Yöntem makalesi

Retina Hastalıkları Değerlendirilmesi Nicel Otofloresans

DOI:

10.3791/53577

⸱

11 Mart 2016

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, NYU School of Medicine, 2Harkness Eye Institute, Columbia University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina pigment epiteli (RPE), lipofusin olarak biriken görsel döngü yan ürünlerini geri dönüştürerek duyusal retinayı destekler. Bu ürünler otofloresandır ve in vivo olarak kalitatif olarak görüntülenebilir. Burada, konfokal taramalı lazer oftalmoskopi kullanarak RPE lipofuscinini kantitatif olarak görüntülemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina pigment epiteli (RPE), üstteki duyusal retina ile yan yanadır ve görsel sistemin işlevini destekler. RPE tarafından gerçekleştirilen görevler arasında fagositoz ve lizozomdan türetilmiş organeller yoluyla dış fotoreseptör segmentlerinin işlenmesi yer alır. Depolanan ve lipofusin granülleri olarak adlandırılan bu bozunma ürünleri, kısmen, konfokal taramalı lazer oftalmoskopi (cSLO) ile fundus otofloresan olarak klinik olarak tespit edilebilen geniş floresan absorpsiyon ve emisyon spektrumlarına sahip bisretinoidlerden oluşur. Lipofuscin birikimi artan yaşla ilişkilidir, ancak retinanın hem edinsel hem de kalıtsal dejeneratif hastalıklarında çeşitli paternlerde bulunur. Bu nedenle, birikim paternini incelemek ve bu paternleri üstteki duyusal retinadaki değişikliklerle ilişkilendirmek, retina hastalığının patofizyolojisini ve ilerlemesini anlamak için çok önemlidir. Burada, hem sağlıklı hem de hastalıklı gözlerde RPE lipofuscin seviyesini ölçmek için laboratuvarımız ve cSLO kullanan diğerleri tarafından kullanılan bir tekniği açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina pigment epiteli (RPE) sayısız süreçleri 1 ile duyusal retinanın işlevini destekler. Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) sanayileşmiş ülkelerde tedavi edilemez körlüğün en önemli nedenidir ve pigment kaybı, fonksiyon ve atrofi kaybı dahil RPE değişiklikleri ile karakterizedir. AMD ve normal yaşlanma, RPE lipofusin granül olarak anılacaktır fagosite fotoreseptör parçalarını içeren floresan, lizozom türevi organeller birikir. RPE lipofusin birikimi oksidatif disfonksiyonu 1 belirtmek için düşünülmüştür, ancak son çalışmalar RPE morfolojisi yüksek lipofusin seviyeleri 2 ile yaşlı gözlerde normal kaldığını göstermiştir. AMD ve AMD ilerlemesi Ancak, lipofusin dağılımı anormal desenler, lipofusin özellikle kaybına, belgelenen belirteçler, histolojik ve klinik 3,4 hem de

arızalı süreçRPE lipofusin şarkı da belli kalıtsal retina dejenerasyonlar meydana geldiği görülmüştür. Stargardt hastalığı (STGH) muzdarip hastalar sonunda AMD 5 görülene benzer görme kaybına geliştirilmesi, genç yaşta RPE lipofusin birikir. Bu bulgular lipofusin birikimi kendisi toksik ve RPE disfonksiyonu 6,7 sürebileceği ileri sürdü. Ancak, zaman içinde STGH olan kişilerde ayrıntılı görüntüleme çalışması, odak lipofusin birikimi 8 sonraki RPE kaybına yol teyit etmedi. lipofusin anormallikler retina dejenerasyonlar için belirteçler olmasına rağmen Dolayısıyla, lipofusin doğrudan toksisitesi için bir rol kanıtlanmamış kalır.

