Üç boyutlu Biyomimetik Teknoloji: Roman Biorubber Kollajen Hidrojeller içinde Mikro ve Makro ölçekli Mimarileri Tanımlı oluşturur

Özet

İn vivo dokunun mimari özelliklerine, bileşenlerine ve mekanik özelliklerine benzeyen üç boyutlu yapıları tasarlamak için yenilikçi bir biyofabrikasyon tekniği geliştirilmiştir. Bu teknik, çok çeşitli dokuların in vivo mimarilerini yeniden üreten, ayrıntılı uzamsal özellikleri aktaran yeni geliştirilmiş bir kurban malzemesi olan BSA kauçuğuna sahiptir.

Özet

Doku iskeleleri doku rejenerasyonu sürecinde önemli bir rol oynamaktadır. İdeal iskele gibi olan uygun kompozisyon, hedeflenen modülü ve iyi tanımlanmış mimari özellikleri gibi çeşitli koşulları yerine getirmelidir. In vivo doku içsel mimarisi özetlemek Biyomalzemeler hastalıkları okuyan yanı sıra kayıp ve kusurlu yumuşak doku rejenerasyonu kolaylaştırmak için hayati önem taşımaktadır. Bir roman biofabrication tekniği araştırma ve klinik uygulama için biyomalzeme yeni bir nesil oluşturmak için sanat görüntüleme, üç boyutlu (3D) baskı ve seçici enzimatik aktivite durumunu birleştiren geliştirilmiştir. geliştirilmiş bir malzeme, Bovine Serum Albumin kauçuk spesifik geometrik özelliklerini koruyan bir kalıba enjekte reaksiyondur. Bu kurban malzeme doğal iskele malzemesi mimari özellikleri yeterli transferini sağlar. Prototip 4 ve 3 mm kanalları Repr ile 3 boyutlu bir kollajen iskele oluşmaktadırdallı mimari ESENT. Bu yazıda, doğal yapıları nesil bu biofabrication tekniğinin kullanımı vurgulamaktadır. Bu protokol, bir bilgisayar destekli yazılımı (CAD) iskele malzemesi içinde mimari özelliklerinde, lastik enzimatik sindirme ile ve ardından BSA kauçuk enjekte Reaksiyon olacak katı kalıp üretmek için kullanır.

Giriş

Doku mühendisliği alanında doku iskeleleri imal yeteneği hayati önem taşımaktadır. Uygun bir ince kağıt skafold 3B bir yapıya sahiptir, biyolojik olarak uyumlu malzemelerden oluşan ve in vivo doku mimarisi taklit eden doku ve hücre büyüme ve yeniden kolaylaştırmak için. Bu iskele besin taşınmasını ve atıkların ^1-4 kaldırılmasını izin vermelidir. Bu iskelelerinin üretiminde ana engellerden biri biyouyumlu malzeme içine belirli geometrik özellikleri özetlemek yeteneğidir. Çeşitli biofabrication teknikler bu iskelelerinin geometrik özellikleri kontrol etmek için rapor edilmiştir, örnekler, solvent döküm ^9, stereolitografi ^{10 5-8} elektrospinning vardır, ve diğerleri arasında, ¹¹ 3D baskı. Bu teknikler kontrol, iç ve dış mimari özellikleri nispeten kolay aktarım sağlayan kısa düşmek, pahalı, onların çözünürlük ve basılabilirlik (ile sınırlıdır vardır örneğin, meme göstergesi, malzeme kısıtlama), ya da yaşayabilir iskeleleri ¹² üretmek için uzun bir zaman periyodu talep sonrası imalat teknikleri gerektirmektedir.

