Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Summary

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri kullanılarak zar potansiyelindeki değişiklikleri görüntülemek için bir yöntem açıklanmıştır.

Abstract

Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergeleri (GEVI'ler), in vivo kayıtlar için yararlı olmaya başladıkları noktaya kadar gelişmiştir. Nihai amaç nöronal aktiviteyi in vivo olarak görüntülemek olsa da, başarılı in vivo preparatları sağlamak için tek bir hücrenin aktivitesini görüntüleyebilmek gerekir. Bu prosedür, sonunda in vivo olarak görüntülemek için bir temel sağlamak üzere tek bir hücrede zar potansiyelinin nasıl görüntüleneceğini açıklayacaktır. Burada, in vitro olarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) yapabilen tek bir floresan proteine (FP) veya iki floresan proteine kaynaşmış bir voltaj algılama alanından oluşan GEVI'leri görüntüleme yöntemlerini açıklıyoruz. Bir görüntü ayırıcı kullanmak, iki farklı dalga boyu tarafından oluşturulan görüntülerin aynı şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamerasına aynı anda yansıtılmasını sağlar. Görüntü ayırıcı, ışık yoluna ikinci bir filtre küpü yerleştirir. Bu ikinci filtre küpü, GEVI'nin FP'lerine bağlı olarak verici ve alıcı floresan dalga boylarını ayırmak için bir dikroik ve iki emisyon filtresinden oluşur. Bu kurulum, hem alıcı hem de verici floresan ortaklarının aynı anda kaydedilmesini sağlarken, membran potansiyeli tüm hücre yama kelepçesi konfigürasyonu aracılığıyla manipüle edilir. Tek bir FP'den oluşan bir GEVI kullanırken, ikinci filtre küpü çıkarılabilir, böylece görüntü ayırıcıdaki aynalar CCD kameraya tek bir görüntü yansıtabilir.

Introduction

Bu çalışmanın temel odak noktası genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri kullanılarak in vitro membran potansiyelleri değişikliklerin optik görüntüleme göstermektir. membran potansiyeli Görüntüleme değişiklikleri nöronal devrelerin aktivitesini okuyan heyecan verici imkanı sunar. Bir floresan yoğunluğu değişikliği membran potansiyeli sonuç değişiklikler, kameranın her bir piksel nöronal aktivitenin nonintrusive ölçümlerini sağlayan bir vekil elektrot olduğunda. Kırk yıl boyunca, organik voltaja duyarlı boyalar ^1-4 zardaki potansiyel değişimlerinin gözlemlemek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, bu boyalar, selüler özgüllük yoksundur. Buna ek olarak, bazı hücre türleri leke zordur. Genetik olarak kodlanmış gerilim göstergeleri (GeViS) hücreleri, özellikle çalışılan floresan voltaja duyarlı prob ifade edilecek olan bu sınırlamaları aşmak.

GeViS üç sınıf vardır. GeVi birinci sınıf vo kullanırTek bir floresan proteini (FP) ^5-9 veya Förster rezonans enerji transferi (FRET) çifti ^10-12 biriyle voltaj algılama fosfataz alan adını ltage algılama. Sensörlerin ikinci sınıf bir floresan göstergesi doğrudan ^13-15 veya elektrokromik FRET ^16,17 aracılığıyla mikrobiyal rodopsin kullanır. Üçüncü sınıf iki bileşeni, bir zara bağlı AP ve zara bağlı söndürme boyasının ^18-20 olan bir ikinci bileşen olan genetik bileşen kullanır. İkinci ve üçüncü sınıf nitro ve kesiti deneyleri ^19,20 olarak yararlı olsa da, sensör, sadece birinci sınıf an in vivo ⁶ analizleri için de yararlıdır.

