Method Article

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama Xenopus Oosit ekspresyon sistemi

DOI:

10.3791/53518

⸱

January 30th, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, Shepherd University, 2Department of Biology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik indüksiyondan sorumlu genlerin tanımlanması bir dizi zorluk doğurur; birkaçını saymak gerekirse, salgılanan ilgili moleküller bol miktarda olabilir, salgılanmayabilir, ancak sinyal hücresine/hücrelerine bağlı olabilir, veya bağlayıcı ortakların veya yukarı akış düzenleyici moleküllerin varlığını gerektirebilir. Bu nedenle, yetkin ektodermde erken bir lens indüktif tepkisi ortaya çıkarabilen gen ürünleri arayışında, parakrin veya jukstakriin faktörlerinin yanı sıra transkripsiyonel veya diğer düzenleyici proteinlerin tanımlanmasına izin verecek bir ekspresyon klonlama sistemi kullandık. mRNA havuzları Xenopus oositlerine enjekte edildi ve yanıt veren doku doğrudan oositlerin üzerine yerleştirildi ve birlikte kültürlendi. Lense yetkin hayvan şapkası ektoderminde erken lens plakod işaretleyicisi foxe3'ün ekspresyonunu ortaya çıkarma yeteneğine dayalı olarak bir nöral plaka aşaması cDNA kütüphanesinden ldb1'in fonksiyonel klonlanmasını takiben, mRNA ekspresyon modelini karakterize ettik ve ldb1'in aşırı ekspresyonu veya devrilmesini takiben gelişimsel ilerlemeyi test ettik. Bu sistem, bir indükleyicinin veya onun yukarı akış düzenleyici moleküllerinin tanımlanmasının, yetkin dokuda fonksiyonel bir yanıt kullanılarak arandığı çok çeşitli bağlamlarda uygundur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlgilenilen genleri işlevleri veya işlev kayıpları yoluyla tanımlamaya yönelik ileri genetik yaklaşımlar1,2, gelişimdeki karmaşık modelleme olaylarını anlamanın ayrılmaz bir parçasıdır. Sürekli genişleyen bir dizi sistem ve araştırmacı3-5 için mevcut olan güçlü ters genetik tekniklerle birleştiğinde, artık bir yolda anahtar bir işlevsel role sahip genleri tanımlamak ve daha sonra hücresel düzeyde ve diğer gen ürünleriyle etkileşim içinde işlev gören genleri aydınlatmak mümkündür. Geçmişte birçok önemli bulgu ortaya çıkaran ilgili genleri işlevsel olarak tanımlamaya yönelik bir yaklaşım, ifade klonlamasıdır6,7.

Son zamanlardakihedefimiz 8, omurgalı lens indüktif sürecindeki ilk adımların gastrula evreleri kadar erken gerçekleştiği gösterildiğinden, erken lens indüktif faktörlerini belirlemekti. Bu amaçla, Xenopus embriyolarının geçici olarak lens yetkin9 hayvan başlığı ektodermini (evre 11-11.510) indüksiyon için yanıt veren doku olarak ve evre VI Xenopus oositini indükleyici faktörler için bir üretim kaynağı olarak kullandık.

Aşağıdaki protokol, Smith ve Harland6,7'nin ifade klonlama ve sib seçim protokolleri üzerine inşa edilmiştirve diğerleri 11-13 tarafından da başarıyla kullanılmıştır. Oosit ekspresyon sistemimizde (ilk olarak Lustig ve Kirschner14 tarafından indükleyici faktörlerin üretimi için kullanılmıştır), oositlerin doğrudan veya dolaylı olarak hayvan başlığı ektoderminde lens indüktif yanıtı ortaya çıkaran faktörler üretmesine neden olabilen enjekte edilmiş transkript havuzları seçilir ve tanımlanır. Sistem, salgılanan indükleyici molekülleri doğrudan eksprese etmek için yararlı olduğundan (oosit enjekte edilen INHBB mRNA, mezoderm yetkin hayvan kapektodermi 8'de mezoderm indüksiyonuna neden olur), başlangıçta tarama prosedürünün esas olarak parakrin faktörlerin tanımlanması için yararlı olmasını bekliyorduk. Bununla birlikte, ekranımızda bir nükleer faktör tanımladığımızdan (ldb18), sistemin transkripsiyonel veya translasyonel düzenleyici faktörler, miRNA'lar, kofaktörler veya jukstastrin faktörleri gibi çok çeşitli molekülleri tanımlamak için kullanılabileceği açıktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deney prosedürleri Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Not: Şekil 1, deneysel prosedürler şematik görünümünü gösterir.