Pek çok ticari üretim sistemlerinde, iç boşluklar, kanal ve özelliklerin oluşturulması kum ya da başka uygun bir çıkartılabilir ya da gözden çıkarılabilir malzemeler kullanılarak elde edilir. Metal veya plastik kısım kum kalıp etrafında oluşturulur ve bu bir kez katılaştınldıktan sonra, kum kaldırılır. hemen hemen aynı şekilde, biyomalzeme nesil biosand eşdeğer ihtiyacı var. Bu nedenle, BSA kauçuk biosand için bir yedek olarak geliştirilmiştir. BSA kauçuk glutaraldehit ile çapraz bağlanmış sığır serum albümini içerir yeni formüle malzemedir. Nihai hedef biyobozunur kollajen iskele içine özgü mimari özellikleri yeniden etmektir. Orijinal doku kalıp boyutlu sadakat korur kurban biorubber özellikleri açıklanmıştır.

BSA ve glutaraldehit konsantrasyonları çeşitli kombinasyonları çeşitli çözücüler kullanılarak test edilmiştir. Bu materyal, BSA ve glutaraldehid arasındaki reaksiyon ile oluşturulmuştur. BSA kauçuk doku kalıpları karmaşık geometriler enjekte reaksiyon olabilir. Çapraz bağlı BSA kararsız ve kolayca hafif pH ve sıcaklık koşullarında enzimi tarafından sindirilerek tripsin edilir. Tersine, I kolajen bozulmamış tip tripsin sindirim karşı çok dayanıklıdır. Bu özellikler seçici geride kolajen bırakarak BSA lastik çıkarmak için büyük harfle bulundu. Bu çalışma bir biyouyumlu iskele özgü mimari özellikleri sunabilen bir kararsız kalıp almak için gerekli ideal bir parametrelerin belirlenmesinde oluşuyordu. değerlendirilmiştir spesifik özellikleri mixability enzim sindirimi, yük taşıma ve negatif kalıbın içine enjekte tepki yeteneği dahil. % 30 BSA ve% 3 glutaraldehid kombinasyonu bu gereksinimleri karşılar. Bu protokol necess sağlarli kurallar bu üç boyutlu iskeleleri oluşturmak için. Prototip, bir giriş ve sırasıyla 4 ve 3 mm, çapında iki çıkış kanalı olan bir dallı mimarisini temsil eden bir kollajen iskele oluşur. Bu teknik, ilgi konusu doku makro- ve mikro-ortamları taklit etmek için bir potansiyele sahiptir. Bu teknoloji, in vivo doku esnekliğini ve ilgi doku diğer özellikleri taklit etmek ayarlanmış olabilir yüksek sadakat, nispeten kolay ve zamanında konuda bir biyolojik olarak parçalanabilir malzemeye belirli bir geometrik öğretici sunmak için uygun bir teknik sağlar.

Protokol

1. Kollajen Toplu İş Katıların yüzdesi belirleyin

1. Önceden yayınlanmış bir prosedüre ¹³ sonrası kollajen ekstrakte edin. Kollajen, 20 ml, en az çözülme. oluşan hidrojellerin kollajen konsantrasyonunu işlemek amacıyla toplu kollajen katıların ilk yüzdesini belirleyin.
   1. Alüminyum folyo (yaklaşık 6 x 6cm ebadında), üç adet kesin ve 25 ml'lik bir cam kaba alt kullanarak bir tava her biri şekil. Her tavada ağırlığını kaydedin.
   2. Her bir tavaya kolajen bir miktar ilave edin ve bir alüminyum kaba ve kollajen toplam ağırlığı kaydedin. Her alüminyum tava kollajen 0.8 g - 0.5 ekleyin.
      Not: Bu işlemden sonra, orada üç alüminyum folyo tava ve her biri kollajen bir miktar olmalıdır. Her (toplam 3) boş alüminyum tava ağırlığı ve kollajen ilavesinden sonra tencerenin ağırlığını kaydetmek için emin olun.
   3. f kullanarak her tavada kollajen ağırlığı hesaplamakformülü ollowing:
      Kollajen ağırlığı = Pan ve kolajen ağırlık - Pan ağırlığı
   4. 24 saat boyunca 100 ° C'de bir fırında kolajen tutan üç alüminyum tava yerleştirin.
   5. 24 saat sonra, her bir alüminyum tavaya ağırlığını ve kurutulmuş kollajen kaydedin.
   6. Aşağıdaki denklem kullanılarak susuz kollajen ağırlığı hesaplanır:
      Susuz kollajen ağırlığı = Pan ve kurutulmuş kollajen ağırlığı - Pan ağırlık
   7. üç örnek aşağıdaki formül kullanılarak kollajen katı konsantrasyonunu belirlemek için katı yüzdesini hesaplayın:
      