RPE retinanın en arka hücre tabakası, ancak oküler fundus floresan sinyal çoğunluğunu oluşturur. RPE türetilen üretimi ve otofloresansı (AF) tespit vi sağlar konfokal tarama laser oftalmoskopi (cSLO) kullanılarak yapılabilirfundus AF mekansal dağılımı sualization. Bazı retina dejenerasyonlar bu durumların tanı ve takibinde ayırt edici fundus AF desenleri, ve AF görüntüleme yardımcıları göstermektedir. Standart AF görüntüleme klinik olarak önemli olmasına rağmen, kantitatif AF (Kaf) RPE sağlığını değerlendirmek önemli bir araç haline gelmiştir. Biz ve diğerleri güvenilir belirli retina yerlerde 9 at Kaf düzeylerini belirlemek için standart bir yaklaşım geliştirdik. Kaf potansiyel tanı uygulamaları ve retina durumlarının izlenmesini sahiptir ve aynı zamanda prognoz ve risk fayda olabilir. Buna ek olarak, QAF tanısal özellikleri, belirli retina bozukluklarının 10-12 için tarif edilmiştir. Burada, sağlıklı ve hastalıklı gözlerde değerlendirilmesinde uygulanması bir görsel gösteri eşliğinde bizim teknik gerçekleştirmek için adım adım ayrıntıları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Bu çalışmalarda kayıtlı tüm hastalar Tıp New York Üniversitesi Okulu'nda onaylanan kurumsal inceleme kurulu gözetim uyarınca bu yüzden yapılmıştır.

1. Hasta Seçimi ve Görüntüleme için ilk hazırlık

Not: Aşağıdaki malzemeler gereklidir:% 0.5 tropikamid oftalmik solüsyon,% 2.5 fenilefrin oftalmik solüsyon, cSLO spektral domain optik koherens tomografi (SD-OCT) ve iç floresan referans ile donatılmıştır.

  1. görüntüleme önce, uygun bir şekilde, üretici talimatlarına uygun olarak veri toplama için cSLO ayarlayın.
  2. cSLO bir iç floresan referansı monte edin. Not: üreticiden satın gibi iç floresan referans, bir metal halkaya yer almaktadır ve kamera lensi arkasında yerleştirilir. Başka bir üretici bir cSLO kullanılırsa, anlatılan daha başka bir konfigürasyon olabilirBu protokol.
    1. , CSLO içine referans eklemek çıkarmak için merceği büküm için, makinenin metal halka sökün ve referans içeren yeni metal halka ile değiştirin.
      Not: lazer gücü ve detektör duyarlılığı / kazanç varyasyonu için düzeltme sağlar iç floresan referans QAF tekniği için gereklidir.
  3. görüntüleme için işe hastalar rutin dilate göz muayenesi ve geçmiş göz tarih ve göz bulguları ile ortaya çıkabilir altta yatan tıbbi durumlar ile ilgili temel bilgileri elde var.
  4. % 0.5 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin ile öğrencileri dilate. KRİTİK ADIM: en az 6 mm pupili genişletmek. Not: Bu ışığın kesintisiz geçişi için gerekli ve böylece fundus optimal görselleştirme ve ölçüm içindir.
  5. görüntüleme öncesinde, çene çenelik dayayarak, cSLO düzgün hastayı konumlandırmak, alın forehea karşı yerleştirilird dinlenme ve yanal canthi düzgün göstergeleri ile uyumlu.

Göz Fundus 2. Baseline Görüntüleme

  1. İlk olarak, görüntü kaba odak makula üzerinde kamera merkezileştirme ve elde etmek için yakın kızılötesi yansıma (IR) ışık (820 nm dalga boyu) ile fundus.
    1. Hasta düzgün yerleştirilmiş olan IR görüntüleme modu için kontrol panelindeki donanım ayarını değiştirmek, fundus pozisyon kamera tam odak ve bir görüntü almak elle kadar
    2. Altta yatan hastalığın maküler değerlendirmek için IR görüntüleme ile birlikte spektral domain optik koherens tomografi (SD-OCT) kullanan kontrol paneline "IR-Ekim", ayarı ayarlayın.
    3. görüntüleme penceresi mevcut kılavuzlar fundus IR görüntü OCT yönlendirmek doğru kullanın. Optimal SD-OCT kalitesi elde Ekim görüntünün görüntüleme penceresinin üst üçte birinde olacak şekilde kamerayı konumlandırın. en az bir yatay çizgi sc Edinmefovea aracılığıyla ve tüm görüntüleme alanını kapsayan.