Oosit hazırlanması 1.

  1. Ön asal X oosit izolasyon önceden Gebe Kısrak Serum Gonadotropin 150 U (PMSG) yaklaşık bir hafta ile kadın laevis. 29 G iğne ile 1 cc steril şırınga ile dorsal lenf kese içine 1 ml 150 U / ml PMSG enjekte edilir.
  2. Oosit enjeksiyonu ve oosit-hayvan kap deneyi için çözümler hazırlayın.
    1. Ca Hazırlama ++ / Mg ++ içermeyen OR2 (OR2-): 82 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7.2.
    2. OR2- artı 1 mM CaCl2 ve 1 mM MgCl2: ya da 2'yi hazırlayın.
    3. % 60 Leibovitz L15, 0.4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamisin, pH 7,8: OCM hazırlayın.
    4. Ön1x MBS hazırlanması: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 mM 3 NaHCO.
    5. 1x MBS% 3 Ficoll hazırlayın.
    6. 1x NAM hazırlayın: 110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4 ile yıkanır.
  3. 0.1X MBS Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzunun% 0.03 çözeltisi (MS222) 'de kadın anestezisi için çözelti kurbağa yerleştirerek (ilk 10 ml% 95 etanol içinde 0.3 g MS222 çözülür, daha sonra 1 L, 0.1X MBS sulandırmak) 10-15 dakika veya tepkisiz kadar.
    1. Bu anestezi yanıt vermiyor sağlamak (eksik anestezi kurbağa uzuvları taşımak veya bedeni teslim) onun sırtına anestezi kurbağa çevirerek tam olup olmadığını kontrol edin.
  4. Cerrahi forseps ile yumurtalık dokusu izole bisturi cilt ve vücut duvarı boyunca abdominal insizyon yapılıp, yumurtalık fragmanlarını izoleve makas. OR2- içine yumurtalık parçaları yerleştirin. 24 mm'lik kavisli iğne 3-0 ipek sütür ile vücut duvarı kapatın ve aynı sütür ile ayrı ayrı cilt kapatın. Su içinde 1 g / L akvaryum tuzu kadın kurtarma izin verir.
  5. (- 20 oosit 10) adet ve taze OR2- transfer küçük içine ince forseps, gözyaşı yumurtalık dokusu kullanma.
  6. 1 saat boyunca karıştırma cihazı üzerinde, hafifçe ajite taze kolajenaz geçiş ve bir saat daha çalkalayarak OR2- 2.0 mg / ml kollajenaz A Defolliculate yumurtalık fragmanları.
  7. Yıkama küçük oosit atarak OR2 [Ca ++ / Mg ++ ihtiva eden] 10 kez, oositlerde.
  8. OCM iki kez oosit yıkayın ve taze OCM transfer. Görsel inceleme üzerine boyutuna göre Evre VI oosit izole edin ve olgunlaşmamış (küçük) oosit atın: Sahne VI oositlerin hayvan yarımkürede bile pigmentasyon ile olgunlaşmamış oositlerin büyüktür ve çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm.
  9. 20 ° C i - 18 oosit koruyunenjeksiyondan önce n OCM. Not: Agaroz kaplı petri kaplarına çanak oositlerin yapışmasını en aza indirmek için de kullanılabilir.