   8. Üç örneğin her biri için, kollajen katıların yüzdesi kullanarak toplu ortalama kollajen bir katı miktarı hesaplanır.
      Not: kullanılacaktır kollajen hidrate kollajenin sol budur. susuz kollajen hiçbiri kullanılacaktır.
   9. kollajen katı (i yüzdesini belirledikten sonratoplu nitial kollajen konsantrasyonu), geri kalan hidrate kollajen kullanmaya devam edin. 3 kolajen partisinin pH'ı ayarlamak için kalibre edilmiş bir pH metre kullanımı.
      1. az miktarda 12 N hidroklorik asit (HCl) içinde (her seferinde 2-5 ul) eklenir. her zaman buz üzerinde tutun. kollajen doğrudan hidroklorik asit ilave etmeyin - tüp tarafına asit ekleyin. asit ilave edildikten sonra, kolajen asit itmek ıspatula ve hızlı bir şekilde karıştırın.
   10. Bu 3 arasında bir pH değerine ulaştığında, kollajen, 4 ° C de O / N bekletin.

BSA Kauçuk 2. Hazırlık

1. Aşağıda listelenen prosedür takip Sığır Serum Albumin (BSA) çözeltisi hazırlayın.
   1. 2x Fosfat Tamponlu Salin solüsyonu (PBS) hazırlayın. 0.02 M PBS çözeltisi yapmak için, 100 ml su için iki PBS tablet ekleyin.
   2. Aşağıda listelenen prosedürü kullanarak% 30 BSA çözüm oluşturmak için 2x PBS ile BSA birleştirin.
      1. Örneğin, 2x PBS ile 30 ml% 30 BSA hale BSA 12.9 g kullanımı. Bir karıştırma çubuğu olan bir şişeye 2x PBS (örneğin, 10 mL) 1/3 ekleyin. Şişeye BSA (örneğin, 6.45 g BSA) 1/2 eklenir ve bir ıspatula kullanılarak, kuru bir çözünmüş madde ıslak.
      2. tüm çözünen kadar PBS ve sonra BSA ekleyerek bu işlemi tekrarlayın ve çözücü şişede olduğunu. tüm çözünen ıslak spatula kullanın. Bazı sıvı ve topaklar bir karışımı gibi görünecek. yaklaşık 30 dakika boyunca bekletin.
      3. Sonra, bir düşük döngüsünde karıştırıcı açmak ve karıştırma çubuğu etrafında kümeleri olmadığından emin olun. Bu çözelti içinde her şeyi almak için 90 dakika sürer ya da 4 ° C 'de O / N karıştırıldıktan bırakılabilir. Çözünen Tüm eridikten sonra, 20 ml'lik bir şırınga içinde çözelti yerleştirin ve 0.20 um'lik bir şırınga filtresi ile kapatıldı. filtre içinden sıvı kovmak ve yeni bir tüp içinde steril solüsyon toplamak için pistonu basınız. 4 ° C'de saklayın.
   3. % 3 glutaraldehid soluti hazırlanmasısteril süzülmüş 2x PBS ile% 25 glutaraldehit solüsyonu seyreltilmesi ile ilgili. Örneğin,% 3 glutaraldehit çözeltisi 10 ml, 2% 25 glutaraldehid eklenir ve 2x PBS 8 ml kullanın. 4 ° C'de saklayın.

