Yöntem makalesi

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

DOI:

10.3791/53529

⸱

6 Ocak 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinositidler (PtdInsPs), spesifik efektörleri işe almaktan ve organellere moleküler kimlik ve işlev kazandırmaktan sorumlu temel sinyal lipidleridir. Yedi PtdInsP'nin her biri, belirli kinazlar ve fosfatazlar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenen dağılımları ve bollukları bakımından farklılık gösterir. PtdInsP'lerin bolluğu, çeşitli sinyalleşme olaylarına veya düzenleyici makinelerin bozulmasına yanıt olarak aniden değişebilir. Bu olayların PtdInsPs miktarında nasıl değişikliklere yol açtığını ve bunun sonucunda ortaya çıkan etkilerini anlamak için, bir sinyalleşme olayından önce ve sonra veya kontrol ile anormal koşullar arasında PtdInsP seviyelerini ölçmek önemlidir. Bununla birlikte, düşük bollukları ve benzerlikleri nedeniyle, her bir PtdInsP'nin nispi miktarlarını ölçmek zor olabilir. Bu makale, hücreleri PtdInsP'lere dahil edilen 3H-miyo-inositol ile metabolik olarak etiketleyerek PtdInsP seviyelerini ölçmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Fosfolipitler daha sonra çökeltilir ve deasillenir. Elde edilen çözünür 3H-glisero-inotidler ayrıca ekstrakte edilir, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile ayrılır ve akış sintilasyonu ile tespit edilir. Maya numunelerinin etiketlenmesi ve işlenmesinin yanı sıra HPLC ve akış sintilatörü için enstrümantal kurulum ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Asil zincir içeriği ile ilgili yapısal bilgileri kaybetmesine rağmen, bu yöntem hassastır ve hücrelerdeki yedi PtdInsP'nin tümünü aynı anda ölçmek için optimize edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfoinositidler (PtdInsPs), sinyal iletimi, zar trafiği ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonları düzenlemeye yardımcı olan ve daha sonra hücre bölünmesi, organel kimliği ve metabolik aktivite1-3 gibi daha yüksek dereceli hücre davranışını modüle eden önemli sinyal fosfolipidleridir. Ana fosfolipid olan fosfatidilinositolün (PtdIns) inositol baş grubunun 3, 4 ve/veya 5 pozisyonunun fosforilasyonundan türetilen yedi PtdInsPs türü vardır. Daha da önemlisi, yedi PtdInsP eşit olmayan bir şekilde dağılmıştır ve her bir PtdInsP türünün yerel konsantrasyonu, farklı bir protein efektörü setine bağlandıkları belirli hücre altı bölgelerde artabilir veya azalabilir, bu da birlikte her bir PtdInsP'nin konakçı zarının kimliğini ve işlevini kontrol etmesine izin verir3,4. Ek olarak, her bir PtdInsP'nin seviyelerinin sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir, çünkü bu, bir PtdInsP tarafından üretilen sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde etkileyebilir. Her bir PtdInsP'nin lokalizasyonu ve seviyeleri, her bir PtdInsP3,4'ün sentezine ve döngüsüne aracılık eden çok sayıda lipid kinaz, fosfataz ve fosfolipazın hedeflenmesine ve aktivitesine bağlıdır. Bu nedenle, PtdInsP düzenleyici mekanizmasının yanlış düzenlenmesi hücre fonksiyonunu bozarak kanser ve dejeneratif hastalıklar gibi hastalıklara yol açabilir2,5,6. PtdInsP'lerin ve düzenleyici makinelerinin rollerini ve işlevlerini tam olarak anlamak için, PtdInsP'leri izlemek ve ölçmek için hem mikroskopi tabanlı hem de biyokimyasal tabanlı teknikler geliştirilmiştir.