Kütüphane Transkriptler 2. Enjeksiyon

  1. Gelişme uygun bir aşamada (örneğin, nöral plak aşaması 14 10) ekstre yönlü bir cDNA kütüphanesi 15 kullanarak, RNA yı hazırlamak. Bir cDNA kütüphanesi satın alın ya da aşağıda dört adımda genel başına bir ticari kit kullanılarak bir inşa.
    1. Poli (A) + RNA (Malzeme Tablo bakınız) için zenginleştirmek için bir ürünü kullanırken ve üreticinin yönergeleri izleyerek yaklaşık 5 ug mRNA izole edin. Not: transkript (istenilen doku mikrodiseksiyon sonra, nöral levha gibi) bir indükleme dokuya sınırlı olabilir cDNA kütüphanesini üretmek için kullanılır, ya da belirli bir aşamada bütün embriyolardan olabilir.
    2. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari kit ile cDNA üretin.
    3. Bir Vecto içine cDNA ng, yaklaşık 20 Arterr ticari kit veya uygun başka bir vektör ile birlikte. Uygun bir plazmid vektörü mRNA stabilitesi gibi 5 'β-globin ve 3 poli (A) sekansları (PCS2 +, pTnT, pCS105) için dizileri içerir.
    4. Isı şok dönüşümü için tedarikçinin önerdiği protokol kullanılarak yetkili bakteri hücrelerine ligasyonu Transform.
      Not: Alternatif olarak, açık okuma çerçevesi (ORFeome) klonları koleksiyonu, ticari olarak mevcuttur ve enjeksiyon için transkriptleri oluşturmak için kullanılabilir.
  2. 10 4 karmaşıklık (10 Nisan - 10 Mayıs toplam karmaşıklığı) 10 3 Plazmidlerin 10 havuzları hazırlayın. 10.000 kolonilerin her - Bu 1000 ile 10 plakaları temsil eder.
    1. 37 ˚C de 18 saat ve 7 ml LB bir cam dağıtıcı ile hafif basınç her gelen koloniler toplamak - Plaka kütüphane kültürü 10 15 cm LB-ampisilin plakalar üzerine, 12 büyüyecek
    2. 0.5 ml bir gliserol stok hazırlayın (-20 & 0.2 ml steril gliserol ve mağaza eklemek# 730 C) ve bir standart ile, üretici firmanın talimatlarına aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir DNA miniprep kiti DNA hazırlamak için, kalan 6.5 ml kullanılır.
  3. 1.5 saat - Enzim 1 için 37 ° C'da 16 sindirimi, uygun kısıtlama - (2,0 ug 1,0) havuzlanmış plazmid DNA Linearize. Kullanılan RNA polimeraz kit özelliklerine göre su içinde etanol çökeltme ve yeniden süspansiyon haline getirildi, fenol / kloroform ekstraksiyonu ile linearize DNA izole edin. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari RNA polimeraz kiti ile duyu RNA sentez.
  4. Yaklaşık 20 mikron çapında (cam kılcal boru ile bir iğne çektirmenin kullanarak) mikroenjeksiyon için iğne hazırlayın; kalibre oküler mikrometre ile bir bileşik mikroskop iğne uçları ölçün. Not: İğne çektirmesi ayarları ince forseps ile kırıldığı zaman istenilen uç boyutu ortaya çıkarır şekilde ince uçlu bir iğne üretmek ampirik olarak tespit edilmelidir.
  5. (Içine kil itin hazırlayınçanak alt) üzerine muntazam tabakalı kil astarlı 35 x 10 mm mikroenjeksiyon sırasında yerinde oosit tutmak için paralel oluklar petri yemekler; alev ucunda erimiş bir alışveriş merkezi probu veya Pasteur pipeti ile oluklar üretirler. Kil, bir alternatif olarak, bir elastomer kalıp 17, girinti yaparak agaroz yemekler hazırlamak. Kil astarlı yemekleri satırları 1X MBS% 3 Ficoll (yaklaşık 2 ml) geniş çaplı bir pipet ile Aktarım oosit.
  6. Mikroenjektör kullanarak, 1 ng / nl RNA ile iğne doldurup (oosit sitoplazması kadar çizim önlemek için) hafif pozitif basınç üretmek için dengesini ayarlamak.
  7. Ekvator bölgesinde yaklaşık 20 nl RNA ile oosit enjekte edilir. Daha sonra, Ficoll-MBS kalır 1x MBS yavaşça aktarmak için enjekte edilmiş oositlerde için 1 saat izin verin. Önceden hayvan başlık tahlili için 20 ° C'de 24 saat - 8 inkübe edin.

