Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Özet

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Özet

Son yıllarda, primer kirpikler çok sayıda sinyal yolunu etkileyerek gelişim ve hastalıkta anahtar düzenleyiciler olarak ortaya çıkmıştır. Siliyer fonksiyonla ilişkili olduğu gösterilen en eski sinyal yollarından biri, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyali olarak da adlandırılan kanonik olmayan Wnt sinyal yoluydu. Omurgalı gelişimi sırasında düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyallemesinin etkilerini incelemek için en iyi yerlerden biri memeli kokleasıdır. Fare kokleasındaki PCP sinyal bozulması, tümü silia disfonksiyonundan etkilenen koklear büyümeyi, hücresel modellemeyi ve tüy hücresi oryantasyonunu bozar. Bu protokolün amacı, gelişmekte olan memeli kokleasında PCP sinyalizasyonunun fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analizini tanımlamaktır. Yakınsama ve ekstansiyondaki kusurlar, koklear kanalın kısalması ve/veya hücresel paternlemedeki değişiklikler olarak kendini gösterir ve bu, gelişmekte olan fare mutantlarından diseksiyon sonrasında ölçülebilir. Stereosiliyer demet oryantasyonu ve kinocilia uzunluğu veya pozisyonundaki değişiklikler, immünofloresan veya taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak gözlemlenebilir ve ölçülebilir. Siliyer proteinlerin hücresel sinyal yolaklarındaki ve diğer biyolojik olaylardaki rolüne ilişkin daha derin bir kavrayış, hücresel ve gelişimsel biyolojiyi anlamamızın yanı sıra hedefe yönelik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Giriş

Birincil kirpikler birçok memeli hücre yüzeyinden uzanan uzun bir mikrotübül göre uzantıları vardır. Birincil kirpikler sıklıkla hangi zaman hücre başına birden fazla var, hareketli kirpikler ile karıştırılmamalıdır ve Amacı membran yüzeyleri boyunca sıvıyı taşımak için vardır. Birincil sil, aksine, duyu rol kabul eder ve buna bağlı olarak aynı zamanda, duyusal kirpikler adlandırılır. Bir kez çoktan unutulmuş, bu organel son zamanlarda insan genetik hastalıklar ¹ çok sayıda ile dernek sonucunda 'yeniden keşfedilen' olmuştur. İdeal bir sinyal organel olarak konumlandırılmış, birincil kirpik sayısız sinyal doku homeostazında ve hastalık değil, sadece önemli olan birçok yollar, aynı zamanda gelişim ² sırasında düzenleyen gösterilmiştir.

kirpikler fonksiyon bozukluğu ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir birinci sinyal yollarının bir düzlemsel hücre polarite (PCP) yol olarak da bilinen standart olmayan Wnt oldu > 3. Başlangıçta Drosophila tanımlanan bu sinyal çağlayan, embriyogenez için kritik öneme sahiptir; yakınsama ve uzatma işlemleri için özellikle ve epitel ⁴ düzleminde hücrelerin doğru yönlendirmesi için. Düzenleyici proteinler kümesi çekirdeğin sıralı sinyal sonuçta hücre iskeleti düzenlenmeleri yol açabilir ve bir düzlemde ⁵ epitel hücrelerinin koordine polarizasyon neden yönlü ipuçları çevirir. Yakınsama ve uzatma işlemi kesinlikle uzamasına koklear kanal ve doğru hücresel desenlendirme ⁶ için gereklidir. Bu PCP yolunun aktivasyonu yoluyla düzenlenir olarak, koklea PCP mutantlar en çarpıcı fenotipleri bir dağınık duyusal epitel ⁷ kısaltılmış koklear kanal olduğunu. Düzenlenir bu aydınlatılamamıştır gerekmektedir tam olarak nasıl olsa Benzer şekilde, aynı zamanda, kirpikler eksikliği fare mutantlar, böyle bir yakınsama ve uzatma fenotip ^8,9 sergilerler.