Birçok durumda, PtdInsP'ler protein efektörlerine belirli bir protein alanı7-9 aracılığıyla bağlanır. Bu protein modülleri, tüm proteinden ayrı olarak ifade edildiğinde genellikle uygun katlanma ve lipit tanıma özelliklerini korur. Bu, PtdInsP'lerin mikroskopi ile hücre altı tespiti için belirli bir PtdInsP bağlayıcı protein alanını yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir floresan proteine (FP) kaynaştırarak PtdInsP problarına yol açtı. Gerçekten de, birçok çalışma, canlı hücre görüntüleme ile belirli PtdInsP türlerinin lokalizasyonunu ve dinamiklerini belirlemek için FP ile kaynaşmış PtdInsP bağlayıcı protein modüllerini kullanmıştır1,10. Örneğin, GFP'ye kaynaşmış fosfolipaz C δ1'in (PLCδ1) Pleckstrin homolojisi (PH) alanı, plazma zarı üzerindeki fosfatidilinositol-4,5-bifosfatı [PtdIns(4,5)P2] spesifik olarak tanırken, erken endozom antijeni 1'in (EEA1) FYVE alanının tandem kopyaları, endozomlar10-13 üzerindeki fosfatidilinositol-3-fosfatı (PtdIns3P) izlemek için kullanılmıştır. Genel olarak, mikroskopi tabanlı teknikler PtdInsP lokalizasyonunu ve dinamiklerini görselleştirmek için harikadır, ancak PtdInsP bağlama alanlarının hedef PtdInsP türleri dışındaki ek faktörlerle de etkileşime girebileceği ve FP problarının sitozolik floresansının altındaki değişiklikleri tespit edemedikleri de dahil olmak üzere çeşitli uyarılar vardır.

İnce tabaka kromatografisi, kütle spektrometresi ve radyoizotop etiketleme dahil olmak üzere biyokimyasal teknikler, her bir PtdInsP14-16'nın seviyelerini karakterize etmek ve ölçmek için de kullanılabilir. Bu yöntemler, PtdInsP'lerin hücresel seviyelerinin tespiti için lipitlerin izolasyonunu gerektirir. Kütle spektrometresi, lipid ekstraktlarından fosfolipidleri karakterize etmek için kullanılabilir ve PtdInsPs14,17'nin asil zincir bileşimini belirlemek için paha biçilmezdir. Bununla birlikte, kütle spektrometresi çoğunlukla yarı kantitatiftir ve aynı moleküler ağırlığa sahip PtdInsP türlerini çözmek ve aynı anda ölçmekzordur 14,17. Buna karşılık, PtdInsP'lerin radyoizotop etiketlemesi ve ardından yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile birleştirilmiş akış sintilasyonu, yedi PtdInsPs18 türünün tümünün ayrılması ve eşzamanlı olarak ölçülmesi için yararlıdır. HPLC'nin güçlü bir anyon değişimi (SAX) sütunu ile kullanılması, moleküler ağırlığa, yüke ve şekle dayalı olarak ayırma sağlar, böylece aynı moleküler ağırlık ve yükte bile deasillenmiş PtdInsP'leri (Gro-InsPs) fraksiyonlar. HPLC eluentini bir akış sintilatörüne bağlamak, daha sonra orijinal ana gliserol-inositol (Gro-Ins)18'e göre her bir Gro-InsPs türü için radyoaktif tabanlı sinyal tepe noktaları üretir. Bu sonuçta hücrelerdeki nispi PtdInsPs seviyelerine karşılık gelir.