3. Kaf Görüntüleme kurma

  1. "Yüksek hızlı" görüntü elde etme kullanın. Not: Bu ayar sayesinde hasta hareketi ve iris veya göz kapaklarının ışığın ortaya çıkan tıkanıklık sinyal kaybı riskini azaltır hızlı görüntü elde etmek için izin verir.
  2. kare "9 ortalama" kullanın. Not: Bu ayar sonradan olabilir 9 görüntü kareleri, hızlı, sıralı yakalama sağlar (aşağıya bakınız) gürültü ve paraziti azaltmak için "ortalama".
  3. "30 x 30 derece" alanını kullanın. Not: Bu görüntü alımı sırasında yakalanan retina alanının dereceye karşılık gelir.
  4. Bu ilk başta endişe verici olabilir gibi görüntüleme öncesinde, mavi ışık ile ilgili hastayı uyarmak.
  5. AF modunu açın ve ekran maksimum fundus AF (taraf ve görüntünün köşelerinde minimal koyulaşması) ile "dolu" şekilde kamera ekseni hizalayın.
    1. Hastalar h EğerParlak mavi ışık tolere ave zorluk, daha uzağa göz kamera ile görüntüleme başlatın ve sonra fundus tam görünümünde olduğu kadar hastanın doğru yavaşça kamera getirmek.
      KRİTİK ADIM: Işık engellendiğinde giren veya göz çıktıktan, sinyal neden olur azalmıştır. Lokalize düşüş bir görüntü yan veya köşe asimetrik koyulaşması olarak görülebilir. göz hareketleri yalnız ışık geçişini engellemeye zaman sinyal Genelleştirilmiş kaybı görülür.
  6. AF sinyal alanı boyunca en yüksek seviyede olacak şekilde kamerayı aynı hizaya getirin. ancak onlar kabaca korelasyon, maksimum sinyal ziyade keskin görüntü için hedefleyin. elle veya oftalmoskop kamerayı joystick ile yeniden konumlandırmak için cSLO hareket ettirerek kamera odağı ayarlayın.
  7. fundus AF kolayca görülebilir şekilde hassasiyet / kazanç ayarlayın, ancak aşırı doygunluk kaçının. görüntü alımı sırasında, iç referans ya görünür renkli piksel (üst kısmında bulunangörüntü) ya da fundus sinyalinin doygunluk aşırı ve dolayısıyla kaybı gösterir.

4. Görüntü Alma

Not: KRİTİK ADIM: görüntü alımı amaç bir oturum içinde görüntüler arasında değişkenlik kontrol etmek için seans başına 2 yüksek kalite 9-kare görüntü yığınları elde etmek olmalıdır. Hastayı ve kamerayı yeniden konumlandırmak sonra, değişkenliği ikinci değerlendirmek için iki görüntü oturumu ve kontrolünü sağlamak. Tüm görüntüler sonuçta iç referans (aşağıda tarif edilmiştir) kalibre edilir.