3. Hayvan Cap Testi

  1. Ince forseps, saç döngü, kavisli lamel parçaları, kil astarlı dis 3 / 4x NAM hazırlayın ve eldefincan şekilli girinti çıkıntılar ile hes oosit tutun. Kavisli parça üreten, (4 mm - - 2 mm x 2 yaklaşık 1) ve kenarları lehçe ve sarkık kadar alev geçerek küçük parçalara cam lamelleri ayrı kırarak kavisli lamel parçaları olun.
  2. X döller laevis yumurta in vitro veya doğal çiftleşme ve aşamaları gastrula kültürün içinden 18 - önceden aşamaya göre sıralama için 0.1x MBS (10 oda sıcaklığında 11 saat sonrası fertilizasyon); 10 embriyoların - orta gastrula (11.5 aşama 11) toplamak.
  3. 3 / 4x NAM yaklaşık yarısı dolu bir petri embriyolar transfer. Ince forseps iki çift kullanarak, gastrulae gelen fertilizasyon (vitellin) membran kaldırmak.
  4. Aktarım kil astarlı yemekleri 3 / 4x NAM (yaklaşık 2 ml) oocytes ve oluklar yukarıda açıklandığı gibi bireysel embriyolar karşılamak için gösterim üreten, kil bireysel izlenimler hareketsiz.
  5. Kil astarlı yemekleri embriyolar transfer ve g kapalı hayvan kesim kapaklarıastrulae ince forseps iki çift kullanarak. Değil, sadece ekvator doku 18 hayvan kap ektoderm izole etmek için özen gösterin.
  6. Oosit ile temas hayvan kapağın iç yüzeyi ile her bir oosite hayvan yarımkürede bir hayvan kapağını yerleştirin. 8 saat veya daha uzun - 6 oosit yüzeyine maruz iç tabaka ile açık kalabilir (lamel kontaklar olarak hayvan kapakları kil ektoderm düzleşme, bombeli cam lamel fragmanı uygulanması ve cama aşağı doğru basınç uygulayarak rekombinantlarını arada tutmak ).
    Alternatif olarak, yukarı doğru bakan iç yüzeyi ile bir kil girinti hayvansal takarak ve kapağı üzerinde bir oosit yerleştirmek; Not: kil, küçük uzantıları ile rekombinant sabitleyin.
  7. 20 ° C'de Kültür kontrol embriyolar tahlil için sahne istenen ulaştıkları kadar.
  8. Lamel / kil kaldırılması ve forseps ve saç döngü ile ektoderm izole ederek ayrı rekombinant.
  9. MEMFA 1 saat (% 3.8 için ektodermal fragmanları FixMEM [0,1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA ve 1 mM MgSO 4] formaldehit).
  10. -20 ˚C etanol ve mağaza MEMFA transfer fragmanları (ve kontrol embriyolar).

In situ Hibridizasyon tarafından Ektoderm içinde Yanıtın 4. Analizi (ISH)