PtdInsP'lerin radyoetiketlenmesi ve HPLC'ye bağlı akış sintilasyonu, fosfatidilinositol 3,5-bifosfatın [PtdIns(3,5)P2] düzenlenmesini ve işlevini araştırmak için yararlı bir araçtır, PtdIns'in yalnızca ~%0.1-0.3'ünü oluşturan bir PtdInsP16,19,20. PtdIns(3,5)P2 sentezi, mayada Fab1 ve memelilerde PIKfyve21 adı verilen PtdIns3P 5-kinaz tarafından gerçekleştirilir. Bu reaksiyon, mayada Fig4 veya memelilerde mFig4/Sac322-24 adı verilen bir PtdIns (3,5) P 2 5-fosfataz ile karşı konulur. İlginç bir şekilde, hem PIKfyve/Fab1 hem de mFig4/Fig4/Sac3 tek bir kompleks içinde bulunur ve iskele adaptör proteini, mayada Vac14 veya memelilerde mVac14/ArPIKfyvetarafından düzenlenir 25,26. VAC14 ile silinen maya hücrelerinde, Fab1 verimli bir şekilde çalışmaz ve bu da PtdIn'lerde (3,5) P2 seviyelerinde27,28% 90'lık bir azalmaya yol açar. Öte yandan, Atg18, vakuolar fisyon 29'u kontrol edebilen bir PtdIns (3,5) P2 efektör proteinidir. Atg18 aynı zamanda PtdIns(3,5)P2'nin negatif bir düzenleyicisidir, çünkü geni ATG18'in silinmesi, PtdIns(3,5)P2 seviyelerinde29,30 10 ila 20 kat artışa neden olur. Genel olarak, PtdIns(3,5)P2 seviyelerindeki değişiklikler, maya vakuolünün ve memeli lizozomlarının işlevini ciddi şekilde etkiler, sonuç olarak zar kaçakçılığı, fagozom olgunlaşması, otofaji ve iyon taşınması gibi süreçleri etkiler 6,19,21,31.

Bu makale, vahşi tip, vac14Δ ve atg18Δ maya suşlarında PtdIns(3,5)P2'nin nispi seviyelerini tespit etmek için mayada 3 H-myo-inositol ile PtdInsP'lerin radyoizotop etiketleme sürecini açıklamaktadır. Bunu bir örnek olarak kullanarak, HPLC'nin tek tek PtdInsP'lerin ayrılması için çözme yeteneklerinin yanı sıra eser miktarda 3H-miyo-inositolün tespiti için akış sintilasyonunun hassasiyeti gösterilmiştir. Ayrıca, bu hücreler yedi PtdInsP türünün tümüne sahip olduğu için örnekleri daha karmaşık olma eğiliminde olan memeli hücrelerinden 3H etiketli PtdInsP'yi etiketlemek ve ayırmak için metodolojinin nasıl optimize edilebileceğini de detaylandırıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Metin aşağıda ayrıntılı olarak mayada PtdInsPs ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Bu etiketleme maya 3 H myo -inositol ile hücrelerin ayıklanması ve deacylating lipit ve damıtmak ve asillendirilmemiş PtdInsPs ölçmek için HPLC-elüsyon protokolü için deneysel ayrıntıları sağlar. Optimizasyonu ve uzun HPLC-elüsyon profilleri gerektiren memeli hücrelerinde PtdInsPs bu etiketleme, deasılasyonunu, çözünürlük ve miktarının unutmayınız. Biz Tartışma yönlerini bazı tartışmak rağmen bu detaylar, başka bir yerde bulunabilir. Genel olarak, yöntem yağ, deasilize özü ve maya verilmiş ve Şekil 1 'de gösterilmiş olup, suda çözünür Gro-InsPs çıkartma özelliğine sahiptir.