  1. Sadece duyusal retinanın 9 rodopsin ışığın emilimini en aza indirmek için "ağartma" (AF ışık retinanın tam maruz kalma) en az 20 saniye sonra görüntü kazanır.
    1. Kamera hizalama, odak ve hassasiyetini optimize etmek için bu süreyi kullanın.
  2. taze gözyaşı filmi sinyal kalitesini artırır her görüntü alımı öncesinde yanıp konuları var.
  3. edinimi düzlemde göz kapaklarını kaçının.
    Not: daha zorlu hastalar için el açık göz kapaklarının yararlı olabilir. Yazarlar asistan bu görevi yerine öneririz.
  4. o ışık azalmış sinyal sonuçlanan iris ile tıkalı olmadığından emin olmak için her görüntü alımı öncesinde hizalama Optimize.
    Not: As, en azından küçük bir hareket çok yaygındır, yazarlar her görüntü alımı öncesinde gerekli ince yeniden düzenlenmesi önerilmektedir. Rehberlik ve görüntüleme azalma hareketini yardımcı olur hastayı teşvik etmek. Operatör oyalama en aza indirecek şekilde yazarlar da "satın alma düğmesi" olarak makinenin ayak pedalı kullanmanızı öneririz.
  5. sinyal-gürültü oranını artırmak için 9 kare yığının "ortalama" bilgisayar post-görüntü işleme gerçekleştirin. ortalamasını hesaplamak seçeneğini seçerek cSLO yazılımını kullanarak bir yığın ortalamasını hesaplayın.
    Not: Bazı kareler optimum kalitede olmayan yığınları olabilir (yani, lokalize veya yaygın si azalmıştırOptimal kareye kadar gnal göreceli), bu nedenle dikkatli bir şekilde her yığını incelemek ve ortalama hesaplama önce optimal çerçeveleri kaldırın.
    Not: olarak kabul edilebilir bir sinyal-gürültü oranına sahip ortalama görüntüler en aşağı 3 çerçeve arasında işlenebilir. taraf ve her görüntünün köşeleri cSLO kendi içinde sınırlamaları nedeniyle santral 20 derece daha düşük sinyal için normaldir.
    1. Yazılım operatörü gri düzeylerini normale isteyip istemediğinizi sorarsa, "Hayır" ı seçin 0 ile 255 arasında (yani, histogram germek). Bu analiz için değişmeden gri düzeylerini korumaktadır.

5. Görüntü Analizi

  1. Daha önce Kaf tekniği için geliştirilmiş görüntü analiz yazılımı kullanarak tarif edildiği gibi AF görüntüleri analiz (Igor; 9). Bu yazılımı kullanarak tipik bir görüntü analizinin kısa bir açıklaması aşağıda yer almaktadır.
    1. ihraç Igor içinde Kaf program ve (.bmp formatında) ithalat görüntüleri yüklemekpiksel en boy oranı 768 x 768 (varsayılan çıkış parametresi) ile cSLO yazılımı.
    2. Açılır menüde görüntüyü seçin ve analizi başlatmak.
    3. "Crosshair'i" foveayı ve "dirsek" optik diski (bu göstergeler İB'leri ölçek ve konumlandırmak için kullanılır) dayanması örten şekilde resmin üzerine kalibrasyon göstergelerini yerleştirin. Doğru bir şekilde yerleştirildiğinde, kullanım yazılımı daha sonra foveayı çevreleyen çevresel ROI (bkz Şekil 1, 2) ile görüntüyü doldurmak istemleri.
    4. iç floresan referans bulunanların seviyelere her görüntünün genel gri düzeyleri kalibre Igor seçeneği seçin. Not: Bu adım her görüntünün elektronik sıfır düzeyine ve her makinenin dahili referans kalibrasyon faktörü yanı sıra yaş, kırılma ve kornea eğrilik dahil hasta ile ilgili faktörler de dahil olmak üzere makine-ilişkili faktörler, kalibrasyonu için izin verir.
      Not: analiz yazılımı daha sonra sabit r görüntülerElde edilen görüntü ve QAF değerine egions her bölgede gösterilmiştir. Kaf değerleri otomatik olarak ayrı bir pencerede bir tablo biçiminde girilir. "
    5. komut istemleri dahilinde seçeneği seçerek Kaf "ısı haritaları" oluşturun. Tüm resimler ve veriler uygun seçenekleri seçerek bir excel elektronik tablodaki IGOR yazılım ihraç edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu teknik, her iki sağlıklı 13 ve hastalık durumlarında 10-12'de QAF incelemek için kullanılmıştır. Sağlıklı gözlerde (Şekil 1), RPE yayılan AF fundus (Şekil 1A) boyunca nispeten eşit olarak dağıtılır. Azaltılmış yoğunluğu nedeniyle maküler pigment ışığın bloke santral makula bölgesinde görülen ve iki tarafın ve görüntünün köşelerinde nedeniyle göz ve kamera optik etmektir. Gemiler koyu görünür ve iyi edinilen görüntülerde net bir o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anormal RPE lipofusin dağılımı, artmış ya da azalmış olup, retina hastalığı duyarlı bir göstergesidir ve genellikle duyu retina fonksiyonunun kaybı ile ilişkilidir. Burada, RPE lipofusin değerlendirilmesi için Kaf uygulanmasını açıklar. Bir iç floresan referans Ortaklığımızın standart görüntüleme tekniği yanında değişken lazer güç ve dedektör hassasiyeti 9 düzeltmek için AF seviyelerinin güvenilir kantitatif için izin verir. Bu yöntem, ilaç veya gen tedavisi gibi tıbbi müdahaleler etkinliğini değerlendirirken...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STA: açıklama yok, JPG: açıklama yok, RTS: danışman, Ocata Therapeutics.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz işbirlikçileri, Francois Delori, Tomas Burke ve Tobias Duncker teşekkür etmek istiyorum.