Bu yazıda in vitro GeViS ilk sınıfını (Şekil 1) kullanılarak membran potansiyelinin görüntüleme gösterecektir. Gerilim sensörlerinin Bu birinci sınıf in vivo görüntüleme geçiş için en kolay yoldur. GeViS u yanayaklaşık sensörlerin rodopsin sınıfından daha parlak 50 kat bir FP kaynaşmış bir gerilim algılayan bölge olan tilizing, onlar ark lambası aydınlatma kullanılarak yerine son derece güçlü bir lazer gerektiren görüntülü olabilir. parlaklık eşitsizlik diğer sonucu GeViS birinci sınıf kolayca beynin otomatik floresan aşabilir olmasıdır. rodopsin tabanlı sondalar olamaz. Sensörün üçüncü sınıf birinci sınıf kadar parlak fakat in vivo olarak uygulanması zor bir kimyasal söndürücü eklenmesini gerektirir.

Bu nedenle biz, tek bir FP (Bongwoori) ⁸ bir FRET çiftinin oluşan bir prob (Nabi 2) ^12, bir probun satın gösterecektir. Nabi 2.242 ve Nabi 2,244 adlandırılan yeşil fluoresan verici, yonca oluşan ¹¹ ve kırmızı flüoresan alıcıya, mRuby2, - VSFP-CR (yonca mRuby2 voltaja duyarlı flüoresan protein) kelebek versiyonları FRET bu raporda yapılarıdır

Şekil 1. Bu Rapor (A) görüntülenmistir Genetik kodlanmış Gerilim Göstergeleri (GeViS) bir trans-membran voltaj algılama alanını ve bir floresan proteini olan GeVi dayalı bir mono FP İki Türleri. (B) trans-membran voltaj algılama etki, bir FRET verici ve alıcı oluşan bir FRET tabanlı GeVi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protocol

Etik deyimi: hayvan deneyi protokol KIST hayvan protokolü 2014-001 Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Ekipman Ayar