Maya Etiketleme ve Analiz PtdInsPs 1. Protokol

  1. Hücre kültürü ve Radyoetiketleme
    1. Sabit tam bir sentetik içinde sallanarak 30 ° C 'de, maya soyu SEY6210 bir 20 ml sıvı kültür büyütünorta log fazı veya yaklaşık 0.6-0.7, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar ortam.
      Not: Bu 3 H myo -inositol dahil edilmesini etkileyebilir olarak YPD ortamları kullanmayın. Bu kültür boyutu 2-3 HPLC çalışmaları için yeterli malzeme temin etmelidir.
    2. Maya hücrelerinin 10-14 OD toplam pelet 12 ml 5 dakika yuvarlak tabanlı tüp 800 x g'de santrifüj ile (OD 600 = 1 olan 1 ml kültür ~ 1x10 7 hücreleri ihtiva etmesi gerekir). Inositolsüz ortama (IFM) 2 ml yeniden süspanse edin (IFM bileşim için tablo 1 e bakınız).
    3. Santrifüj tekrarlayın ve medya aspire. IFM 440 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    4. Her bir örnek için 3 H, miyo -inositol (1 ul = 1 uCi) 60 ul ekle ve sürekli çalkalanarak 1 ila 3 saat boyunca 30 ° C'de artan sıcaklığında inkübe edin.
      Dikkat: 3 H myo -inositol radyoaktif bir arkadaşıUygun eğitimden sonra ele alınmalıdır riyali. Buna ek olarak, 3H-içeren malzeme ile temas tüm sarf uygun şekilde atılmalıdır ve radyoaktif atık madde olarak belirlenmiş.
      Not: büyüme sıcaklığı değiştirilebilir olduğu sürece, tüm suşlar aynı sıcaklıkta büyütülür karşılaştırılabilir şekilde gerektiği gibi.
    5. % 9 perklorik asit 500 ul ve asit 200 ul içeren bir mikrosantrifüj tüp hücre süspansiyonu (500 ul) aktarın cam boncuk yıkanır. Ters çevirme ile karıştırın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
    6. 10 dakika boyunca en yüksek hızda örnek Vortex ve cam boncuk önlemek için bir jel yükleme ucunu kullanarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne lizatları aktarın.
    7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de örnek Pelet ve süpernatan aspire.
    8. Buz soğukluğunda 100 mM EDTA, 1 ml banyo sonikasyon ile pelletini. Daha önce olduğu gibi yine pelet.
  2. Deaçillendirme ve çıkarma
    1. Taze 2,3 ml metanol, 40% metilamin 1,3 mi, 1-butanol 0.55 ml su, 0.80 ml birleştirerek deasilasyon reaktifi 5,0 ml hazırlar. Karıştırmak için ters çevirin.
    2. EDTA aspire su 50 ul pelet sonikasyon.
    3. Deasilasyon reaktif 500 ul ekleyin ve karıştırın ses dalgalarına maruz. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. Isı bloğu 53 ° C'de 50 dakika boyunca ısı lipidleri bulunmaktadır. 3 saat ya da O / N üzerinde vakum santrifüj tamamen örnekleri kurulayın.
      1. Kimyasal tuzak vakum santrifüj ve havanın girmesini buharları engellemek için vakum pompası arasına yüklü olduğundan emin olun.
    5. Banyo sonikasyon ile suyun 300 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 3 saat ya da O / N vakum santrifüj örnekleri kurulayın. Bir kez daha bu adımı yineleyin.
    6. Su 450 ul ile pelet sonikasyon. Bu ekstraksiyon sırasında sulu bir fazdır.
    7. Taze extractio 10 ml hazırlamak8,0 etil eter 1-bütanol ml, 1.6 ml etil format içinde 0,40 ml ekleyerek n reajanı. Karıştırmak için ters çevirin.