3. Kalıplar Tedavisi

Not: Bu yazıda anlatılan prototip bir özel yapılmış paslanmaz çelik Y kalıp parçasını kullanır. Kalıp bir giriş ve sırasıyla 4 ve 3 mm, iki çıkış kanallarını içerir. İlk olarak, temiz kalıpları, doymamış domuz yağı ile onları sprey, ve onları sterilize. Aşağıda tarif edilen prosedür takip kalıpları hazırlayın.

1. 35 kHz frekansta sonikatör kullanarak temiz paslanmaz çelik kalıplar. sonikatörde kalıpları yerleştirin ve su ve buz ile daldırın. sonikatör çalışırken her zaman soğuk kalıpları tutun. 90 dakika 2 dönemler için sonikatör çalıştırın.
   1. Her dönemden sonra, Luer hiçbir malzeme paslanmaz çelik veya b kilit olduğundan emin olmak için bir iğne kullanınrass konektörü. kalıp iki tarafın tüm yüzeyini temizlemek için sabun ve su kullanın. kanallarda herhangi bir engel olduğunu doğrulayın.
2. Bir otoklav torbasına kalıplar, vidalar ve Luer lock konnektörü yerleştirin ve otoklav.
3. piyasada mevcut domuz yağı (karışık yağ asidi çözücü ajan) ile bir hava püskürtücü yarım verdiği şişeye doldurun. Düzenli kapak şişe kapağı değiştirin. Bir otoklav poşetine koyun ve otoklav.
   Not: domuz yağı, daha sonra enjekte Reaksiyon olacak bir materyal (BSA kauçuk) çıkartılmasını kolaylaştırmak için kullanılır. iç mühür zarar verebilir otoklav- püskürtücü şişe kapağı koymayın.
4. 45 saniye ya da bir mikrodalga fırında berrak ve sıvı kadar domuz yağı ısıtın. domuz yağı şişesine hava püskürtücü kapağı vidalayın. püskürtücü ile kapağı bağlayın. laboratuvar tezgah hava kaynağına püskürtücü takın. Hava valfini açın ve yüzey ıslatma başlayana kadar püskürtücü meme açmakBir kağıt havlu.
5. Yüzey tamamen kaplıdır kadar kalıp yüzeyine dik domuz yağı püskürtün. her parça püskürtülür edildikten sonra, bir Petri kabındaki koyun ve kapağını kapatın. 2 saat süreyle 4 ° C 'de kalıplar yerleştirin.
6. 30 dakika boyunca UV ışığına sathının getirilmesi sureti ile kalıp sterilize edin. onlar tepki enjekte olmaya hazır olana kadar 4 ° C'de onları geri yerleştirin.

BSA Kauçuk 4. Reaksiyon Enjeksiyon

Not: Bir sonraki adımda BSA kauçuk erken ayarını önlemek için kullanmaya hazır olana kadar tüm malzemeler ve çözüm soğuk tutmak gerekir.