1. Görüntüleme kurulumu
   1. Bir titreşim izolasyonu masaya ters bir floresan mikroskop yerleştirin. objektif lens ve gerilim görüntüleme için kullanılan floresan proteinleri için uygun bir dikroik ayna ve filtreler ile donatılmış bir filtre küp (1.35 sayısal diyafram ile 60X immersiyon yağı lens), yüksek büyütme kullanın.
      Not: Bu kurulum yüksek NA amaçları için kullanmak amacıyla, bir ters mikroskop kullanır, ancak dik mikroskoplar da kullanılabilir. daha yüksek sayısal açıklık (NA) objektif lens düşük NA ve böylece gürültü oranı (SNR sinyal iyileştirme ile olandan daha fazla ışık toplayan yana Gerçekten de, ters mikroskop yalnızca prob gelişimi için, bölü tepe optik sinyal olarak tanımlanabilir başlangıçta standart sapmasıkayıt floresan). Olmayan geliştiriciler için, bu tür dilim olarak veya in vivo kayıtlar uygulamalar için dik bir mikroskop öneriyoruz.
   2. Bir ışık kaynağı, hazırlayın örneğin., Xenon ark lambası, verimli Epifloresans geniş alan görüntüleme için mekanik bir deklanşör ile donatılmıştır. mount ışık kılavuzu aracılığıyla mikroskop ışık yönlendirin. ışık uyarma filtresinden geçecek ve filtre küp ilk dikroik ayna tarafından yansıtılır. Bakış ²¹ alanın üzerine maksimize ışık yoğunluğu eşit numune aydınlatmak için ışık hizalayın.
      Not: Geleneksel olarak, bir 75 watt ark lambası parlak aydınlatma alanları yüksek watt ampuller daha oluşturmak beri kullanılan ancak değildi. Lazerler kullanılabilir ancak tek bir dalga boyu kısıtlanır. LED'ler daha parlak hale geliyor ve aslında seçim ışık kaynağı çoklu dalga boylarını sunan ve mekanik bir deklanşör gerektirmeyen olabilir.
   3. fluoresc iki CCD kamera monteŞekil 2D'de gösterildiği gibi, ence mikroskobu.
      Not: İlk CCD kamera yüksek uzaysal çözünürlüğe sahip ve test edilecek plazma membranında GeVi ifade eden bir hücrenin belirlenmesi için kullanılır. membran potansiyelindeki görüntüleme değişiklikleri için ikinci CCD kamera, yüksek kare hızı sn (fps) başına gibi 1.000 kare olduğundan emin olun. İki CCD kamera arasındaki görüntüleme yolu geçiş yapmak için bir çift bağlantı kamera adaptörü (Şekil 2D-(3)) kullanın. Bu ayarda, bir demagnifier ikinci CCD kamera CCD çipi üzerine objektif lens görüntüyü sığdırmak için kullanılır.
   4. FRET tabanlı GeVi görüntülenmesi için ilk (yavaş) ve ikinci (hızlı) CCD kameralar arasında bir resim splitter takın. Bir filtre küp bir dikroik ayna (560 nm) ve iki emisyon filtreleri sahip takın (520 nm / 40 645 nm / 75) görüntü splitter. Bu bakış iki alan, kabul edici floresan temsil donör floresan ve başka bir neden olur. Bu s kaldırecond filtre küp tek FP ile GeVi görüntüleme sırasında.