    8. Sulu faza ekstre edici reaktif 300 ul ekle. Vorteks 5 dakika boyunca en yüksek hızda karışım, ve 2 dakika boyunca en yüksek hızda (18,000 xg) santrifüj ile tabakalar ayrılır.
    9. Üst organik katman, arayüz ve pelet kaçınarak yeni bir mikrofüj tüpü içine alttaki sulu tabakayı toplayın. Taze bir ekstraksiyon reaktifi ile, iki kez daha sulu fazın ekstraksiyonu tekrarlayın.
    10. Tamamen vakum santrifüj ile toplanır, sulu tabaka kurutulur. Banyo sonikasyon ile su 50 ul pelet dağıtılır.
    11. Bir 6 ml polietilen parıldamalı cam şişe içine sintilasyon sıvısı 4 ml Her numunenin 2 ul ekleyin. Açık bir pencere kullanılarak sıvı titreşimi ile her bir numunede (CPM olarak) sayımının sayısını belirler.
    12. HPLC için hazır olana kadar -20 ° C'de örnekleri saklayın.
  3. AyırmaHPLC ile 3 'H-glisero-inositides
    1. Gaz alma, ardından bir şişe en 0,22 um vakum filtresi ile ultra saf su 1 L filtre edilerek A tamponu hazırlayın.
    2. Su içinde 1 M amonyum fosfat dibazik (APS, MW 132,06) içindeki bir 1 L çözelti yaparak tampon B hazırlayın ve fosforik asit ile 3.8 pH ayarlamak. Gaz alma tarafından izlenen bir şişe üst 0.22 mikron vakum filtresi ile amonyum fosfat Filtre.
    3. Yaylı 250 ul küçük hacimli eki Şişeyi ml bir 2 donatım enjeksiyon flakon birleştirin. 10000000 'yi yükleyin ve 55 ul toplam hacim su ilave edilir. Su 55 ul boş şişe hazırlayın.
    4. PTFE / silikon septa ile donatılmış vidalı kapaklı şişeleri (kırmızı yan şişenin içine bakan) Cap. Boş flakon ile başlayan HPLC otomatik örnekleme tepsiye her flakon yerleştirin.
    5. Tampon akışını kontrol tamponlar ve kontroller numune Injecti gazı giderildi bir HPLC ve ilgili yazılımını kullanınüzerinde. Scintillant akış hızını düzenleyen bir çevrimiçi akış sintilatör ve ilişkili yazılımı kullanın ve 3 H-çürüme sinyalini izlemek için.
      1. 250 mm x 4,6 mm boyutlarında ve HPLC 5 um silika reçine ihtiva eden bir SAX sıvı kromatografi sütunu kullanın. Kirleticilerin enjeksiyon önlemek için bir sütun bekçi ile sütun kıyafeti.
      2. Akış sintilatör bir 3 'H-uyumlu bir 500 ul akış hücresi takın.
        Not: Fraksiyonasyon Chemstation yazılımı ile ya da başka ticari olarak temin edilebilir HPLC sistemi ile kontrol edilen bir Agilent 1200 serisi HPLC sistemi sonsuz ile yapılabilir. HPLC yıkama sıvısı akışı sintilasyon Laura yazılım veya başka bir ticari olarak kullanılabilir akış sintilatör veya uyumlu yazılımı tarafından kontrol edilen bir β-RAM akış sintilatör ile yapılabilir.
    6. % 100 tampon A ile 1.0 ml / dk'lık bir akış oranında, kuaterner pompa başlatma
    7. HPLC bir dengeleme profili kurmak5 için 5 dakika, 100-1% B için 5 dakika,% 100 B için 5 dakika, 1-100% B% 1 Tampon B: Tampon A ve B degrade ("A dengeleme Protokolü" diyorlar) kontrol etmek için dk, 20 dakika boyunca,% 1 B. 400 bar, 1.0 ml / dk bir akış oranında, 30 dakika çalışma süresi basınç limiti ayarlayın.
    8. Tamponlar A ve B degrade (bu "Protokol A" diyoruz) kontrol etmek için HPLC üzerinde bir elüsyon profili (Şekil 2) ayarlayın: 40 dakika 5 dakika,% 1-20 B için% 1 B,% 20-100 10 dakika boyunca 20 dakikada, 1% B 5 dakika,% B 100-1 10 dakika% 100 B B. 400 bar, 1.0 ml / dk bir akış oranında, 90 dakika çalışma süresi basınç limiti ayarlayın.
