Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Summary

Bu kulak ve farelerin kuyrukları primer fibroblastlar üretilmesi için basit ve hızlı bir deney prosedürü tarif etmektedir. Prosedür özel hayvan eğitim gerektirmeyen ve 10 gün oda sıcaklığında saklanan kulaklardan fibroblast kültürlerin üretimi için de kullanılabilir.

Abstract

Birincil hücreler doku şirketinden elde edilir yerleşmiş hücre hatlarında ve daha etkin in vivo hücre fizyolojik durumu daha iyi temsil olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, birincil hücre kültürleri, genellikle sınırlı bir ömre sahiptir ve sık sık yeniden tesis edilmesi gerekir. Fibroblastlar primer hücre kolay ulaşılabilir bir kaynağıdır. Burada, kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için basit ve hızlı bir deneysel prosedür tartışır. Protokolü için 10 gün süreyle oda sıcaklığında depolanan kulak birincil fibroblast kültürleri oluşturmak için de kullanılabilir. Protokol dikkatle takip edildiğinde, bulaşmalar bazı durumlarda uzun süre saklanan steril olmayan doku kullanımına rağmen ortaya çıkması olası değildir. Fibroblastlar kültürde hızla çoğalırlar ve replikatif yaşlanmayı geçmeden önce önemli sayıda genişletilebilir.

Introduction

Birincil hücreler, in vitro koşullarda doku ve kültüre canlı elde edilir. Genellikle birincil hücreler daha yakından fizyolojik durumu ve ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre çizgileri ¹ den kaynaklandığı doku genetik yapısının benzer olduğu varsayılır. Bu nedenle, birincil hücreler biyolojik sorular ^2,3 eğitimi için yararlı bir model oluşturmaktadır. Ancak, sonsuza kadar büyümesine kurulan hücre hatları aksine, birincil hücreler sonunda kültürdeki yaşlanmayı geçmesi ve sık sık yeniden oluşturulması gerekmektedir.

Yaygın olarak kullanılan birincil hücreler, fibroblastlar, epitel hücreleri, endoteliyel hücrele....

Protocol

Fareler euthanization kadar kurumsal rehberlere (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların Singapur Ulusal Üniversitesi ve Laboratuar Hayvan Araştırmaları Ulusal Danışma Komitesi (NACLAR) kurallar) ile uyumlu patojen içermeyen koşullar yerleştirildiler.

1. Fare

1. Uygun genetik arka plan bir fare sipariş edin. Bu protokol, tek bir C57BL / 6 fareden alınmış dokuda dayanır.

Tam Orta 2. Hazırlık

1. % 10 fetal buzağı serumu (FCS), 50 uM 2-merkaptoetanol, 100 uM asparagin, 2 mM glutamin,% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı aşağıdaki bileşe....

Results

Doku çöküntüsü önemli bir miktarda doku sonuçlarından fibroblast ekstraksiyonu (Şekil 1). Doku çöküntüsü aksine, fibroblastlar gün 1 ve kültür 3 arasında doku kültürü plastik yüzeylere yapışır. Fibroblast kültürlerinde orta güvenle anlamlı kültür (Şekil 2) enkaz mevcut seviyelerini azaltmak gerektiğini kültür, günü 3 değiştirilebilir. Fibroblastlar bir ince uzun morfoloji ve net bir şekilde görülebilen sitoplazma (Şekil 1 ve 2) göstermektedir. Mitotik h.......

Discussion

Burada kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için, basit, ucuz ve hızlı bir deneysel prosedür sağlar. Ekstraksiyon doku 3 gün sonra izole olan yapışık ve hızlı bölünen fibroblastlar ile sonuçlanmalıdır. Primer hücrelerin önemli bir sınırlama yaşlanması, kalıcı bir büyüme tutuklama ^15'dir. Fibroblastlar yaşlanmış hale gelmeden önce protokolü kullanarak, fibroblast kültürleri boyutu (3/2 katı artış) ve genişletmek için başarısızlık artış, hücrelerin yassılaşmasına ile gösteri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Fetal Buzağı Serumu	HyClone	SV30160.03
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Asparagin	Sigma-Aldrich	A4159
Glutamin	Sigma-Aldrich	G8540
Penisilin / Streptomisin	HyClone	SV30010
Analiz için Etanol	Merck Millipore	107017	Mutlak
Kollajenaz D	Roche Teşhis	11088866001	Clostridium histolyticum, liyofilize, steril olmayan
Pronaz proteaz	Merck Millipore	53702'den	Streptomyces griseus
Tris tamponu (pH 8)	1. BASE	1415	Ultra saf sınıf
0.5M EDTA (pH 8)	1. BAZ	BUF-1053	Biyoteknoloji sınıfı
10X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	1. BASE	BUF-2040-10X4L	Ultra saf sınıf
Tripsin-EDTA çözeltisi 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	% 0.5 tripsin,% 0.2 EDTA, fenol kırmızısı olmadan SER-TAIN işlemi ile ışınlanmış tripsin gama, tuzlu
Amfoterisin B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 & mu; deiyonize suda g / ml, steril filtrelenmiş
Makas	Aesculap
Forcep	Aesculap	AE-BD312R
0.2 & mu; M şırınga filtresi	Sartorius Stedim	16534
70 & M hücre süzgeci	SPL	93070
Şırınga pistonu	Terumo	SS + 10L
Kriyoviyal tüp	NUNC	368362
1.7 ml mikrosantrifüj tüpü	Axygen	MCT-175-C
10 cm hücre kültürü kabı	Greiner	664160	Hücre kültürü ile muamele edilmiş tabak
15 ml konik tabanlı boru	Greiner	188271
50 ml konik tabanlı tüp	Greiner	227261
Su banyosu	GFL	1002
Santrifüj	Eppendorf	5810R
İnkübasyon çalkalayıcı	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 ışık mikroskobu	Carl Zeiss AG