      Not: Bu yöntemde test tek FP tabanlı GeVi FP, süper ekliptik pHluorin A227D (SE A227D) kullanan Bongwoori olduğunu. Uyarma filtresi (/ 30 472 nm), emisyon filtresi (497 nm / uzun bir pas) ve dikroik ayna (495 nm) kendi uyarma ve emisyon spektrumları ⁵ dayalı seçildi. Genel olarak, uyarılma ve radyasyon filtreleri dikroik ayna blokları herhangi bir uyarma ışık emisyon filtresi üzerinden iletilen ise parlak bir görüntü elde etmek için fluorofor her spektrum ile en büyük örtüşmeyi olmalıdır. FRET çifti ¹¹ tabanlı GeVi kayıt için filtreler ve dikroik aynalar seçimi o donör ve alıcı floresan eşzamanlı gözlem için görüntü splitter ikinci filtre küpü gerektirdiğini dışında aynı prensibi izler. mikroskop filtre kutusuna yerleştirilen ilk filtre küp Clover için bir uyarım filtresi (475 nm / 23) olması gerekir. Sonra f yayılanHer iki hekimleri gelen luorescence ilk dikroik ayna (495 nm) ile ikinci filtre küp iletilecektir. İkinci filtre küp dikroik ayna (560 nm) ve her FP böylece iki farklı hekimleri gelen floresan ayırmak için iki emisyon filtreleri (Clover için 520 nm / 40 ve mRuby2 için 645 nm / 75) sahiptir.

		Tek FP tabanlı GeVi (Bongwoori)	çift ​​bazlı GeVi FRET (Nabi 2.42 ve Nabi 2.44)
mikroskop yerleştirilen ilk filtre küp	uyarma filtresi	472 nm / 30	475 nm / 23
	dikroik ayna	495 nm	495 nm
	emisyon filtresi	497 nm / uzun bir pas	-
kiriş splitter yerleştirilen ikinci filtre küp	dikroik ayna	-
	Emisyon filtresi 1	-	520 nm / 40
	Emisyon filtresi 2	-	645 nm / 75

Tek FP Tabanlı GeVi ve FRET Tabanlı GeVi Recordings için kullanılır Tablo 1. İki Farklı Filtre Setleri

2. titreşim izolasyonu
   1. titreşim izolasyonu masaya bileşenleri hareketli herhangi bir ekipman monte etmeyin. izole edilmemiş ekipmana bağlı olan kabloların numunenin titreşim önlemek için gevşek olduğundan emin olun.
3. Yama kelepçe odası
   1. amacın çalışma mesafesi nispeten küçük olduğu için, ince bir # 0 kapak camı ile yama kelepçe odasının alt conta. Bu ters mikroskop kurulum bir dezavantaj.
      Not: Bir yüksek NA objektif lens sahip bir tradeoff, çalışma mesafesi azalır. specim yerleştirmek içinÇok kısa çalışma mesafesi en, kapak cam ve lamel (adım 2) mümkün olduğunca ince olması gerekir.
4. Sıcaklık kontrolü
   1. Banyo çözeltisi 33 ^{o C} deney boyunca etrafında yamalı hücreleri korumak için sıcaklık kontrol akar emin olun.
5. Ekipman bağlantıları
   1. yama kelepçe amplifikatör ve yüksek hızda CCD kamera Süngü Neill-Concelman (BNC) komutu kutusuna ışık kaynağının mekanik obtüratör bağlayın. Bu amplifikatör, kamera, ve aynı zamanda ışık kaynağını kontrol etmek görüntüleme yazılımı sağlayacaktır.
      Not: Elektrik ve görüntüleme bileşenleri elektriksel aktivite eş zamanlı elektrik ve optik kayıtlar için sağlamak amacıyla senkronize edilmesi gerekir.