1. aşağıdaki adımları kalıplara BSA kauçuk sunmak için vericiyi hazırlayın.
   1. Karıştırma tüm bileşenlerin sterilize: polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) başlığı içinde, 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılmasıyla (iki O halkalar, şırınga kapağı, çift şırınga ucu karıştırın ve 4 1 dağıtıcı).
      Not: Bir PCR kaput t çünkü kullanıldıBu prosedürün fiksatif içerir. Bu kimyasal maddeler nedeniyle hücrelerine maruz kalma ve toksisite riski hücre / doku kültürü kaputu kullanılamaz. UV ışığı içeren herhangi bir başka kaput uygun olacaktır.
   2. Çözelti tutucu ucu kapağını yerleştirin.
   3. BSA: 1 oranında bir 4: karıştırma ve enjeksiyonun gerçekleştirilmesi Glutaraldehit. çözümün en yüksek miktarda teslim edecek çift şırınga haznesine% 30 BSA ekleyin (Bu doldurmak için yaklaşık 4 ml alacaktır). Bitişik odasının taşan ve kirlenmesini önlemek amacıyla O ring yerleştirmek için yeterli boşluk bırakın emin olun.
   4. diğer odaya% 3 glutaraldehit solüsyonu ekleyin (bunu doldurmak için yaklaşık 1 ml alacaktır). Bitişik odasının taşan ve kirlenmeyi önlemek için O ring yerleştirmek için yeterli boşluk bırakın emin olun.
   5. dağıtıcının çift şırınga yerleştirin. Şırınga kap üstünde olacak şekilde dikey olarak derleme eğin. karıştırma ucu ile kapağı değiştirin.
   6. scBirlikte iki paslanmaz çelik kalıp parçaları rew.
   7. otoklav torbanın iç montaj yerleştirin.
   8. dağıtıcı herhangi bir havayı çıkarmak için, dik konumda tutun ve hızlı bir şekilde tutamacı gluteraldehit ile karışık BSA küçük bir miktar serbest bırakmak için bir kez sıkın. Sonra hızlı bir şekilde şırınga ucu paslanmaz çelik Y Kalıbın Luer kilit bağlantısını takın.
   9. sol el ve sağ tarafta BSA-Glutaraldehyde karışım dağıtıcı ile paslanmaz çelik Y kalıp tutun. Alternatif içindeki boşluklar çözeltisi ile doldurulur emin olmak için, bir otoklav torbanın kenarlarına egzoz basarak çıkış kanalları sol ve sağ egzoz her kaplama. Ardından, yatay kalıpları yerleştirmek ve tekrar enjekte.
   10. 25 mm Petri kabındaki dağıtıcı ve yerden kalıpları ayırın.
   11. kauçuk su kaybını önlemek için Petri kabı etrafında Parafilm yerleştirin.
   12. 4 ° C buzdolabı O / N kalıp yerleştirin.

Not: kolajen işlemi sırasında her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.

1. Kollajen katıların yüzdesini kullanarak kollajen konsantrasyonu değiştirin.
   1. Soğuk su ile ilk kollajen konsantrasyonunu ayarlayarak% 1.75 kollajen 10 ml olun.
   2. kalibre edilmiş bir pH metre kullanılarak, 12 N hidroklorik asit kullanılarak pH'ı 3'e ayarlanır. kollajen doğrudan hidroklorik asit ilave etmeyin tüp tarafına asit ekleyin. asit ilave edildikten sonra, kolajen içine asit itmek için ıspatula ve hızlı bir şekilde karıştırın.
   3. Ayrı konik bir tüp içinde kollajen 4 g tartılır.
   4. 4 ° C ve 20-30 dakika boyunca 9,343 x g'de havayı çıkarmak için kollajen santrifüjleyin.
   5. 30 dakika boyunca hücre kültürü kapağı sterilize ve 4 ml kolajen laminin 14 ul, UV. Bu 10 ug / ml bir son konsantrasyonda laminin ile sonuçlanacaktır. Not: Laminin s sağlartructural bütünlüğü, yapışma, çeşitli hücresel tepkileri teşvik etmektedir.
   6. önce sterilizasyon için kaputu kullanarak PCR UV 20-30 dakika süreyle üzerinde ışık açın.
   7. 2 saat boyunca, etanol içinde bir 20 ml şırınga eklemek için, Luer kilit kapağı yerleştirin. Sonra kurumaya ve UV ışık yerleştirmek için izin verir.
   8. Gama 1200 cGy ulaşmak için 8.6 dakika boyunca kollajen ışın tedavisi.
      Not: Zaman Sezyum kaynağının çürüme bağlıdır. Aynı doz ulaşmak için saati ayarlayın.