yakınsama ve uzatma işlemleri koklear kanalın akıbet ve koklear kanal içinde duyusal epitel hücre desenlendirme için kritik olduğundan ve_content ">, gelişmekte olan koklea omurgalı gelişimi sırasında PCP sinyalizasyon incelemek için ideal bir organdır. organı Corti, koklear kanal, muntazam ¹⁰ çalışması kokleadaki için yönelik olmalıdır olmayan duyu destek hücreleri ve mechanosensory saç hücrelerinin oluşur hatları uzman duyusal epiteline verilen terim. mechanosensory saç hücreleri yani çünkü denir cuticular plaka uzanan stereociliary demetleri her duyusal saç ^hücre 11 (apikal yüzeyi). mechanosensation ve stereocilia olarak adlandırılması rağmen birincil dönüştürücüler gibi bu hareket, aslında modifiye aktin filament esaslı mikrovilluslar oluşmaktadır. her zikzak şeklinde saçlar içinde demet, stereocilia üç satır bir çok sipariş edilen ve düzenli pa düzenlenirBir merdiven durumda benzeri şekilde ttern. Gerçek mikrotübül göre sil, olarak adlandırılan kinocilia, stereociliary demetlerin ¹² geliştirilmesi ve yönlendirme için gereklidir. her hücre üzerine tek kinocilium fiziksel stereocilia uzun satıra merkezi bitişik olarak bulunur stereocilia demetine takılır. Kinocilium kesin işlevi belirsizdir ve bir hipotez onlar mikrovillus ¹² olgun olarak kinocilium şekle stereocilia 'çeker' olmasıdır. Omurgalılarda, koklea kinocilia geçici de yer alır ve ^11,13,14 işitme başlangıcından önce farelerde saç hücrelerden geri.

Ciddi kısaltılmış koklear kanallarda gelişen koklea sonuçlarında kirpikler tamamen kaybedilmesi yanlış oluşmuş ve stereociliary demetleri yanı sıra yanlış yerleştirilmiş bazal organları ^8,9 mis odaklı. Fonksiyonel kirpik sadece siliyer aksonem oluşan değildir. cilia ile ilgili birçok proteinfonksiyonu, bazal vücut geçiş bölgesi ya da silier aksonem ¹⁵ olarak kirpikler-ilişkili alt etki alanları lokalize kompleksleri meydana gelir. sentrozom annesi centriole türetilen bazal vücut, hücre vücuda uzak cilium uzanan mikrotübüller için mikrotübül organize merkezidir ve hücre içi ticaretini yanı sıra siliyer ticaretini düzenleyen. Siliyer geçiş zonu siliyer fonksiyon siliyer bileşiklerinin ¹⁶ ithalat ve ihracat organize bakımından düzenlenmiştir başka bölgedir.

Kesin mekanizması ¹⁷ belirsiz olmasına rağmen birçok çalışma, kirpikler ve kurallı olmayan Wnt (PCP sinyal) arasında bir bağlantı tespit ettik. Silier ve PCP genlerinin yedekleme ve genelleştirilmiş hücresel anormallikler hücre polarite duyarlılığı, zor doğrudan PCP özgü açıkları bir mutasyon bağlantı yapmak. PCP sinyalizasyon okuma çıkışları biri bazal vücut ve Primar konumlandırma olduğunuy kirpik, bu nedenle ikincil kusurları birincil yavru zordur. Zebra balığı ve fare mutantlar Bazı çalışmalar ^18-20 sinyalizasyon kirpikler ve Wnt arasında bir bağlantı olduğunu ileri sürmüştür. verilerdeki Farklılıklar türler, doku ya da Wnt sinyal yolunda siliyer katkıları temporal bağımlı farklılıkları yansıtıyor olabilir. bazal organları işlevsel kalır Ayrıca, eğer normal bir Wnt yanıt muhafaza edilebilir. hücresel sinyal yolları ve diğer biyolojik olayların içinde siliyer proteinlerinin rolü daha derin bir anlayış bizim hücresel ve gelişimsel biyoloji anlayışı yanı sıra hedeflenen tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için için çok önemlidir.

Protokol

Kullanın ve en yaygın CO ₂ inhalasyon ve servikal dislokasyon yoluyla kurumsal ve toplum kurallarına ve yönetmeliklere uygun olarak tüm hayvanları euthanize.

Reaktiflerin 1. Hazırlık

NOT: Ön başına, analitik dereceli kimyasallar kullanarak tüm reaktifler hazırlamak. Aksi belirtilmediği sürece distile moleküler sınıf ve deiyonize su kullanarak çözümler olun.

1. Fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS): _H2O, 1 L PO ₄ 8g NaCI, 0.2 g KCI, 1.44 g _Na 2 HPO ₄ ve 0.24 g KH ₂ eritilerek 1x PBS 1 L yapmak HCI ile pH 7.4 ayarlayın. PBS steril olması gerekmez ve oda sıcaklığında saklanabilir. Bu tampon _CaCI2 ya _MgCl2 olmadan unutmayın.
2. Paraformaldehit (% 4 PFA) bir havalandırılan bir duman başlığı içinde 1x PBS PFA bir% 4 çözelti hazırlayın. 1x PBS 1 L paraformaldehid tozu 40g ekleyin. C yaklaşık 60 °, heyecan ve ısı çözmek için,ve yavaş yavaş NaOH pH değerini yükseltmek için damla damla ekleyin. Toz çözündükten sonra, HCI ile pH 7.4 yeniden ayarlayın. 0.45 um'lik bir filtreden filtre edin ve alikotları dondurma. her bir deney için taze bir kısım defrost.
3. Triton tamponu: 0.1 M Tris-HCl hazırlama (pH 7.5), 0.15 M NaCl, 0.1 M Tris-HCI (pH 7.5), 1 L 8.77 g NaCl çözülmesiyle% 0.1 Triton X-100 çözeltisi. 1 ml Triton X-100 ilave edin. eritmek için karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın Triton tampon.
4. Triton bloğu: Triton tamponu 9 ml keçi serumu ile 1 ml ekleyerek Triton tamponu içinde% 10 keçi serumu hazırlayın. 4 ° C'de saklayın. engelleme adım için Triton bloğu 200'de 1 dilusyondaki anti-fare IgG Fab parçalayan keçi ekleyin fare kaldırdı birincil antikorlar kullanılarak edin.
   NOT: planlama taramalı elektron mikroskobu (SEM) için örnekler kullanmak durumunda aşağıda listelendiği gibi ek reaktifler hazırlamak.
5. kalsiyum ve magnezyum ile Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), bir stok çözeltiden seyreltilmesi ile HBSS 1x çözeltisi yapmaksteril damıtılmış _H2O içinde HBSS tampon yapmak için karmaşık ve riskleri vardır gibi, bir premade 10x stok solüsyonu sipariş tavsiye edilir. Rutin olarak kullanılan tampon HBBS nihai konsantrasyonu, aşağıdaki gibidir: 1.26 _mM CaCl2, 0.49 _mM MgCl2 -6H2O, 0.41 mM MgSO ₄ -7H2O, 5.33 mM KCI, 0.44 mM KH _{2 PO 4,} 4.17 mM NaHCO _3, 137,93 mM NaCI , 0.34 mM _Na 2 HPO _4, 5.56 mM dekstroz.
6. Hepes tamponu: 1 L 1 x HBSS tamponu içinde 23.8 g HEPES çözülmesiyle, 1x HBSS 0.1 M Hepes çözeltisi hazırlayın.
7. Taramalı elektron mikroskopisi fiksatif (SEM ayarı): Hepes tampon maddesi içinde elektron mikroskobu notu glutaraldehit (% 2.5) ve paraformaldehit (% 4) seyreltilmesi ile SEM fiksatif hazırlayın. 10 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar _CaCl2 ekleyin.
8. % 1 osmiyum tetroksit (OsO ₄₎ Hepes tampon içinde; % 1 osmiyum tetroksit su: Hepes tampon maddesi içinde ozmiyum tetroksit stok çözeltisi ile seyreltilir ve separatelSteril y% 1 bir son konsantrasyona kadar, O _H2 damıtıldı. Osmiyum tetroksit çok zehirlidir ve en yaygın olarak% 4 çözeltisi olarak satılmaktadır.
9. (Ağırlık / hacim) tannik asit,% 1: 50 ml 0.5 g tannik asit çözündürülür steril damıtılmış _H2O Filtre 0.45 gözenek boyutu filtre içinden filtre ederek sterilize edin.
10. Dereceli etanol çözeltisi seriye ait: 30, 50, 70, 90 ve% 95 etanol solüsyonlar yapmak üzere steril damıtık _H2O ile 200 derece etanol ile seyreltilir. son etanol durulama için,% 100 etanol 200 derece gereklidir. Nihai durulama için 200 derece etanol taze açılmış şişe kullanın.

Doku 2. Choice

1. İdeal olarak, embriyonik gün 16.5 (E16.5) ve doğum sonrası 3. günde (P3) yaşları arasındaki embriyo ya da genç yavrular inceleyin.
   NOT: kemikli labirent ve temporal kemiklerin kemikleşme fareler olgun olarak diseksiyonu giderek daha zorlu hale getirir. Ayrıca kinocilia, tek gerçek mikrotübül tabanlı kirpik, koklear saç hücreleri üzerinde bulunangelişimi sırasında geri çekilir ve bundan sonra, yetişkin farelerde bulunur.
2. Tespit edildikten sonra, decalcify yetişkin cochleae. Dönme 4 gün - 3 mikrosantrifüj tüpü içinde, 2 ml EDTA (PBS içinde% 4.13), pH 7.3 içinde (bölüm 3) kemik labirenti, kesilerek bir yer. Günlük EDTA yenileyin. dokular yumuşatılmış sonra artan çalkalama ile nutator 5 dakika boyunca 1.5 ml ya da daha fazla PBS 3 kez yıkayın.