Şekil 2. Cihazlaro kadar ulaşmadan GeViS ile gerilim Görüntüleme ışık yolu takip iş akışı, (A) 75W Ksenon ark lambası, (B) ark lambasından gelen uyarma ışık ment Kur ilk dikroik ayna tarafından uyarılma filtre tarafından filtre edilir ve daha sonra yansıtılır örnek sahne, sağ üst köşede bir gömme yavaş hız CCD kamera, bir hücre ve yama kelepçe hem seçim yardımcı olmak için kullanılan tam hücre konfigürasyonu, (C), (D) görüntü elde etme kısmını göstermektedir; (1) yüksek hız CCD kamera, (2) AP GeViS eşleştirmek ve mono FRET hem de görüntü splitter, (3) demagnifier yüksek hızda CCD kamera CCD çipi üzerine görüntüyü sığdırmak için, (4) çift bağlantı kamera adaptörü yama hücrenin belirlenmesi, (E & F) tek-AP merkezli GeVi (E) ile görüntü toplama ve FRET tabanlı GeVi için yüksek uzaysal çözünürlüğü ile görüntüleme yolu ve (5) yavaş hız CCD kamera geçmek için(F). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Geviş 2. İfade

1. İnsan embriyonik böbrek 293 hücreleri
   1. Kültürü İnsan embriyonik böbrek 293 (HEK 293), bir _CO2 inkübatöründe _(% 5 CO2) 37 ^{o C'de%} 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) olan hücreler. 100 mm çapında ve 20 mm yüksekliğinde bir doku kültür çanağı kullanın. 2 x 10 ³ kültürü başlayın - ^/ cm2 6 x 10 ^{3 hücre} ve sonraki transfeksiyon için% 80-90 confluency ulaşana kadar kuluçkaya yatmaktadır.
   2. Transfeksiyon gününde, hücre ortamı aspire ve yavaşça Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su ile bir kez yıkanır. 1-2 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile HEK 293 hücreleri dispers solüsyonu aspire ve yavaşça c ayırmak için çanak yan dokununarşın. Taze DMEM (% 10 FBS) ekleyin ve pipetle clumped hücreleri ayırmak. hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
   3. 0.08 yerleştirin - 0.13 mm kalınlığında, 10 mm çapında bir önceden kaplanmış 24 oyuklu doku kültürü plakası poli-L-lizin ile lamelleri. 1 ^x 10 5 hücre / ^cm 2 hücre yoğunluğu az lamelleri HEK 293 hücreleri Tohum.
      Not: HEK 293 hücreleri birbiriyle gap junction oluşturabilen olduğu için, tohum sayısı izole hücreler elde etmek için gereklidir.
   4. Geçici üreticinin talimatları izlenerek bir lipofeksiyon reaktifi kullanarak bir GeVi kodlayan uygun bir gen yapısı ile hücreleri transfekte.
      Not: omurga vektörleri olarak bu adımı kullanılan pcDNA3.1 (Bongwoori) ve pUB2.1 (Nabi 2,242) için kullanılan gen yapıları. DNA kullanılan miktarı, her lamel için ng 100 idi; Bununla birlikte, transfeksiyon koşulları her GeVi test edilmesi için ampirik olarak tespit edilmesi gerekir.
2. ayrışmış fare kalçapocampal birincil nöronlar
   1. Embriyonik gün 17 C57BL6 / N farelerden alınan hippocampi incelemek ve daha önce ^22,23 açıklandığı gibi daha sonra hipokampal nöronlar ayırmak.
   2. Plaka, poli-D-lizin kaplı 0,08-0,13 mm üzerine ayrışmış nöronlar kalın / ml hücre yoğunluğu 1 ^x 10 5 hücre 10 mm çapında lamelleri. CO ₂ inkübatör 37 ^{o C'de} inkübe hücreleri _(% 5 CO 2).
   3. Daha önce tarif edildiği gibi ^24, bir kalsiyum fosfat transfeksiyon reaktifi kullanarak bir GeVi kodlayan bir gen yapısı ile in vitro (DIV), 7 gün - 6'da geçici ayrışmış nöronlar transfekte.
      Not: omurga vektörleri olarak bu adımı kullanılan pcDNA3.1 (Bongwoori) ve pUB2.1 (Nabi 2,244) için kullanılan gen yapıları. kullanılan DNA miktarı, her bir lamel 1 ug idi. Yine, transfeksiyon koşulları, test edilen her GeVi için deneysel olarak tespit edilmesi gerekmektedir.
3. ima voltaja önce ifade seviyesini kontrol edinging
   1. CO ₂ inkübatör doku kültürü plaka almak ve bir Epifloresans mikroskop altında transfekte hücrelerden floresan gözlemleyin.
   2. zardan floresan onayladıktan sonra, 3. bölümünde gerilim görüntüleme için yama odasına lamel aktarın.
      Not: Voltaj görüntüleme 16 yapılır - 24 saat sonrası transfeksiyon. farklı floresan proteinleri farklı olgunlaşma süreleri var Bununla birlikte, bazı GeViS sonrası transfeksiyon daha fazla zamana ihtiyacım var. Örneğin, bu protokolde mRuby2 içeren FRET çifti mRuby2 olgunlaşması Clover ¹¹ önemli ölçüde daha uzun sürer çünkü ifade etmek daha uzun sürebilir. verici ve alıcı hem de floresan kontrol edilmelidir.