  1. ISH için çözümler hazırlayın.
    1. 1x PBS hazırlayın: 0.01 M fosfat tamponlu tuz, NaCl 0.138 M, pH 7.4
    2. Hazırlama PBS-Tween (PTW): 1x PBS,% 0.1 Tween-20
    3. 100x Denhart solüsyonu hazırlayın: 2% BSA,% 2 polivinilpirolidon,% 2 Ficoll
    4. Hibridizasyon tamponu hazırlayın:% 50 formamid, 5x SSC, 1 mg / ml maya RNA Torula, 1 ug / ml heparin, 1x Denhart solüsyonu,% 0.1 Tween-20,% 0.1 CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC H2O
    5. Hazırlama Maleik asit tampon (MAB): 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI, pH 7.5
    6. (Çözünmesi 60 ˚C ısı) MAB,% 2 reaktifi engelleme: MAB + blok hazırlayın
    7. 100 mM Tris: Alkalen Fosfataz (AP) Tampon hazırlayınpH 9.5, 50 mM MgCI2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween, dH 2 O
  2. RNA Probe hazırlayın.
    1. 1.5 ml tüp (50 ul reaksiyon) eklemek ticari bir RNA polimeraz kit kullanılarak ve karışımı-NTP dig: 25.5 ul DEPC, H2O, 10 ul 5X Transkripsiyon tamponu, 2.5 ul 10x dig-NTP karışımı, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul doğrusallaştırılmış DNA şablonu (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polimeraz ve 90 dakika için 37 ° inkübe edin.
    2. 2 ul RNA Polymerase ekleyin ve 60 dakika için 37 ° inkübe edin.
    3. % 1 agaroz jeli üzerinde reaksiyon 2 ul kontrol edin.
    4. 1 ul RQ1 RNase-barındırmayan DNase ilave edin ve 20 dakika boyunca 37 ° inkübe edin.
    5. 50 ul DEPC H2O, 25 ul 10 M amonyum asetat ve 313 ul etanolün eklenmesi ile prob Çökelme. -20 ° C'de saklayın, gece boyunca (O / N), daha sonra 20 dakika boyunca 13.800 x g'de santrifüjleme ile geri RNA. Kısaca spin 500 ul% 75 etanol ile yıkayın, kaldırmaketanol ve kuru hava pelet izin verir. Ekle 50 ul DEPC H 2 O.
    6. 0.5 ug / ul ~ arasında nihai bir konsantrasyona kadar Hibridizasyon Tamponu ekleyin.
  3. Hibridizasyon için Tissue hazırlayın. Aksi belirtilmediği sürece, her bir çözüm değişikliği tarif edildiği gibi (yaklaşık 4 mi) ile üst şişeler doldurulur.
    1. Yatay rocker, 10 dakika her biri için% 75 etanol / PTW, daha sonra% 50 etanol / PTW Şişelerden ve transfer embriyolar etanol çıkarın.
    2. 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın.
    3. 10 ug PTW içinde / ul Proteinaz K tedavisi transfer; Kaya tüpleri dik 15 dk.
    4. Dikey kaya tüpleri - 0.1 M Triethanolamine pH 7.8 iki kez 10 dakika her durulayın.
    5. Tüplere 12.5 ul asetik anhidrit eklenir ve dikey olarak 5 dakika sallayın. 5 dakika boyunca ilave 12,5 ul asetik anhidrit ile tekrarlayın.
    6. Rocker dk dikey PTW 5 yıkayın.
    7. Rocker% 4 paraformaldehid 20 dakika içinde Refix. Isı Hibridizasyon Tampon60 ˚C ye.
    8. 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın.
    9. 250 ul Hyb Buffer her tüpten PTW tüm ama ~ 1 ml çıkarın ve ekleyin; hafifçe karıştırın tüpler girdap. Kaya tüpleri dik 5 dk.
    10. 60 ˚C Hyb Tamponu (0.5 mi) ile değiştirin ve 60 ° C'de 10 dakika yavaşça çalkalayın. Taze Hyb Tampon ile değiştirin ve 60 ˚C iki 4 saat sonra çalkalayın.
    11. Isı sondası 60 ° C (3 dakika) (0.5 ug Hyb Tamponu içinde / ml 1 ml). Hyb Buffer çıkarın ve tüpler probu ekleyin. O / N 60 ° C'de yavaşça çalkalayın.
  4. Antikor için Tissue hazırlayın.
    1. 60 ° C'ye ısınmaya Hyb Tampon ve 2 x SSC +% 0.1 Tween-20 çözümler.
    2. (- 3x yeniden kullanım için 2 -20 ˚C de probları kaydetmek) Hyb Tampon ile prob çözümü değiştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C'de yıkanır.
    3. 2x SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın.
    4. 0.2X SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın.
    5. Rocker üzerinde 15 dakika her yatay için MAB (RT) iki kez yıkayın.
    6. 1 ml MAB + bloğu ekleyin. Rocker dikey 2 saat yıkayın.
    7. 1 / 2.000 Anti-dioksijenin-AP içeren 1 ml MAB + blok transfer. 4 CO / N dikey sallayın.
  5. Renk Reaktif için Tissue hazırlayın.
    1. MAB ile antikor çözüm değiştirin; MAB 5 dakika her yatay rocker üç kez yıkayın.
    2. MAB 1 saat her yatay rocker üç kez yıkayın.
    3. AP Tampon 10 dakika içinde her yatay rocker iki kez yıkayın.
    4. Birden-iyi plastik tepsi doku aktarın AP Buffer kaldırmak ve BM Mor reaktifmi (~ 1 ml). Reaksiyon O / N karanlık 5 dakika içinde ilerlemeye izin verin.
    5. Uygun boyama elde edildiğinde, PTW ve şişelere doku aktarın. Rocker üzerinde PTW iki kez 10 dakika her yıkayın.
    6. Rocker 4 CO / N at Bouin çözeltide sabitleyin.
    7. RT'de Bouin üç% 70 etanol /% 30 PTW yıkar ile yıkayın. T DevamGerekli 18 ise epi-aydınlatma ve bir mikroskop monte kamera, ağartma kullanarak o görüntü yakalama.