3. Cochlea Diseksiyon

1. Servikal dislokasyon veya CO ₂ inhalasyon yoluyla Gönder euthanization (% 100 CO _2), baş kaldırmak. burun başlayan ve kaudal uzanan sagital orta hat boyunca baş incelemek için, hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak, bir makas neşter bıçak ya da küçük bir çift kullanın. Forseps bir çift ile kafatası her yarısından itibaren beyin çıkarın. Iç kulağın gelişen kemik labirentler ihtiva zamansal kemikler, tespit (Şekil 1A ok bakınız).
2. için bir çift kullanınceps dikkatlice kafatası (temporal kemik) den kemik labirentler izole etmek. bir mikroskop altında bunu yapın. kemik labirentler altında hafifçe forseps çalıştırarak kafatası kemik doku uzak bastırınız. yukarı P4 hayvanlarda kemik labirentler hala kıkırdak ve kolayca bozmadan çıkartılabilir.
3. diseksiyon ardından, oval ve yuvarlak pencereler temizlemek ve koklear spiral tepesinde küçük bir delik yapmak için diseksiyon forseps ucunu kullanın. Koklear kanal daha diseksiyonu önce kemik labirentler sabitleyin. (3.7 bakınız) örtü oluşturan membran kolay çıkartılması için izin vermek için, buz üzerinde 5 dakika boyunca 1.5 ml% 4 PFA kemik labirentler düzeltin.
   NOT: örtü oluşturan membranın çıkarılması gerekli değilse, daha uzun fiksasyon (bakınız 4.1 - 4.3) tavsiye edilir. önce koklear kanal diseksiyon temporal kemiklerin kısa sabitleme diseksiyonu süreci ve örtü oluşturan membran kaldırılmasını yardımcı olur. Mesaj diseksiyon ve Corti organı maruz kalma, furtOnun tespit gereklidir.
4. Dahası aşağıdaki gibi koklear duyusal epitel maruz kemik labirentler teşrih. diseksiyon kolaylaştırmak için PBS içeren siyah silikon Elastomer kaplı diseksiyon çanak kemik labirentler yerleştirin. Gerekirse doku hareketsiz kılınması için minutien işaretçilerini kullanın. minutien işaretçilerine kullanmak için, yukarı bakacak şekilde koklear spiral ventral yönü ile kemik labirentler vestibüler bölümü boyunca koyun.
   NOT: Siyah silikon Elastomer çanak: opak siyah renk elde etmek için toz kömür ile silikon Elastomer taban bileşeni karıştırın. sertleştiriciyi ve bir ya da daha fazla Petri kutularına (cam veya plastik) dökün. vakum altında kuru hava kabarcığı kaldırmak için. Kuru yemekler kullanımı tamamen önce.
5. ince forseps (# 5) koklear kanal açığa dış kıkırdak kaldırmak için kullanın. oval pencereye başlayın; oval pencere içine forseps alt ucu yerleştirin ve yavaşça yavaşça doğru yukarı hareket, kıkırdak açmak gözetlemektepesi.
6. koklear kanalın maruz kaldıktan sonra, ventral yüzeyi, Reissner en membran kaldırmak. Koklear kanal dibinde Reissner en membran çimdik ve yukarı hareket onu kalkmasına forseps iyi bir çift kullanın. duyusal epiteli de dahil olmak üzere, koklear kanal dorsal yönünü gözünüzde canlandırın.
7. (Isteğe bağlı), aşağıda tarif edildiği gibi örtü oluşturan membran çıkarın. SEM veya kinocilium bir immünohistokimya veya stereociliary demetleri örtü oluşturan membran kaldırmak.
8. koklea dibinde örtü oluşturan membran çimdik ve apeks doğru yukarı soyma forseps (55. veya daha ince) bir çok ince çifti kullanın.
   NOT: örtü oluşturan zar zor tespit kılan optik açıktır. Çoğu zaman daha fazla zar tek parça halinde çıkıyor ve kolayca görüntülenmiştir olmamasına rağmen o Corti maruz organ çıkardı olarak, bir direnç hissedebilirsiniz.
9. Corti organı açığa sonra, daha fazla d olarak doku çözmekAşağıda escribed. Dokuların daha fazla hazırlanmasına yardımcı olmak için vestibüler bölgeyi saklayın.

4. Sabitleme

1. Düzenli immünohistokimya için 2 saat süreyle bir nutator 4 ° C'de 1.5 ml% 4 PFA disseke kemik labirentler düzeltmek.
   NOT: uzunluk ve tespitin bileşimde antikor ve antijenler, varyasyonları, farklı hassasiyet gerekli olabilir ve her bir antikor için optimize edilmelidir.
2. Tespit edildikten sonra, yüksek çalkalama ile nutator 5 dakika boyunca 1.5 ml ya da daha fazla PBS 3 kez durulayarak örnekleri yıkayın. Örnekler işleme önce birkaç hafta boyunca 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir.
3. SEM için numune hazırlanması durumunda, oda sıcaklığında 2 saat (1.7 bakınız) SEM düzeltme zamansal kemikler disseke düzeltme. 1.5 ml ya da daha fazla Hepes tamponu artan çalkalama ile nutator 5 dakika boyunca 3 kez durulama ile yıkayın. daha sonra işlenene kadar 4 ° C'de Hepes tamponu içinde depolayın. Haftanın daha uzun bir çift için depolamas tavsiye edilmez.

