Bu kulak ve farelerin kuyrukları primer fibroblastlar üretilmesi için basit ve hızlı bir deney prosedürü tarif etmektedir. Prosedür özel hayvan eğitim gerektirmeyen ve 10 gün oda sıcaklığında saklanan kulaklardan fibroblast kültürlerin üretimi için de kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri
Bu makalede
Özet
Özet
Birincil hücreler doku şirketinden elde edilir yerleşmiş hücre hatlarında ve daha etkin in vivo hücre fizyolojik durumu daha iyi temsil olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, birincil hücre kültürleri, genellikle sınırlı bir ömre sahiptir ve sık sık yeniden tesis edilmesi gerekir. Fibroblastlar primer hücre kolay ulaşılabilir bir kaynağıdır. Burada, kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için basit ve hızlı bir deneysel prosedür tartışır. Protokolü için 10 gün süreyle oda sıcaklığında depolanan kulak birincil fibroblast kültürleri oluşturmak için de kullanılabilir. Protokol dikkatle takip edildiğinde, bulaşmalar bazı durumlarda uzun süre saklanan steril olmayan doku kullanımına rağmen ortaya çıkması olası değildir. Fibroblastlar kültürde hızla çoğalırlar ve replikatif yaşlanmayı geçmeden önce önemli sayıda genişletilebilir.
Giriş
Birincil hücreler, in vitro koşullarda doku ve kültüre canlı elde edilir. Genellikle birincil hücreler daha yakından fizyolojik durumu ve ölümsüzleştirilmiş veya tümör hücre çizgileri 1 den kaynaklandığı doku genetik yapısının benzer olduğu varsayılır. Bu nedenle, birincil hücreler biyolojik sorular 2,3 eğitimi için yararlı bir model oluşturmaktadır. Ancak, sonsuza kadar büyümesine kurulan hücre hatları aksine, birincil hücreler sonunda kültürdeki yaşlanmayı geçmesi ve sık sık yeniden oluşturulması gerekmektedir.
Yaygın olarak kullanılan birincil hücreler, fibroblastlar, epitel hücreleri, endoteliyel hücrele....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fareler euthanization kadar kurumsal rehberlere (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kılavuzların Singapur Ulusal Üniversitesi ve Laboratuar Hayvan Araştırmaları Ulusal Danışma Komitesi (NACLAR) kurallar) ile uyumlu patojen içermeyen koşullar yerleştirildiler.
1. Fare
- Uygun genetik arka plan bir fare sipariş edin. Bu protokol, tek bir C57BL / 6 fareden alınmış dokuda dayanır.
Tam Orta 2. Hazırlık
- % 10 fetal buzağı serumu (FCS), 50 uM 2-merkaptoetanol, 100 uM asparagin, 2 mM glutamin,% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı aşağıdaki bileşe....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Doku çöküntüsü önemli bir miktarda doku sonuçlarından fibroblast ekstraksiyonu (Şekil 1). Doku çöküntüsü aksine, fibroblastlar gün 1 ve kültür 3 arasında doku kültürü plastik yüzeylere yapışır. Fibroblast kültürlerinde orta güvenle anlamlı kültür (Şekil 2) enkaz mevcut seviyelerini azaltmak gerektiğini kültür, günü 3 değiştirilebilir. Fibroblastlar bir ince uzun morfoloji ve net bir şekilde görülebilen sitoplazma (Şekil 1 ve 2) göstermektedir. Mitotik h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada kulakları ve farelerin kuyrukları primer fibroblast kültürleri kurmak için, basit, ucuz ve hızlı bir deneysel prosedür sağlar. Ekstraksiyon doku 3 gün sonra izole olan yapışık ve hızlı bölünen fibroblastlar ile sonuçlanmalıdır. Primer hücrelerin önemli bir sınırlama yaşlanması, kalıcı bir büyüme tutuklama 15'dir. Fibroblastlar yaşlanmış hale gelmeden önce protokolü kullanarak, fibroblast kültürleri boyutu (3/2 katı artış) ve genişletmek için başarısızlık artış, hücrelerin yassılaşmasına ile gösteri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir mali çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, NRF hibesi HUJ-CREATE - Hücresel ve Moleküler Enflamasyon Mekanizmaları tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Buzağı Serumu | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagin | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamin | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penisilin / Streptomisin | HyClone | SV30010 | |
| Analiz için Etanol | Merck Millipore | 107017 | Mutlak |
| Kollajenaz D | Roche Teşhis | 11088866001 | Clostridium histolyticum, liyofilize, steril olmayan |
| Pronaz proteaz | Merck Millipore | 53702'den | Streptomyces griseus |
| Tris tamponu (pH 8) | 1. BASE | 1415 | Ultra saf sınıf |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1. BAZ | BUF-1053 | Biyoteknoloji sınıfı |
| 10X Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | 1. BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra saf sınıf |
| Tripsin-EDTA çözeltisi 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | % 0.5 tripsin,% 0.2 EDTA, fenol kırmızısı olmadan SER-TAIN işlemi ile ışınlanmış tripsin gama, tuzlu |
| Amfoterisin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 & mu; deiyonize suda g / ml, steril filtrelenmiş |
| Makas | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 & mu; M şırınga filtresi | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 & M hücre süzgeci | SPL | 93070 | |
| Şırınga pistonu | Terumo | SS + 10L | |
| Kriyoviyal tüp | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm hücre kültürü kabı | Greiner | 664160 | Hücre kültürü ile muamele edilmiş tabak |
| 15 ml konik tabanlı boru | Greiner | 188271 | |
| 50 ml konik tabanlı tüp | Greiner | 227261 | |
| Su banyosu | GFL | 1002 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5810R | |
| İnkübasyon çalkalayıcı | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 ışık mikroskobu | Carl Zeiss AG |
Kaynaklar
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