    9. Akış sintilatör bir algılama protokol 2.5 ml / dk'lık bir akış oranında sintilasyon sıvısı ve 8,57 saniye bekleme süresi ile, 60 dakika boyunca çalışması için (bu "Protokolü bir tarama" olarak adlandırır) ayarlayın.
    10. E, ardından su boş "Protokolün Bir denge" ile başlayan HPLC üzerinde otomatik bir enjeksiyon dizisi Programıach "Protokol A" konulu örneği radiolabelled. Hazır olduğunuzda dizisi başlatılamıyor.
    11. Çalışma dengeleme protokolü hala iken, numunelerin ölçmek için akış sintilatöre bir toplu oluşturmak "Protokolün A algılama." Başlamak için akış sintilatör tetikleme yaparken her yeni numune enjeksiyon HPLC "Protokol A" başlatmak olacaktır "Bir algılama Protokolü."
    12. Bütün çalışmalarda tamamlanmasından sonra, HPLC, kolon temizleme ve 1.0 ml / dk bir akış oranında 30 dakika boyunca% 100 Tampon A ile sintilatör akar.
  4. Veri analizi
    1. Laura yazılımı veya kromatografi spektrumları ölçmek için başka bir yazılım kullanın. Bu bölümde tarif edilen adım, Şekil 3 'de gösterilmiştir.
    2. "Dosya", "Aç" tıklayarak dosyaları açmak ve her numune için ham veri dosyasını seçin.
    3. "Kromatogramları" sekmesinde, zoom de daha az zirveleri (1000 sayımı [y ekseni]) saat çözünürlüğü koruyarak her germek için. Gerekirse, her bir zirve içine büyüt.
    4. "Yatırım getirisi Ekle" aracını kullanarak analiz zirvelerin her vurgulayın. (4,5 29 dakika ile 20 dakika, Gro-Ins (3,5) P 2 18 dakika, Gro-Ins4P 10 dakika, Gro-Ins3P de Ebeveyn Gro-ins ve Gro-In: elüsyon zaman doruklarına tespit 32 dk) P 2.
    5. "Bölgeler tabloları" sekmesinde, her tepe "alanına (sayar)" kaydedin. Zamanı ve "end (mm: ss)" Her tepe zamanı: "(ss mm) başlatın" unutmayın.
    6. Arka plan çıkarma için aynı süreyi kapsayan zirveye bitişik bir bölge vurgulayın. Karşılık gelen tepe noktasından sayıyı çıkarın.
    7. ("Toplam PtdIns% 'si" olarak ifade edilen) ebeveyn Gro-Ins karşı her tepe alanını Normale. Ardından, "n olarak ifade kontrolü duruma karşı her deneysel koşul (piklerin her normalleştirmekkat artış) "kontrol grubuna göre.
      Not: her bir tepe noktasının normalizasyonu aynı zamanda toplam sayısı ile de yapılabilir, ancak ebeveyn Gro-Ins çok daha bol diğer PtdInsPs daha çünkü benzer sonuçlar elde olma eğilimindedir.
    8. "... Olarak kaydet", "Dosya" düğmesine basarak kromatografları için veri ihracat ve tercih dosya biçimi "CSV (virgülle ayrılmış)". Bir tablo üzerinde veri arsa ve gerektiğinde sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemi kullanarak, maya PtdInsPs metabolik 3H-miyo -inositol ile etiketlenmiştir. Etiketlemeden sonra, fosfolipid fosfolipid Deaçillendirme ve suda çözülebilen Gro-InsPs (Şekil 1) ekstre, perklorik asit ile çöktürülmüştür. Bu aşamada, bu PtdIns gibi, çok düşük yoğunluklu PtdInsPs için yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için sıvı skintilasyonu ile ekstre Gro-InsPs ile ilişkili toplam radyoaktif sinyal ölçmek için önemlidir (3,5) P2;

