceki yayın 15 den d.

Kategoriler RNA'lar
Telomeraz bileşenleri Terc, Rmrp
Telomer RNA'lar Terras
scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA Neat1

Tablo 3:. EnChIP-RNA-Seq tablo önceki yayın 17 den adapte edilmiştir tarafından belirlenen fare telomerlerin ile ilişkili RNA'lar örnekleri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, CRISPR sistemi ve TAL proteinleri gibi tasarlanmış DNA bağlayıcı moleküller kullanılarak spesifik genomik bölgelerin saflaştırılmasını ve bu genomik bölgelere bağlı proteinlerin ve RNA'ların tanımlanmasını açıklıyoruz. Tasarlanmış DNA bağlayıcı moleküllerin genoma bağlanması, nükleozom konumlandırması da dahil olmak üzere kromatin yapısını etkileyebilir ve CRISPR girişim deneylerinde21 açıklandığı gibi genomik fonksiyonları ortadan kaldırabilir. Bu potansiyel anormal etkilerden kaçınmak için, hedef genomik bölgeleri seçmek için özel yönergeler öneriyoruz. İlk olarak, RNA polimerazların ve transkripsiyon faktörlerinin işe alınmasının potansiyel inhibisyonunu ve ayrıca transkripsiyon başlangıç bölgesi etrafındaki nükleozom konumlandırmasının bozulmasını önlemek için, promotör bölgelerinin analizleri için hedef bölgeler, transkripsiyon başlangıç bölgesinin (5' için) yukarısında birkaç yüz baz çifti olmalıdır. Buna karşılık, güçlendiriciler ve susturucular gibi farklı sınırlara sahip genomik bölgeleri analiz ederken, bu bölgelerle doğrudan yan yana duran genomik bölgeler hedeflenebilir, çünkü tasarlanmış DNA bağlayıcı moleküllerin bağlanmasının işlevlerini etkileme olasılığı daha düşüktür. Ayrıca, farklı türler arasında korunan hedef bölgeleri kullanmaktan kaçınmak en iyisidir, çünkü önemli DNA bağlayıcı moleküller genellikle evrimsel olarak korunmuş bölgelere bağlanır ve bağlanmalarının inhibisyonu hedef genomik bölgelerin işlevlerini bozabilir. Bu bağlamda, enChIP analizleri için kullanılan yerleşik hücrelerde hedef genomik bölgenin işlevinin korunup korunmadığını her zaman kontrol etmek gerekir. Birden fazla gRNA kolayca test edilebildiğinden ve farklı hedef genomik bölgeleri tanıyan TAL veya çinko parmak proteinlerinin birden fazla versiyonunu oluşturmak sıkıcı ve pahalı olduğundan, CRISPR kullanan enChIP, diğer proteinleri kullanan enChIP'den daha avantajlıdır.

dCas9'un hedef dışı bölgelere bağlandığı, ancak bu sitelere afinitenin hedef sitelere göre daha zayıf olabileceği gösterilmiştir22-25. Bu hedef dışı bölgelere bağlı moleküllerin kontaminasyonunu yönetmenin birkaç yolu vardır. İlk olarak, birkaç, en az iki farklı gRNA'nın kullanılması tavsiye edilir. Farklı gRNA'lar kullanılarak enChIP'de yaygın olarak gözlemlenen moleküller gerçek pozitifler olacaktır. İkincisi, enChIP için farklı koşulların karşılaştırılması, spesifik olmayan moleküllerin ve hedef dışı bölgelere bağlı moleküllerin kontaminasyonunu iptal etmede etkili olacaktır. Bu karşılaştırma setlerinin örnekleri (i) stimülasyon (-) ve (+) veya (ii) T hücreleri ve B hücreleri gibi farklı hücre tipleri olabilir. Son olarak, hedef bölgelere spesifik bağlanmalarını doğrulamak için aday moleküllerin bağlanmasının kantitatif analizi yapılmalıdır. Negatif kontrol olarak sadece dCas9 eksprese eden hücrelerin hazırlanması, ancak gRNA'nın hazırlanmaması tercih edilir.

enChIP analizlerini kullanarak, belirli genomik bölgelerle etkileşime giren bir dizi bilinen ve yeni molekülü başarıyla tanımlayabildik (Tablo 1-3)14-17. Ancak bu teknik, bu bölgelerle etkileşime giren bilinen diğer bazı proteinleri tespit edemedi. Örneğin, STAT1'in IFNy stimülasyonu8 üzerine IRF-1 promotörü ile ilişkili olduğu bildirilmektedir, ancak enChIP-SILAC analizimiz STAT1'i bu genomik bölge16 ile etkileşime girmeye indüklenen bir protein olarak tespit etmemiştir. Ek olarak, telomerlerin enChIP-MS analizinde, telomerler26 ile etkileşime girdiği gösterilen TRF-1 ve TRF-215'ten oluşan sığınak proteinlerini tespit etmedik. Bu tutarsızlıkların birkaç olası nedeni vardır. İlk olarak, Stat1'in IRF-1 promotörüne bağlanmasının stokiyometrisi çok düşük olabilir. enChIP-SILAC dahil olmak üzere enChIP-MS'nin, hedef genomik bölgelerle daha bol miktarda ilişkili olan proteinleri tespit etmesi mantıklıdır; dolayısıyla bu proteinleri tespit etmek için daha fazla hücrenin analizi gerekli olabilir. MS cihazlarının hassasiyetlerindeki artışlar, düşük stokiyometrik bağlanmaya sahip proteinlerin verimli bir şekilde saptanmasına da katkıda bulunacaktır. İkincisi, muhtemelen Stat1 ve sığınaklar da dahil olmak üzere bazı proteinler, MS analizleri için zor hedefler olabilir. Üçüncüsü, telomer bağlayıcı proteinler15 analizimizde, telomerleri tanıyan 3×FLAG-TAL proteinleri (3×FN-Tel-TAL), sığınakların telomerlere bağlanmasını rekabetçi bir şekilde bloke etmiş olabilir.