3. Voltaj Görüntüleme Protokolü

1. İyi zar ifade ile sağlıklı bir hücreyi seçin
   1. Mikroskobu kullanarak, bu güçlü olduğunu gösterir sağlıklı hücre (Şekil 4B) bulmakİç floresan göre membran lokalize ışık vermiştir. yuvarlak hücreler yama çalışın. Dairesel hücreler ya bölünmesi veya ölmekte ve yama zordur. sonraki yama kelepçe deneyler yardım etmek süresi genlik ve 5.0 milisaniye içinde 5.0 mV bir test darbe uygulamak.
2. Gerilim görüntüleme için hücreyi hazırlayın
   1. yama için bir hücreyi seçtikten sonra, hücrenin üstündeki yama kelepçe pipet yerleştirin. yavaşça hücre zarına temas edene kadar pipet aşağı getirin. Yama kelepçe yazılımı ²⁵ membran direnci 2 M? Yükselişi - Bu aşamada, 1 M? Gözlemlemek.
      NOT: Bazen iyi bir giga-ohm mühür hücre zarını dokunarak basitçe ortaya çıkabilir. Sürece Giga-ohm mühür istikrarlı olduğu gibi, o Tamam olmalıdır.
   2. nazikçe pipet aracılığıyla negatif basınç uygulanarak bir giga-ohm mühür oluşturulması. istenilen tutma potansiyeline pipet potansiyeli ayarlayın.
   3. giga-ohm mühür, görüntü inci korurkene yüksek hızlı CCD kamera ile hücre ve membran alanına doğru odaklanır.
   4. Ağız yoluyla emme darbeleri uygulayarak hücre zarını yırtılması ya da bütün bir hücre yapılandırması ²⁶ yapmak için yavaşça şırınga.
   5. Görüntü yama bir görüntüleme yazılımı kullanarak deneysel tasarım göre bir bütün hücre kelepçe yapılandırması altında hücreyi kenetli
      1. görüntüleme yazılımını başlatın. 'CCD kazanmak' sayfasını açmak için [SciMeasure Kamera] menüsünü - [kazanmak] tıklayın.
      2. görüntüleri kaydetmek için yeni bir veri dosyası oluşturun.
      3. ardından [ANALOG ÇIKIŞ] tıklayın ve görüntüleme yapmak için bir darbe protokol dosyasını açmak için [ASCII Oku]. Verilerin ortalaması gerekiyorsa 'iç tekrarları ortalamasını' üzerine tıklayın. Ardından 'ANALOG ÇIKIŞ' sayfasını kapatın.
         Not: Bu darbe protokolü tasarlanmış ve bu aşamasından önce her bir deney amacına göre bir 'txt' dosyası olarak kaydedilmiş olması gerekir.
      4. Set özel müktesebat'CCD kazanmak' sayfasından ition parametreleri. Girdi 'edinimi için kare sayısı' ve 'denemelerin sayısı' için özel değerler.
         Not: kare sayısı edinim hızı ve nabız protokolü zamanlama ile tespit edilir. Örneğin, görüntüleme 1 kHz'de, 1000 kare kayıt süresi 1 sn eşitse.
      5. Kaydı başlatmak için düğmeye [(Optik + BNC) DATA ALIN] tıklayın. Gerilim görüntüleme gerçekleşiyor olsa da, albüm boyunca istikrarlı tam hücre yapılandırmasını sağlamak için yama kelepçe yazılım osiloskop penceresini izleyin.
         Not: GeVi en duyarlı gerilim aralığını test etmek için, mesafe kadar taşınmış / F değeri veya fizyolojik gerilim aralığı boyunca zamansal çözünürlükte sinyal boyutu, mV -170 mV ile 130 arasında değişen bir darbe protokolü adım attı voltaj darbeleri ile bir bütün hücre voltajı kelepçe deney yapmak. aksiyon potansiyelleri çözümünde GeVi performansını belirlemek için kültür prima dan uyarılmışry nöronlar, görüntü bir bütün hücre akımı kelepçe yapılandırması altında hücre.

4. Veri Toplama

1. Kadar taşınmış / F hesaplanması
   1. görüntüleme yazılımını başlatın. Tıklayın [DOSYA] - bir veri dosyası açmak için [Okuma Veri Dosyası] analiz edilecek. Sağ tarafta Dayanma Işık Şiddeti (RLI) hücre görüntüsünü gözlemlemek
      Not: Yazılım ortalama olarak ilk 5 kare kayıt RLI belirlemek için.
   2. ekrana ölçülen akım ve gerilim değerlerini getirmek için 'Show BNC'lerine' üzerine tıklayın.
   3. duyarlı optik sinyallere sahip pikselleri belirlemek için çerçeve çıkarma işlevi kullanmak için 'Çerçeve çıkarma' ile 'RLI çerçeve' sayfa modunu değiştirin. Her piksel floresan olası değişiklikler için incelenebilir çünkü bu görüntüleme gerçek gücü.
   4. Çıkarma için iki kez puan (F ₀ ve F ₁₎ seçin. bir hücrenin hangi alanda tespitduyarlı sinyalleri gösteren potansiyel değişim membran.
      Not: Çerçeve çıkarma görüntüler için SNR sinyal zamansal ortalama her zaman noktası için birden fazla çerçeve seçerek geliştirilebilir. Yazılım, seçilen çerçeveleri alınan ortalama ışık yoğunluğunu çıkarır ve F ₁ -F ₀ değerleri (mesafe kadar taşınmış) hesaplar. Genellikle tek stimülasyon döneminde alınan tutma potansiyeli ve başka bir zaman noktasında elde edilen bir zaman noktasını seçer.
   5. sürükleyerek veya bilgisayar fare ile her pikseli tıklayarak analiz edilmesi gerekmektedir pikselleri belirtin. Yazılım penceresinin sol tarafında seçilen piksellerin ortalama floresan yoğunluğu grafik gösterimini gözlemleyin. 4B ve 5B çerçeve çıkarma analizinden temsili görüntüleri göstermek Rakamlar.
   6. RLI (F ₀₎ tarafından çıkarılır piksel bölün. Kadar taşınmış / F değerleri elde etmek için [R ^ tarafından Böl] tıklayın
2. ihracat verileri
   ayrıca GeVi gerilim algılama özelliklerini analiz için her voltaj adım için mesafe kadar taşınmış / F değerlerini hesaplamak. sonraki veriler için gerilim analizleri karşı böyle mesafe kadar taşınmış / F gibi grafikler çizmek için bu değerleri kullanın.
3. 'Göster BNC'lerine' menüsünü işaretini kaldırma ile akım ve gerilim grafikleri çıkarın. Git [ÇIKTI] - standart grafik yazılımı tarafından eğri uydurma analiz için bir ASCII dosya biçiminde floresan iz ihracat [Görüntülenen (ASCII) gibi İzler Kaydet].