BSA Kauçuk üzerinde Kolajen 6.Casting

1. 1: 1 oranında, (kollajen: HEPES: MEM) kollajen polimerize etmek için, bir 8 kullanın. Aşağıdaki prosedür, (Kademe 5.1.8 arasında) ile asitleştirildi kollajen ilk 4 g dayanır.
   1. su içinde 0.2 N HEPES çözeltisi yapmak ve 1-5 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi, az miktarda (1-5 ul) eklenmesi ile pH 9'a ayarlanır. kalibre edilmiş bir pH metre kullanılarak, her eklemeden sonra, solüsyonun pH değerinin izlenmesi. 4 ° C veya ke saklayınbuz üzerinde ep.
   2. Kaputu sterilize etmek için 20-30 dakika süreyle doku kültürü kaputu UV ışığı açın.
   3. Otoklav forseps, spatula, ve sterilizasyon için neşter.
   4. Doku kültürü kapağı kullanarak, 0.2 N HEPES (pH 9) ve mi 10x MEM 1.5 1.5 mi karıştırın. Kullanmadan önce 5 saniye boyunca buz ve vorteks onu tutmak için emin olun. 4 ° C'de saklayın veya buz üzerinde tutmak.
   5. PCR kaput sterilize etmek için, 30 dakika boyunca UV ışığı açın.
   6. 10 dakika boyunca -20 ° C'de bir 12 kuyulu plaka ve bir 20 ml şırınga yerleştirin veya hazır olana kadar devam etmektedir. Not: Kullanıma hazır olana kadar soğuk tüm malzemelerini saklayın. Sıcaklık artışı, erken kollajen fibrillogenesis indükler.
   7. % 70 etanol ile kaputun olması ve sterilizasyon için kurumaya bırakın olacak tüm tüpler ve iyi plakaları püskürtün. daha sonra kullanmak için soğumaya buz üzerinde 20 ml şırınga yerleştirin.
   8. PCR kaputu, BSA kauçuk ve bir neşter kullanılarak serbest bırakmak için paslanmaz çelik kalıpları açmak BSA r egzoz kanalları kesmekubber kalıp.
   9. PCR Kaputun altında, HEPES-MEM çözeltinin 1 ml steril kollajen tüplerini açıp ekleyin (emin olun iyi karışık ve hiçbir katı mevduat olduğunu, HEPES-MEM çözüm ayıklanması önce).
   10. Steril spatula kullanarak, iyice kollajen ve tampon çözelti karıştırın.
   11. Kapatın ve girdap hızla bir iyi karıştırılmış hidrojel sağlamak.
   12. Soğuk 20 ml şırınga aktarın.
   13. Tek bir el ile, kuyunun içindeki BSA Kauçuk tutun ve diğer kullanılarak kuyunun dibine kolajen hidrojel çözeltinin yansı dağıtın.
   14. Steril cımbız kullanarak, kauçuk giriş ve çıkış uçları iyi yanlarını dokunmadan emin olun.
   15. tamamen kaplıdır kadar kauçuğun üstünde kolajen çözeltisi dökülür.
   16. BSA kauçuk kollajen içinde askıya alındığını ve özellikle lastik uçlarına yakın hiçbir kabarcıklar, bulunmadığından emin olun.
   17. Kapağı yerleştirin ve etrafına sarın ParafilmKuyunun çevresi.
   18. 37 ° C'de 1 saat boyunca kuluçkaya konulmuştur. PCR UV ışığı tutun.
2. kollajen Polimerizasyondan sonra UV aşağıdaki yöntemle hidrojel çapraz bağlanırlar.
   Not: kollajen, çapraz bağlama enerjisi miktarı kontrol edilebildiği bir UV çapraz bağlayıcı cihazı kullanılarak yapılır.
   1. UV çapraz bağlayıcı açın ve 630.000 μJ / cm ² ile boş odasını saçmak için enerji ayarını kullanın.
   2. inkübatör jeller çıkarın.
   3. etanol ile ellerini Sprey ve, odasının içine mümkün olduğunca çabuk kapağı çıkarın.
   4. Odasına kapatın ve UV enerji ayarını seçerek ve 630.000 μJ / cm ² ışınlanması ile hidrojeller çapraz.
   5. Çapraz bağlama döngüsünden sonra, PCR örtünün üzerinde UV ışığı kapatmak
   6. etanol ile ellerini Sprey ve hızlı bir şekilde plaka üzerine geri kapağını yerleştirerek, odasını açın. plaka taşıPCR kaput.
   7. yavaşça gevşetin ve kuyudan jel kaldırmak, steril spatula ile. hidrojel alt çapraz bağlanması için kaputun altında jeller çevirin. Adımı tekrarlayın 6.2.3 ve 6.2.4.