enChIP kullanarak spesifik genomik bölgelere bağlanan transkripsiyon faktörlerini saptamanın göreceli zorluğunun aksine, enChIP analizlerini kullanarak histon modifikasyon enzimleri gibi epigenetik düzenleyicileri başarıyla tanımladık. Bu tekniğin başarısı, epigenetik düzenleyicilerin çok çeşitli genomik bölgelere bağlanmasından kaynaklanıyor olabilir; bu nedenle, MS için genomik bölge başına daha fazla protein mevcuttur. Epigenetik düzenleyiciler, kanser gibi inatçı hastalıklara karşı ilaçlar için giderek daha önemli hedefler olarak kabul edildiğinden, enChIP, epigenetik ilaç hedeflerinin belirlenmesi için yararlı bir araç olacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar enChIP (Patent adı: 'Endojen DNA dizilerini tanıyan DNA bağlayıcı molekülleri kullanarak spesifik genomik bölgeleri izole etme yöntemi'; Patent numarası: PCT/JP2013/74107). H.F., Addgene'nin Danışma Kurulu üyesidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Takeda Bilim Vakfı (TF) tarafından desteklenmiştir; Asahi Glass Vakfı; Uehara Memorial Foundation (HF); Kurata Memorial Hitachi Bilim ve Teknoloji Vakfı (TF ve HF); Grant-Aid Genç Bilginler (B) (# 25830131), Grant-Aid Bilimsel Araştırma (C) (# 15K06895) (TF) için; ve Hibe-Aid Yenilikçi Alanları 'Transkripsiyon Döngüsü' Bilimsel Araştırma (# 25118512 & # 15H01354), Grant-Aid Bilimsel Araştırma (B) (# 15H04329) için, Grant-Aid Keşif Araştırma ( # 26650059) ve Japonya Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji dan 'Genom Desteği' (# 221S0002) (HF).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
gBlock sentez hizmetiYaşam TeknolojileriGeneArt
gBlock sentez hizmetiIDT (Entegre DNA Teknolojileri)gBlocks Gen Parçaları
pSIR-neoAddgene51128
pSIR-GFPAddgene51134
pSIR-DsRed-Express2Addgene51135
pSIR-hCD2Addgene51143
TAL sentez hizmetiYaşam TeknolojileriGeneArt Hassas TAL'ler
3xFLAG-dCas9 / pCMV-7.1Addgene47948
3 kez; FLAG-dCas9/pMXs-puroAddgene51240
3& kez; FLAG-dCas9/pMXs-IGAddgene51258
3 kez; BAYRAK-dCas9/pMXs-I2Addgene51259
3 kez; FLAG-dCas9/pMXs-neoAddgene51260
anti-FLAG M2 AbSigma-AldrichF1804
FITC-konjuge anti-FLAG M2Sigma-AldrichF4049
Life Technologies89985için DMEM ortamıFBS'den satın alınabilir
SILACLife Technologies89986
SILAC Yaşam Teknolojileri için L-Lizin-2HCl89987Hafif orta için
Yaşam Teknolojileriiçin L-Arginin-HCl89989Hafif orta için
L-Lizin-2HCl, SILAC Yaşam Teknolojileri için 13C689988Ağır orta için
L-Arginin-HCl, 13C6, 15N4 SILACYaşam Teknolojileri89990Ağır orta
için Komple, mini, EDTA içermeyenRoche Diagnostics4693159
Ultrasonik Bozucu UD-201Tomy Seiko
ChIP DNA Temiz & YoğunlaştırıcıZymo ResearchD5205
Dynabeads-Protein GLife TechnologiesDB10004
RNasin Plus RNase İnhibitörüPromegaN2611
Isogen IINippon Gene311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kitiZymo ResearchR2050
LTQ Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificMS analizi için bir nanoLC-MS/MS sisteminin bir bileşeni
nanoLCAdvance, Michrom BioresourcesMS analizi için bir nanoLC-MS/MS sisteminin bir bileşeni
HTC-PAL otomatik numune alma cihazıCTC AnalyticsMS analizi için bir nanoLC-MS/MS sisteminin bir bileşeni
tarafından Gen SenteziSILAC Diğer ortamlar Life Technologies Diyaliz içinSILAC için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109(2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273(2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26(2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171(2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084(2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387(2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213(2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

enChIP TechniqueGenomic Region IsolationCRISPR dCas9 ComplexTAL Protein TaggingChromatin ImmunoprecipitationMass Spectrometry AnalysisRNA Sequencing AnalysisFormaldehyde CrosslinkingSonication FragmentationAnti FLAG Immunoprecipitation

İlgili makaleler