5. İmmünhistokimya

1. Düz dipli, 96 gözlü plakanın bir kuyuda parçalara örnekler üzerinde immünohistokimya gerçekleştirin. Alternatif olarak, bir PCR veya ependorf tüp kullanın. Işleme kolaylaştırmak için kemik labirent vestibüler bölümünü korumak için tavsiye edilir.
2. yumuşak çalkalama ile nutator oda sıcaklığında 1 saat için 1.5 ml Triton tamponu içinde inkübe edilerek doku geçirgenliği.
3. Oda sıcaklığında 1 saat, en az 0.5 ml Triton bloğunda inkübe edilerek doku bloğu. Fare büyüdü birincil antikorlar kullanılarak ise 200'de 1 dilusyondaki (bölüm 1.4) de blok anti-fare IgG Fab fragmanları ekleyin. Bu büyük ölçüde farede anti-fare IgG'nin spesifik olmayan bağlanmayı azaltır.
4. yavaşça sallanarak 4 ° C'de Triton blok O / N seyreltilmiş primer antikorlar ile doku inkübe edin. Antikor seyreltme kullanılan antikorların (bakınız bölüm 6.1) bağlıdır. Alternatif birincil Antikorların inkübeOda sıcaklığında 2 saat süre ile s. İdeal olarak, 0.5 mi, birincil antikor seyreltme minimum hacmi kullanın. Antikor sınırlı ise, tamamen dokuyu saran antikor seyreltme küçük hacmi kullanın.
5. artan çalkalama ile nutator, 1.5 ml ya da daha fazla Triton tamponu, 15 dakika boyunca 3 kez en az durulayarak doku yıkayın.
6. üreticileri seyreltilmiş fluoresan boya-konjüge edilmiş ikincil antikor ile inkübe doku (tipik olarak 1: 200-1: 1000) konsantrasyonu tavsiye Triton blok bir nutator oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. 0.5 mL ikincil antikor seyreltme minimum hacmi kullanın.
   1. 3 dakika önce ikincil antikor agrega spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için kullanmak için 13,000 xg seyreltilmiş sekonder antikor santrifüjleyin. floresan boyalar photobleaching önlemek için itibaren bu adımdan ışıktan doku koruyun.
7. Aşama 5.5 gibi, üzerinde 15 dakika süre ile 1.5 ml ya da daha fazla Triton tamponu, 3 kez en az durulayarak doku yıkamayüksek çalkalama ile Nutator. hazır olana kadar 4 ° C'de PBS içinde mağazası örnekleri monte edin.

6. Antikor seçimi

NOT: Tavsiye edilen antikorlar ve bunların dilüsyonları kaynağı Özgü Malzeme ve Ekipman tabloda listelenmiştir. bölüm 5'de tarif edilen gibi antikor inkubasyon gerçekleştirin.

1. ya da anti-asetillenmiş-α-tubulin (1: 800): mikrotübül göre kinocilium görselleştirmek için, örneğin anti-Arl13b (1.000 1) gibi bir siliyer aksonem işaretleyiciyi kullanın. (200 1) ya da başka bir centrosomal işaretleyici γ-tubulin karşı bir antikor kullanılarak bazal vücut görselleştirme.
2. sekonder antikor inkübasyon için birkaç farklı fluorophores birine konjuge: - (1.000 300 1) aktin filament zengin stereociliary demetleri görselleştirmek için, Phalloidin ekleyin. Falloidin, her bir epitel kılı hücresinin çevresini çevreleyen kortikal aktin filamentler de dahil olmak üzere, diğer lifli aktin yapıları etiketler. Bu belirlemede yardımcı olurHer saç hücresinin anahat. Eğer gerekirse: anti-ZO-1 (1: 500) gibi alternatif bir membran işaretleyiciyi kullanın.
3. veya Miyosin Vlla (1: 1000): Miyozin VI (1.000 1) karşı antikorlar kullanılarak koklear saç hücreleri etiketlemek. Bu koklea uzunluğu değerlendirilmesi durumunda kullanılabilir.

NOT: mikroskop gereksinimleri için optimize Kullanım uygun floresan boya-konjuge sekonder antikorlar.