Araştırma Destek: NIH / NEI R01 EY015520 (RTS, JPG), ve Research sınırsız fonlar Körlük (GZT) Önlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Spectralis HRA + OCTHeidelberg Mühendislik
%0,5 tropikamid oftalmik çözeltiHerhangi bir marka kullanılabilir
%2,5 fenilefrin oftalmik solüsyonbir marka kullanılabilir
Dahili floresan referansıHeidelberg Engineering
IGOR Pro yazılımıWaveMetrics
Herhangi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological reviews. 85, 845-881 (2005).
  2. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 4832-4841 (2014).
  3. Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 56, 3242-3252 (2015).
  4. Schmitz-Valckenberg, S., Jorzik, J., Unnebrink, K., Holz, F. G., Group, F. A. M. S. Analysis of digital scanning laser ophthalmoscopy fundus autofluorescence images of geographic atrophy in advanced age-related macular degeneration. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 240, 73-78 (2002).
  5. Weng, J., et al. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt's disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell. 98, 13-23 (1999).
  6. Holz, F. G., et al. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin. Investigative ophthalmology & visual science. 40, 737-743 (1999).
  7. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1981-1989 (2000).
  8. Smith, R. T., et al. Lipofuscin and autofluorescence metrics in progressive STGD. Investigative ophthalmology & visual science. 50, 3907-3914 (2009).
  9. Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 9379-9390 (2011).
  10. Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 2841-2852 (2014).
  11. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in best vitelliform macular dystrophy. Investigative ophthalmology & visual science. 55, 1471-1482 (2014).
  12. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence distinguishes ABCA4-associated and non-ABCA4-associated bull's-eye maculopathy. Ophthalmology. 122, 345-355 (2015).
  13. Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 5684-5693 (2013).
  14. Delori, F. C., Goger, D. G., Dorey, C. K. Age-related accumulation and spatial distribution of lipofuscin in RPE of normal subjects. Investigative ophthalmology & visual science. 42, 1855-1866 (2001).
  15. Sparrow, J. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in mice: correlation with HPLC quantitation of RPE lipofuscin and measurement of retina outer nuclear layer thickness. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2812-2820 (2013).
  16. Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. American National Standards Institute. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, image science, and vision. 24, 1250-1265 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fundus AutofluorescenceRetinal Pigment EpitheliumConfocal Scanning Laser OphthalmoscopyLipofuscin QuantificationAge Related Macular DegenerationGeographic Atrophy AnalysisHigh Speed Image AcquisitionMean of 9 FramesInternal Fluorescent ReferencePupil Dilation Protocol

İlgili makaleler