5. Sib Seçimi ve Klonlama

  1. En yüksek aktivite ile seçin havuzu (ektodermal dokusunda büyük tepki).
  2. (Yukarıda protokol bölümü 2 kullanılarak) önceki adımda elde edilen koloniler, en yüksek etkinliği olan havuzu için gliserol stokları (uygun yoğunluğa LB ile seyreltilmiş) ile yaklaşık onda biri ile on yeni plakaları plaka titre edilir.
  3. Etkinlik tek koloni takip dek havuzu boyutunu azaltın.
  4. Vektör standart primerler kullanılarak DNA sekansı elde edilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan kap doku yanıt, oositler enjekte mRNA ekspresyonu yanıt olarak in situ hibridizasyon (Şekil 2 ve Tablo 1) e göre otx2 ekspresyonu için tahlil edilmiştir; otx2 göz taslakları nöral tüp kapanması ile ilgili olası lens ektoderm (PLE) cinsinden ifade edilir kalınlaşma 19. Otx2 da PLE dışındaki ön nöral ektoderm olarak nöral olmayan baş ektoderm ifade edilir Bununla birlikte, bu nöral ve placodal tepkiler...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetkili ektoderm bir yanıt indükleme yeteneğine sahip genlerin fonksiyonel klonlanması için, burada açıklanan yöntem, gen ürünlerinin geniş tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem ifade klonlama teknikleri ile doku uyaran deneyleri birleştirerek geçmiş iş üzerine genişletir. Bu RNA, enjeksiyonu takiben, doğrudan veya dolaylı olarak, faktör uyarıcı üretim kaynağı olarak, Xenopus oosit metabolik yolları kullanmaktadır. Bu ilgi, bir cDNA kütüphanesi veya klonları diğer toplama elde edilen transkriptlerin ekspres...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Shepherd University Foundation'dan C.Z.P.'ye verilen Mesleki Gelişim Bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar, protokoller hakkındaki yararlı tartışmalar için Brett Zirkle ve Malia Deshotel'e ve cömert yardımları için Dr. Carol Hurney'e teşekkür etmek isterler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12/101 AntikorGelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası12/101Kas dokusunun tespiti için monoklonal antikor
Asetik anhidritS6639ISH Anti-Dig-AP için
Roche11093274910
Bio-Rad732-6400Plazmid DNA saflaştırması
ISH BM içinEdici ReaktifRoche11096176001
Boekel Hibridizasyon FırınıFisher Scientific13-245-121
BSAiçin Sigma HT10132 OCMC9647
Sigma SigmaC3023ISH için
Kollajenaz ARoche10103578001Oositlerin Defollikasyonu
SisteinSigmaC121800Dejelly embriyoları
ISH içinDEPC-H2OFisher ScientificBP5611
Dig-RNA Etiketleme KarışımıISH probları içinRoche11277073910
Dumont #5 forsepsWorld Precision Instruments500233 çıkarma
Etil 3-aminobenzoatSigmaA5040MS222 anestezik
Ficoll PM 400SigmaF4375Enjeksiyon ortamı için
içinFormamidSigmaF9037
OCM için SigmaG1914
Cam kılcal damarlarHassas Aletler48783.5 "uzunluğunda, I, D, 0.530 mm
ISH içincam numune şişeleriFisher Scientific06-408B
Saç halkasıDoku manipülasyonu için pasteur pipete yapıştırılmış saçlar
ISHHeparin sodyum tuzuSigmaH4784
Dünya Hassas AletlerNanolitre 2010Mikroişlemci kontrollü mikroenjektör
Instant OceanCarolina972433Kurbağa kurtarma için Akvaryum Tuzu
IRBG XGC Xenopus doğrulanmış tam uzunlukta kamera cDNAKaynak Biyobilim989_IRBGcDNA kütüphanesi 