BSA Kauçuk 7. Enzim Sindirim

1. içi boş bir kollajen iskele sahip olmak için, hidrojel gömülü boyutları etkilemeyen bir şekilde BSA Kauçuk çıkarın. Prosedür aşağıda tarif edilmektedir.
   1. doku kültürü kaput sterilize etmek için 20-30 dakika süreyle UV ışığı açın.
   2. % 0.25 tripsin solüsyonu pH 7.8 sağlayın. Örneğin, 15 ml su, bir 50 ml konik bir tüp içinde tripsin 0,0376 g ekleyin. 1 M NaCl, az miktarda (2-5 ul) eklenmesi ile 7.8'e pH ayarlayın. 20 ml'lik bir şırınga içinde çözelti yerleştirin ve 0.20 um'lik bir şırınga filtresi ile kapatıldı. filtre içinden sıvı kovmak ve yeni bir tüp içinde steril bir çözüm toplamak için pistonu basınız.
   3. su banyosu açın ve 30 sıcaklığını ayarlamak° C.
   4. 30 dakika sonra, UV ışığı kapatın. kaputu kullanılacak olan tüm boru ve malzemeler üzerinde etanol püskürtün.
   5. Ayrı konik tüp başlık ve yer altında kollajen hidrojel aktarın.
   6. Her tüpe 7.8 bir pH ile,% 0.25 tripsin solüsyonu (jeller kaplamak için yeterli miktarda) 3-5 ml ekleyin.
   7. Yaklaşık 1 dakika boyunca hafifçe Parafilm ve vorteks tüpleri Seal.
   8. 15-24 saat boyunca 30 ° C su banyosunda yerleştirin. BSA kauçuk dijeste veya hidrojel kaldırıldı kadar su banyosu içinde iken, hafifçe sık jeller girdap.
      Not: Amacıyla BSA kauçuk kaldırıldı olup olmadığını belirlemek için, ya kauçuk tripsin solüsyonu içinde yüzen ya da dökümünü parçaları vardır. hidrojel içinde hiçbir görsel karanlık alanlar olmalıdır.
2. aşağıda açıklandığı gibi tüm BSA kauçuk ve tripsin hidrojeller kaldırıldı emin olmak için, durulayın.
   1. PCR hoo açın20-30 dakika d UV ışığı.
   2. Mosconas çözüm hazırlayın. Su içerisinde potasyum klorid (KCl, 28.6 mM), _(NaHCO3, 11.9 mM), glikoz (9.4 mM) ve (NaH _{2 PO 4, 0.08} mM) bir araya getirin. 1 M NaOH ve 12 M HCI çözeltisi ile 7.4'e pH ayarlayın. 20 ml'lik bir şırınga içinde çözelti yerleştirin ve çözelti sterilize etmek için 0.20 um bir şırınga filtre kullanın.
   3. örtünün üzerinde yerleştirerek önceden etanol ile sprey her şey ve etanol kurumasını bekleyin.
   4. tüp açın ve yeni bir 50 ml konik tüp, steril Mosconas çözeltisi 5-10 ml aktarın.
   5. enzim çözeltisi içeren konik tüp kollajen hidrojel aktarın. hidrojel tamamen çözümü ile kaplı olduğundan emin olun. 30 dakika boyunca 4 ° C'de buzdolabında çalkalayıcı tüpü boş.
   6. Mosconas çözümü ve iki kez adımı yineleyin 7.2.5 aspire.
   7. 4 ° C'de saklayın.