7. Montaj ve Görüntüleme

1. PBS içeren siyah silikon Elastomer çanak örnek yerleştirin. Ince forseps kullanarak, koklear spiral vestibüler bölgeyi kaldırın.
2. Çok dikkatli koklear spiral altta yatan kıkırdak ve mezenşimi çıkarın. Kalan koklear spiral Corti ve dış sulkusta iç sulkus, org içerir.
3. bir mikroskop lameli üzerine konularak PBS bir damla halinde koklear spiral aktarın. İstenirse, bir dönüşe eşdeğer parçalar halinde koklear spiral ayırın. Bu adım, ancak gerekli değildir, ve l yol açabilirdoku OSS. koklear saç hücrelerinin apikal yüzeyi (stereocilia tarafı) lamel doğru yukarı bakacak şekilde olmalıdır.
4. epitel değiştirdi ve kendi üzerine örtüşür varsa Wick deplasmanda PBS filtre kağıdı bir adsorban doku veya parça ile ve yavaşça koklear spiral yeniden konumlandırmak.
5. doğrudan koklea numune üzerine montaj medya bir damla ekleyin ve hafifçe hava kabarcıklarını önlemek için özen, üstüne bir lamel yerleştirin. Hiçbir aralama gereklidir; numunenin doğrudan lamel yerleştirin. yerine lamel tutmak için ek adımlar gerektirmez bir suda çözünür olmayan, fluoresan, yarı kalıcı montaj orta önerilir. Montaj medya ve lamel kalınlığı özelliklere mikroskop uyumlu olmalıdır.
6. koklear saç hücresinin apikal yüzeyinde görüntülerini yakalamak için hedefleri -, yüksek sayısal açıklık (1.4 1.2) - yüksek büyütme (100X 63) ile donatılmış bir epifluorescent veya lazer tarama konfokal mikroskop kullanın. Kullanım lower hedefleri (5 - 20X) koklear kanal uzunluğunu ölçmek için koklear spiral görüntülerini üst üste çekmek için. ikincil antikorlar için kullanılan fluorophores için maç uyarma lazerler ve emisyon filtreler.

8. Taramalı Elektron Mikroskobu

1. Bölüm 4.3 devam edin. Hepes tamponunda SEM sabit örnekleri yıkadıktan sonra, havalandırma altında aşağıdaki adımları uygulayın. Aşağıdaki protokol koklea doku için iyi çalışır ve iletken bir metal ile saçma ile kaplamanın kullanılmasını önler.
2. Her biri 5 dakika için damıtılmış su, 1 ml 3 yıkama, ardından 1 saat Hepes tampon maddesi içinde% 1 OsO ₄ sonrası düzeltme. Tamamen doku güzelinden OSO ₄ küçük hacimli toksik atıkları en aza indirmek için kullanılmalıdır. Ajitasyon yok gereklidir.
3. adımlar arasında her biri 5 dakika için 1 ml distile su ile 3 yıkama ile, 1 saat boyunca, aşağıdaki çözeltiler her oda sıcaklığında inkübe edin:% 1 tannik asit, taze su ve fil yapılankullanımdan önce kayıt olmuş; Su içinde% 1 OsO _{4, su} içinde% 1 tanik asit, su içinde% 1 OsO _4.
4. 30, 50, 70, 90, ve% 95: Aşağıdaki seyreltileri, her 10 dakika için kuluçkalama ile sınıflandırılmış etanol serileri ile örnekleri kurutmak. Ajitasyon yok gereklidir.
5. (200 proof etanol yeni açılmış şişe)% 100 etanol içinde üç değişiklik, her biri 5 dakika, boyunca Aktarım örnekleri.
6. Üreticinin talimatları izleyerek kritik bir nokta kurutucu olsa örnekleri çalıştırın.
7. Bir elektron mikroskobu ile görüntüleme öncesi bir SEM kütüğü üzerine iletken karbon yapıştırıcı kullanılarak örnekleri monte edin. Bir stereomikroskop altında, yavaşça koklear epiteli yukarı bakacak şekilde örnek yerleştirmek için ince forseps ve bir fırça bir çift kullanın. 'Çapa' saplama doku numunenin vestibüler bölümünü kullanın. görüntüleme kadar desikatör saklayın örnekleri. (2012) ²¹ Jones tarif edildiği gibi SEM görüntü alma gerçekleştirin.

