Method Article

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D sferoidlerin iç G1 tutuklanan ve dış proliferatif bölgelerindeki hücreleri tanımlamak ve izole etmek için floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) ve görüntü analizi veya akış sitometrisi kullanarak iki tamamlayıcı yöntemi açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) tümör sferoidleri, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürüne kıyasla, in vivo tümör mikroçevresinin daha doğru bir modeli olarak kanser araştırmalarında kullanılır. Sferoid model, hücre-hücre etkileşimi, hipoksi ve besin yoksunluğu ve ilaç penetrasyonunun etkilerini taklit edebilir. Bu modelin bir özelliği, sferoidin dış katmanlarında çoğalan hücrelere sahip, G1 tutuklanmış hücrelerden oluşan bir halka ile çevrili nekrotik bir çekirdeğin gelişmesidir. Kanser alanında ilgi çekici olan, sferoidin farklı bölgelerinin ilaç tedavilerine ve genetik veya çevresel manipülasyona nasıl tepki verdiğidir. Burada, hücrelerin hücre döngüsü durumunu melanom sferoidleri içindeki konumlarına göre karakterize etmek için ticari yazılım kullanarak sitometri ve görüntü analizi ile birlikte floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) sisteminin kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntemler, zaman içinde ve farklı koşullar altında tümör sferoidlerinin farklı alt bölgelerinde hücre döngüsü durumu, gen/protein ekspresyonu veya hücre canlılığındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli 3D sferoidler ancak birçok katı kanser için bir in vitro model olarak daha yaygın hale gelmiş ancak son zamanlarda, on bir tümör modeli olarak bilinmektedir. Bunlar giderek daha karmaşık, pahalı ve zaman alıcı in vivo modellerde ve basit, düşük maliyetli 2D tek tabakalı modeli 1-6 arasında bir ara ürün olarak yüksek verimli ilaç keşif ekranlarında kullanılmaktadır. 2B kültüründe çalışmalar genellikle in vivo olarak çoğaltılması mümkün değildir. Birçok kanser tiplerinin Sferoid modelleri büyüme karakteristiklerine, ilaç duyarlılığı, ilaç nüfuzu, hücre-hücre etkileşimi, katı tümörler 6-11, in vivo gö....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fucci Transdüksiyonu ve Hücre Kültürü

  1. Fucci iletimi
    1. Stabil Fucci ifade eden hücre hatları oluşturmak, daha önce 7 açıklandığı gibi lentivirüs ko-transdüksiyonunun kullanarak mKO2-hCdt1 (30-120) ve MAG-hGem (1-100) 15 oluşturur.
      Not: Fucci sistemi şimdi ticari olarak elde edilebilir.
    2. Tek hücreli sıralama ile parlak floresan ile alt klonları oluşturun. Bir 96-yuvalı plaka içine flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile AG ve KO (sarı) hem pozitif Sıralama, tek hücreler, daha önce tarif edildiği 7,16.
  2. Melanom hücre kültürü
    1. Kültür C8161 insan melanoma hücresi, daha önce....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör parçacıklarının üretilmesi için çeşitli yöntemler bu protokol hücreleri agar veya agaroz 3,7,9 kültürlenir yapışmayan bir büyüme yöntemi kullanır vardır. 1 agar üzerinde 3 gün sonra, bir C8161 melanoma sfero bir örneğini göstermektedir. C8161 sferoidler 500 çaplı normal büyüklükte sferoidler oluştururlar - 600 mikron 3 gün sonra (= 565, SD = 19, n = 3 ortalama). Sferoidler oluşturacak diğer melanoma hücre hatları şunlardır: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205Lu (bu, bir .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yarı otomatik bir görüntü analiz sferoid iç G1 tutuklandı bölgeyi tanımladık ve dış tabakalar çoğalan. Bu yöntem, bir optik bölümünde kullanılarak canlı küremsiler de kullanılabilir, ya da sabit küremsi bölümlerde, bu farklı bölgelerde hücre döngüsü, ancak (immünofloresan ile) belirteç ekspresyonu, hücre ölümü veya hücre morfolojisi, sadece değişiklikleri tespit etmek. Farklı sfero bölgeler içinde hücre motilitesi de sayısal olabilir - hücre izleme görüntü analizi aşaması ile birlikte canlı konfokal zaman atlamalı görün.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PerkinElmer yayın maliyetlerine katkıda bulundu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik yardım için Bayan Danae Sharp ve Bayan Sheena Daignault'a teşekkür ederiz. FUCCI yapılarını sağladıkları için RIKEN, Wako-city, Japonya'dan Dr. Atsushi Miyawaki'ye, Philadelphia'daki Wistar Enstitüsü'nden Dr. Meenhard Herlyn ve Bayan Patricia Brafford'a, hücre hatları sağladıkları için, Yüzüncü Yıl Enstitüsü'ndeki Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Tesisine olağanüstü teknik destek için teşekkür ederiz. Volocity yazılım teknik desteği için Bay Chris Johnson ve Dr. Andrew Barlow'a teşekkür ederiz. N.K.H., Avustralya'daki Melanom ve Cilt Kanseri Araştırma Enstitüsü'nün Cameron üyesidir. K.A.B., New South Wales Kanser Enstitüsü üyesidir (13/ECF/1-39). W.W., Yeni Güne....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH3570
agaroz düşük erime noktasıYaşam Teknolojileri16520-050
Asil agar SigmaA5431Sferoidler
için agaroz yapmak içinFisher ScientificBP1356-100Sferoidler yapmak için
%0,05 tripsin/EDTAYaşam Teknolojileri25300-054
HBSSYaşam Teknolojileri14175-103
%10 formalinSigmaHT5014-1CSDİKKAT: Zararlı, aşındırıcı. Kişisel Koruyucu Ekipman Kullanın, yapın   nefes dumanı değil (bir duman dolabında açın).
Life TechnologiesL10119
vibratomTechnical Products International, Inc
coulture cupThermo-Fisher ScientificSIE936Sferoidleri kesit almak için kalıp
hemositometreSigmaZ359629
96 oyuklu doku kültürü plakasıInvitroFAL353072
kollajenazSigmaC5138 
konfokal mikroskopLeicaTCS SP5
Akış sitometresi analizörüBecton DickinsonLSRFortessa
volocityPerkinElmerGörüntüleme yazılımı
flowjoTree StarFlow sitometri yazılımı
Vakum gresiSigmaZ273554
Montaj ortamıVektör LaboratuvarlarH1000
FUCCI (ticari yapılar)Life TechnologiesP36238Yalnızca geçici transfeksiyon
Hücre süzgeci 70 & # 956; mIn VitroFAL352350
Yuvarlak tabanlı 5 ml tüpler (steril)In VitroFAL352003
Yuvarlak tabanlı 5 ml tüpler (steril olmayan)In VitroFAL352008
IR yakınında canlı/ölü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

Related Articles