5. Veri Analizi

1. GeVi Gerilim algılama özelliği
   1. Bir veri analiz programı gerilimin karşı mesafe kadar taşınmış / F değerleri çizerek gerilim grafiğinde (FV) karşı floresan değişimi çizin. Tıklayarak optik sinyalin voltaj aralığını belirlemek için bir Boltzmann fonksiyonu (Tablo 2) eğriye uyacak [Analiz] - [Montaj] - [Sigmoidal fit] - [Aç iletişim] ve ardından Boltzmann işlevini seçin.
      Not: Bir fonksiyona takılması onu possibl yapare farklı voltaj prob gerilim algılama özelliklerini karakterize etmek için veya farklı hücrelerde performanslarını karşılaştırmak için. Bu Problardan FV eğrileri sigmoid model göstermek için Boltzmann fonksiyonu bu yazıda test edilen problar için kullanılabilir.
   2. Ilk ve son değerleri işlevi tarafından hesaplanan (A ₁ ve A ₂₎ kullanarak her mesafe kadar taşınmış / F değerini normalleştirmek.
      Not: Boltzmann denkleminde, en az bir _{1 ve maksimum} bir _2'dir. Normalleştirilmesi için, sıfır gibi bir _{1 ve} biri olarak _A 2 tanımlayarak kadar taşınmış / F değerlerini ayarlamak için bir elektronik tablo uygulaması yazılımı kullanın. normalize kadar taşınmış / F değerleri ortalama ve istatistiksel analiz için standart hata hesaplayın.
   3. normalize mesafe kadar taşınmış Replot / voltaja karşı F değerleri daha önce) bölümünde 5.1.1 nitelendirdi.
2. optik cevap hızı
   1. Bir veri analizi ile adım 4.2.2 alınan ASCII dosyası) açınProgram ve zamana karşı mesafe kadar taşınmış / F iz arsa.
   2. veri analizi yazılımı 'Veri seçicinin' tıklayın ve basamaklı bir gerilim darbesi başında ve optik sinyal kararlı duruma ulaşmıştır ikinci kez noktasına karşılık gelen bir zaman noktasını seçin. tıklayarak tek ve çift eksponansiyel azalma hem bu aralığı Fit [Analiz] - [Montaj] - [Üstel fit] - [Aç iletişim], ve üstel çürüme işlevini seçin. Daha iyi uyum bildirin.
      Not: Tek veya çift üstel çürüme fonksiyonlarına uydurma olarak, τ tarafından temsil sayısallaştırılmış zaman sabitleri elde edilebilir. Bu yardımcı olacaktır denemecileri farklı gerilim göstergeleri ile yapılan kendi ölçümlerin kinetik karşılaştırın. floresan iz çift üstel bozunma fonksiyonu ile tarif edilebilir hızlı ve yavaş bileşenleri göstermek olabilir. Bu durumda, hesap farklı genlikleri ile iki zaman sabitleri ile sonuçlanacaktır.
   3. th hesaplayınE ağırlıklı τ sabitleri tek bir bileşen olan sondalar iki zamansal bileşenleri sergileyen prob kinetik karşılaştırmak.
      Not: Aşağıdaki formül ile tanımlanan bir ağırlıklı tau nispi genlik ile çarpılır nispi genlik ile çarpılır τ ₁ toplamı, bir _{1 artı} τ _{2, 2} olarak hesaplanır;