9.Niceleme

1. immünhistokimya hazırlanmasından sonra, bir epifluorescent veya lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak görüntüler elde. SEM için hazırlandıktan sonra, bir görüntü örnek için bir tarama elektron mikroskopu kullanın. Görüntü maruz koklear saç hücreleri ve araya destek hücreleri ile Corti organı apikal yüzey.
2. Koklear kanal boyunca taban gibi, 25, 50 ve% 75 spesifik konumlarını tanımlamak ve mutant ve kontrol numuneleri arasındaki koklea bölgelerini karşılaştırmak için bu kullanımı. Genetik arka planda farklılıklar koklear fenotip değiştirebilirsiniz olarak, analiz etmek ve onların yavru kontroller ile kirpikler mutantlar karşılaştırın.
   NOT: Corti organı apeks ve taban hem doğru orta tabanından uzanan bir degrade gelişir. Fare, gelişme P14 kadar tamamlanmış değil, bu yüzden benzer gelişim evreleri ve pozisyonlarda bölgeleri karşılaştırmak önemlidir.
3. allo mikroskop eşlik yazılımı kullanarak alın resimlerÖzellikle fenotip ölçümü için gerekli olan B (aşağıya bakınız). , Uzunlukları ölçmek hücrelerin sayısı ve aşağıda tarif edildiği gibi protein lokalizasyonu belirlemek için mikroskop eşlik böyle Görüntü J veya yazılım olarak görüntü analiz yazılımı kullanın. Grafik mutant vs kontrolü karşılaştıran bir çubuk grafik, scatter plot, kutu blot veya histogram gibi bu veriler.
4. Koklear kanal (Şekil 3A) toplam uzunluğu:
   1. (Stereociliary demetleri işaretler) saç hücresi işaretleyici veya Phalloidin kullanarak, belirlemek ve duyusal epitel başlar ve biter nerede ölçün. koklear kanal uzunluğu genellikle kirpikler mutant kısaltılır.
5. Stereociliary demeti anormallikleri (Şekil 3B, D, E, G):
   1. Demetin tepe ve Şekil 3G de gösterildiği gibi paket 'kol' her iki ucundan dışarıya uzanan çizgi arasındaki en kısa mesafe olarak paket konveksliğini (yükseklik) ölçün, sol. Alternatif olarak, bölgeyi ölçmekDoğru, Şekil 3G de gösterildiği gibi, dış saç hücre stereociliary demeti kolları tarafından kapsanan. tespit edilebilir dairesel stereociliary demetleri saç hücreleri, toplam saç hücrelerinin yüzdesi olarak, bu sayılırlar.
      NOT: Birçok siliyer mutantlar ise paket anormallikler bağımsız paket yönlendirme görülebilir. Doğru stereociliary paket anormallikleri ölçmek zordur.
6. Stereociliary demetleri (Şekil 3B, C, G) yönelimi:
   1. İç ve dış saç hücrelerinin ayıran ayağı hücrelerinin üst üste dik olarak uzanan bir çizgiye, her bir demet nisbetle yönünü değerlendirmek. normal bir yönlendirmeyle olan hücreler, bu dik bir eksen boyunca hizalanır ve bu 0 ° 'lik bir rotasyon vardır. 0 ° ila 360 ° gösterim ya da mutlak sapmaları kullanılarak dönme açıları belirleyin.
7. Kinocilia konumlandırma veya stereociliary paket konumlandırma (Şekil3B, K, H):
   1. kinocilia eksik olan hücrelerin yüzdesi sayın. paketin 'vertex' ya da merkeze kinocilium mesafeyi ölçün. paketin 'tepe' demetleri anormaldir ve böylece demetin orta yerine kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek kolay olmayabilir.
8. Her saç hücresinin üzerine bir pozisyonel ızgara kaplayan ve kinocilium tabanı veya stereociliary demetinin vertex / merkezinin ya yerini işaretleyerek, apikal saç hücre yüzeyinde kinocilia ve stereociliary demetleri konumunu sayısal olarak. ızgara, belirli bir bölge içinde yer her kategorinin bir yüzdesi olarak, ve bir pozisyon ızgara üzerine her işaretleme yerleri kaplayan verileri görüntüler.
   Not: Kontrol dokularda kinocilia her stereociliary demetin tepe bağlıdırlar. kirpikler mutantlarında, kinocilia genellikle hala bağlı ya da hatta tamamen s kopuk yapılmamış mislocalized, eksiktereociliary paket.
9. Kinocilia uzunluğu (Şekil 3H):
   1. Bir siliyer aksonem işaretleyici ile etiketleme kinocilium uzunluğunu ölçün. Sadece 1.5 mikron konfokal düzlemi içinde düz yalan kinocilia ölçün. kirpikler taranan bir doku kesit görünüşünü gözlemleyerek düz yalan olduğunu onaylayın. kinocilium gelişimi sırasında geri çekilir beri Kokleanın aynı bölgeden yaşlı eşleştirilmiş örnekler karşılaştırın.
10. kutup proteinlerinin mislocalization:
    1. Böyle Vangl2 ve Gαi3 olarak kutupluluk proteinlerine karşı antikorlar kullanılarak immünohistokimyasal ardından, görüntüleme yoluyla yerelleştirme belirler.

NOT: Bazı kirpikler mutantlar olarak, polarite proteinlerin lokalizasyonu bozulur. Bu Ift20, Bbs8 ve Bbs6 mutant koklea bozulduğu gösterilmiştir Vangl2 ve Gαi3 içerir.