Sonuçlar

Sonuçlar, bu biofabrication tekniği in vivo doku görülen uzamsal taklit 3D iskeleleri üreten etkili olduğunu göstermektedir. Mimari özellikleri doku in vivo hücre etkileşim ve işlevsellik açısından önemli bir rol oynayan doku mühendisliği uygulamaları için hayati parametreler vardır.

BSA kauçuk tutarlılık ve mixability homojen ve hedeflenen şeklini korumak için güçlü bir BSA lastik üretiminde önemli bir param...

Tartışma

Biofabrication biyoloji ve mühendislik prensipleri yerli doku taklit karmaşık materyalleri üretmek için birleştirme hangi bir derece disiplinli bir alandır. Bunu başarmak için, in vivo doku elde edilen bilgileri kullanarak ve bir in vitro iskele çevirmek teknikleri geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Bu şekilde, platform yakın in vivo doku, mimari, işlevsel ve mekanik özelliklere benzer olduğu tasarlanabilir. Optimal iskele malzemesi, biyo-uyumlu olarak, belirli özelliklere sahiptirler ilg...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kollajen tip I			Baldır derisinden ekstrakte edilen kollajen
Hidroklorik Asit (HCl)	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS Tabletleri)	MP Biomedical	U5378	100 ml'de 1 tablet sığır serumundan 1x PBS
Albümyum yapar (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Glutaraldehit	Sigma -Aldrich	G5882	Zehirli Domuz
Yağı	Tarlaları	3090
Paslanmaz Çelik Kalıplar			Microlution Makinesi Kullanılarak Öğütülmüş
Hava Fırça Kiti	Merkezi Pnömatik	47791
Çift şırınga için Karıştırma Ucu	Medmix	ML2.5-16-LLM	Mikser, DN2,5X16, 4:1 kahverengi, med
Çift şırınga için küçük O halkası	Medmix	PPB-X05-04-02SM	Piston B, 5 ml, 4:1, PE doğal
Çift Şırınga kapağı	Medmix	VLX002-SM	Kapak, 4:1/10:1, PE kahverengi,
çift şırınga için med Big O halkası	Medmix	PPA-X05-04-02SM	Piston A, 5 ml, 4:1
Çift Şırınga	Medmix	SDL X05-04-50M	Çift şırınga, 5 ml, 4:1
Çift Şırınga Dispenseri	Medmix	DL05-0400M	Dispenser, 5 ml, 4:1, med, düz
Laminim			3.6 mg / ml - ekstrakte edilmiş USC laboratuvarı
20 ml Şırınga Luer Kilit Ucu	BD	302830
Luer Kilit Kapakları	Fisher	JGTCBLLX
HEPES	Sigma -Aldrich	H4034
Gibco Minimum Temel Medya 10x (MEM)	Yaşam Teknolojileri	1143-030
Tripsin	Yaşam Teknolojileri	27250-018
UV Çapraz Bağlayıcı ve nbsp;	Spektroline UV	XLE1000
Sodyum Klorit (NaCl)	Fisher	S271-10	Mosconas
Potasyum klorür (KCl)	Sigma hazırlamak için -Aldrich	P5405-250	Mosconas
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)	Fisher	BP328-500	Mosconas
Glucose	Sigma hazırlamak için -Aldrich	G-8270	Hazırlamak için Mosconas
Sodyum Fosfat didasik (NaH2< / sub>PO4< / sub>)	Sigma-Aldrich	S-7907
Şırıngalar için	Corning	431224