Results

Geçici olarak transfekte hücrelerde anlamlı floresan değişimi ve plazma membranı ifade derecesi sergileyebilirler. Hatta aynı lamel bazı hücreler iç floresan çeşitli düzeylerde olacaktır. Bu durum, hücre tarafından emilen transfeksiyon ajanı miktarı muhtemeldir. Bazen çok fazla ifade apoptosis ²⁷ sonuçlanan gelişeceğini protein yanıt yaşamaya hücreyi neden (parlak, yüksek iç floresan ile, hücreler yuvarlak). deneyci, bu nedenle iç ifade gürültü oranı (SNR) sinyali düşürür duya...

Discussion

sinir sistemi çeşitli yollarla voltaj inhibisyon hafif hiperpolarizasyon, sinaptik girişi nispeten büyük bir gerilim değişikliği hafif bir depolarizasyonu ve hareket potansiyeli sonuçlar neden olur kullanır. GeViS tarafından membran potansiyeli değişiklikleri ölçmek yeteneği aynı anda nöronal devrelerin çeşitli bileşenleri analiz umut verici bir potansiyel sunmaktadır. Bu yazıda GeViS kullanarak membran potansiyelindeki görüntüleme değişiklikler için temel bir yöntem ortaya koymaktadır.

Geri...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ters Mikroskop	Olympus	IX71
60X objektif lensi (sayısal açıklık = 1.35)	Olympus	UPLSAPO 60XO
Uyarma filtresi	Semrock	FF02-472/30	Bongwoori Dikroik aynada süper ekliptik pHluorin'in voltaj görüntülemesi için
	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emisyon filtresi	Semrock	FF01-497/LP
75W Xenon ark lambası	CAIRN	OptoSource Aydınlatıcı	LED'ler ve lazerler de etkili ışık kaynaklarıdır
Yavaş hızlı CCD kamera	Hitachi	KP-D20BU
Çift portlu kamera adaptörü	Olympus	U-DPCAD
Yüksek hızlı CCD kamera	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
Görüntü ayırıcı	CAIRN	Optosplit 2
Uyarma filtresi	Semrock	FF01-475/23-25	Clover ve mRuby2'den oluşan FRET çifti tabanlı GEVI'nin voltaj görüntülemesi için)
Dikroik ayna	Semrock	FF495-Di03-25x36
Emisyon filtresi	Chroma	ET520/40
Dikroik ayna	Semrock	FF560-FDi01-25X36
Emisyon filtresi	Chroma	ET645/75
Titreşim izolasyon sistemi	Kinetik sistemler	250BM-IC, 5702E-3036-31
Yama odası	Warner aletleri	RC-26G, 64-0235
#0 Mikro Kapak Camı (22 x 40 mm)	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72198-20
Sıcaklık kontrolörü	Warner instruments	TC-344B
#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm çapında cam lamel	Ted Pella	260366
Lipofeksiyon ajanı	Yaşam Teknolojileri	11668-027
Kalsiyum fosfat reaktifi	Clontech - Takara	631312
Yama kelepçesi amplifikatörü	HEKA	EPC 10 USB amplifikatörü
Çok kanallı veri toplama yazılımı	HEKA	Patchmaster
Görüntü toplama ve analiz yazılımı	RedShirtImaging	Neuroplex
Spreadsheet uygulama yazılımı	Microsoft	Microsoft Excel 2010
Veri analizi yazılımı	OriginLab	OriginPro 8.6.0
Büyüteç	Qioptiq LINOS	Optem standart kamera bağlayıcı 0.38x SC38 J kelepçe
Konfokal mikroskop	Nikon	Nikon A1R konfokal mikroskop
Solma önleyici reaktif	Yaşam Teknolojileri	P36930