Not: ölçmek ve ekran saç hücre polarit için nasıl diğer örnekleri,y şu kağıtları bulunabilir. Curtin, et al. (2003) Current Biology ²² Montcouquiol, et al. (2003) Nature ^7, Wang ve arkadaşları (2006) ve diğerleri, Neuroscience ^23, Montcouquiol, Journal of. Molecular Biology ^24, Mayıs-SIMERA, et al (2008) Methods. Molecular Biology ²⁵ (2012) Yöntemler, Yin ve arkadaşları (2012) PLoS bir ^26.

Sonuçlar

Salyangoz Diseksiyon ve Doku Hazırlanması

Beynin çıkarılmasından sonra, (Şekil 1A, beyaz ok) görüntülenmiştir ve kaldırılabilir arkadan görülen bir P0 fare kafası, kemik labirent, post orta hat sagital diseksiyon. Şekil 1B koklear saçlı izole kemik labirentler gösterir yukarı, ventral (sol) ve arkasından bakan, dorsal (sağda). oval pencereye beyaz ok noktaları hangi bir dış kı...

Tartışma

analiz için koklear doku hazırlanırken, akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, genetik arka planda farklılıklar gerekli analiz ve tek yavru kontrollerle karşılaştırılması hale koklear fenotip değiştirebilirsiniz. İkincisi, örtü oluşturan zarın tam olarak çıkarılması immünhistokimya ile en iyi görüntü elde etmek için gerekli ve SEM için gereklidir edilir. örtü oluşturan zar opak bir yapıdır ve görüntüleme daha zorlu hale altındaki doğrudan duyusal epitel hücreleri önünü kapatabilir. Bazen işlem s...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Araç/Ekipman
Silikon elastomer - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	Bkz. Not 2
Mikro diseksiyon makası-düz bıçak	Çeşitli
İnce forseps (no. 5 ve 55) ve künt forseps	Çeşitli
Diseksiyon mikroskobu.	Çeşitli Kaplamasız
cam mikroskop slaytları	Çeşitli
Mikroskop kapak kızakları (22 mm ve kez; 40 mm ve kez; 0,15 mm)	Çeşitli
Transfer pipetleri	Çeşitli
Minutien pimleri	Güzel Bilim Araçları	26002-10
SEM numune tutucu	tousimis	8762
Taramalı elektron mikroskobu saplamaları	TED PELLA	16111
PELCO Sekmeleri: Karbon yapıştırıcı	TED PELLA	16084-3
Floresan Mikroskop	Çeşitli
Kritik Nokta Kurutucu	Çeşitli
Taramalı Elektron Mikroskobu	Çeşitli
Cam mikroskop slaytları	Çeşitli
Cam lameller	Çeşitli
Kimwipe Doku	Çeşitli
İnce Boya Fırçası Reaktifleri
1 kez; Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Gibco/Life Technologies	10010023
Paraformaldehit  (PFA) (EM için gerekli EM notu)	Çeşitli		1 kez% 4'lük bir çözelti hazırlayın; PBS her seferinde taze yapılır. EM için gerekli EM notu.
% 2.5 Glutaraldehit Grade1	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl (pH 7.5)	Çeşitli
NaCl	Çeşitli
CaCl 2	Çeşitli
Triton X-100	Çeşitli
Normal Keçi Serumu	Çeşitli
AffiniPure Fab Fragment Eşek Anti-Fare IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G Montaj ortamı	SouthernBiotech	0100-01
10 kez; Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Gibco/Yaşam Teknolojileri	14065
Hepes	Gibco/Yaşam Teknolojileri	15630-080
Osmiyum tetroksit (OsO4)	Sigma-Aldrich/Fluka Analitik	75632
Tanik asit	Sigma-Aldrich	403040
Etanol 200 kanıt	Çeşitli
Antikorlar
anti Arl13b	Protein Tech	17711-1-AP	Önerilen konsantrasyon 1: 1.000
anti asetillenmiş tübülin (611-B1)	Sigma-Aldrich	T6793	Önerilen konsantrasyon 1: 800
anti gama tübülin (GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557	Önerilen konsantrasyon 1: 200
anti Zo_1 & nbsp;	Invitrojen	40-2300	Önerilen konsantrasyon 1:500
Miyozin VI	Proteus Biosciences	25-6791	Önerilen konsantrasyon 1:1000
Miyozin VIIa	Proteus Biosciences	25-6790	Önerilen konsantrasyon 1:1.000
anti Vangl2	Merk Millipore	ABN373	Önerilen konsantrasyon 1:250
anti G & alfa; i3	Sigma-Aldrich	G4040	Önerilen konsantrasyon 1:250
Alexa Fluor® 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379	Önerilen konsantrasyon 1:300 - 1.000
Alexa Fluor® 568 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12380	Önerilen konsantrasyon 1:300 - 1.000