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale mayadan HPLC-birleştiğinde akış skintilasyonu ile PtdnsPs hücresel seviyelerini ölçmek için gerekli olan deneysel protokol ayrıntıları. Yöntem, lipid işleme ve suda-çözünür, 3H-Gro-InsPs, HPLC ile ayrılması ve analiz ekstre 3H-miyo -inositol sahip PtdInsPs, metabolik etiketleme sağlar. PtdIns (3,5), yabani tip, vac14 D ve D atg18 Maya hücreleri (Şekil 4) 'de p 2 için gösterildiği gibi, bu yöntem kullanılarak, çeşitli koşullar altı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.Y.H., Ontario Hükümeti'nden bir Ontario Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu makale, R.J.B. tarafından Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada Araştırma Kürsüsleri Programı ve Ryerson Üniversitesi'nden sağlanan fonlarla mümkün olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-BütanolBiyotemelBC1800Reaktif sınıfı
Amonyum fosfat dibazikBioshopAPD001ACS sınıfı
Amonyum sülfatBiyobazikADB0060Ultra Saf sınıf
Otomatik ÖrnekleyiciAgilentG1329BAgilent 1260 sonsuzluk serisi
BiotinSigmaB4501
Borik asitBiyotemelBB0044Moleküler biyoloji sınıfı
Kalsiyum KlorürBiyotemelCT1330Susuz, endüstriyel sınıf
Kalsiyum pantotenatSigmaC8731
Bakır (II) sülfatSigma451657Susuz
D-Glikoz BiyotemelGB0219Susuz, biyoteknoloji sınıfı
Dulbecco'nun modifikasyonu Eagle's Medium Life11995-0654.5 g/L glikoz, 110 mg/L piruat, L-glutamin
Dulbecco'nun Eagle's MediumMP biyomedikallerinin modifikasyonu0916429 4,5 g/L glikoz ile, L-gluatmin olmadan, inositol olmadan
EDTABiobasicEB0107Asitsiz, ultra saf dereceli
Etil eterCaledon labs1/10/4700Susuz, reaktif sınıfı
Etil formatSigma112682Reaktif sınıfı
Fetal sığır serumuWisent080-450ABD kökenli, üstün kaliteli, ısıyla inaktive
Fetal Sığır Serumu, DiyalizÖmrü26400044ABD menşei
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Akış sintilasyonu için sintilasyon sıvısı 
Folik asitBiyobazikFB0466USP sınıfı
HEPES tampon çözeltisiÖmür156300801 M çözelti
İnositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 etanolden suya
İnsülin-Transferrin-Selenyum-EtanolaminLife51500056100x çözelti
Demir(III) klorürSigma157740Reaktif sınıf
Laura - Kromatografi veri toplama ve analiz yazılımıLabLogic Systems LtdSürüm 4.2.1.18Akış sintilatör yazılımı
L-glutaminSigmaG7513200  mM, çözelti, steril filtreli, BioXtra, hücre kültürü için uygun
Magnezyum KlorürSigmaM8266Susuz
Manganez sülfatBiyotemelMB0334Monohidrat, ACS sınıfı
MetanolCaledon laboratuvarları6701-7-40HPLC Sınıfı
Metilamin çözeltisiSigma426466%40 (h/h)
Monopotasyum fosfatBiyotemelPB0445Susuz, ACS sınıfı
Nikotinik asitBiyobazikNB0660Reaktif sınıfı
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC yazılımı
p-aminobenzoik asit (PABA)BioshopPAB001.100Serbest asit
Penisilin-StreptomisinSigmaP4333100X, sıvı, stabilize, steril filtreli, hücre kültürü test edilmiş
Perklorik asitSigma244252ACS reaktifi, %70
PhenoSpher SAX sütunuPhenomenex00G-315-E05 & mikro; m, 80 Å, 250 x 4,6 mm
Fosforik asitCaledon labs1/29/8425Reaktif sınıfı
Potasyum KlorürBiyobazikPB0440ACS sınıfı
Potasyum iyodürBiyotemelPB0443ACS sınıfı
Piridoksin hidroklorürSigmaP9755
Kuaterner pompaAgilentG1311CAgilent 1260 sonsuzluk serisi
RiboflavinBioshopRIB333.100USP sınıfı
Sodyum KlorürBiyotemelDB0483Biyoteknoloji sınıfı
Sodyum molibdatSigma243655
Termostatlı Kolon BölmesiAgilentG1316AAgilent 1260 sonsuzluk serisi
Tiamin hidroklorürSigmaT4625Reaktif sınıfı; % 0.02 (a / h) çözelti yapın, bir süspansiyon oluşturur. Alikotları karıştırın ve dondurun
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Sıvı sintilasyon sayımı için sintilasyon kokteyli
Çinko sülfatBiyotemelZB2906Heptahidrat, reaktif sınıfı
ve beta;-RAM 4IN/US sistemleriModel 4Akış sintilatörü - 500 ve mikro; l akış hücresi; alternatif Radyomatik Akış Sintilatör Analizörü Perkin Elmer tarafından nbsp;
edilmiş

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

İlgili makaleler