100 & mikro ile LB Agar plakaları; g/ml Ampisilin TeknovaL5004150 mm önceden dökülmüş LB-Amp sib seçimi için plakalar
LB Luria BrothTeknovaL8650LB sib'de kolonilerin toplanması, plakalardan seçilmesi ve kültürlerin seyreltilmesi için
Manyetik mRNA İzolasyon Kiti
için poli(A)-zenginleştirilmiş RNA Maleik Asit Sigma M0375'in izolasyonu için New England BioLabs S1550SManuel Microfil MicromanipülatorWorld Hassas AletlerM3310RManuel mikromanipülatör
Nutating MikserFisher Scientific22-363-152
Enjeksiyon ve diseksiyon yemekleri içinPermoplastNascoSB33495M
içinFosfat Tamponlu SalinP5368
Oosit gelişimini uyarmak
ISHÇektirme DünyasıPolivinilpirolidonSigma PVP40
PUL-1000Mikropipet iğne çektirme
Proteinaz KSigmaP6556
PromegaL5610cDNA kütüphane yapısı
Riboprobe Kombinasyon SistemiPromegaP1450in vitro transkripsiyon
Üst Simge Tam Boy cDNA Kütüphanesi İnşaat Kiti cDNAkütüphanesi yapımı içinLife Technologies18248013
Sütürler, 3-0 ipekFisher Scientific19-037-516Oosit sonrası temizleme için dikiş ipliği ve iğnesi
ISH için Torula RNASigmaR3629
ISH
için Trietanolamin Sigma T1502ISH UniversaliçinSigmaP9416
cDNA kütüphanesi yapımı içinPromegaC4360
Xenopus Tam ORF Giriş Klonları - ORFeome İşbirliğiKaynak Biyobilim5055_XenORFeomeORFeome Klonları
XL2-Mavi Ultra Yetkin HücrelerAgilent Technologies200150hücreleri kütüphane
ISH için 20x SSC Tampon Sigma Sigma A6404 ISH Aurum Plazmid Mini Kiti için Bloke ISHiçin Mor Roche 11442074001 ISH Bouin'in Çözeltisi için ISH CHAPS Sigma için Vitellin zarfı için ISH Gentamisin sülfat Dünya Enjektör Nanolitre 2010 için ISH ISH Kil için Rocker ISH PMSG Sigma G4877 Sigma içinProgramlanabilir Hassas Aletler için ISH pTnT Vektör için kiti RiboClone cDNA Sentez Sistemi Tween 20 alternatif kiti cDNA dönüşümü için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
  3. Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
  4. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  5. Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
  6. Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
  7. Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  8. Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
  10. Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  11. Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
  12. Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
  13. Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
  14. Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
  15. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
  16. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
  17. Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).
  18. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
  19. Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
  20. Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
  21. Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
  22. Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
  23. Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus Oocyte Expression SystemAnimal Cap AssayFunctional CloningmRNA InjectionEmbryonic InductionLens Placode MarkerIn Situ HybridizationOocyte IsolationTissue RecombinationDevelopmental Biology

Related Articles