Yöntem makalesi

Bir "humanize" oluşturuluyor Drosophila S2 Hücre Hattı Duyarlı

DOI:

10.3791/53594

⸱

20 Ocak 2016

 , 
1Molecular and Cellular Biology Graduate Group, Biology Department, University of Massachusetts, Amherst

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kinesin-5'in küçük moleküllü inhibitörlerine duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattının nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu hücrelerin hücre tabanlı bir hata düzeltme testinde kullanımı da ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinetokorlar, hücre bölünmesi sırasında sentromerler üzerinde birleşen ve kromozomları iğ mikrotübüllerine bağlayan büyük protein bazlı yapılardır. Genetik materyalin uygun dağılımı, her kromozomdaki kardeş kinetokorların, anafaza ilerlemeden önce zıt iğ kutuplarından mikrotübüllere bağlanarak çift yönelimli hale gelmesini gerektirir. Bununla birlikte, hatalı, çift yönelimli olmayan bağlanma durumları yaygındır ve hücre bölünmesi sırasında bu tür bağlanmaları hem tespit etmek hem de düzeltmek için hücresel yollar mevcuttur. Uygun olmayan kinetokor-mikrotübül etkileşimlerinin kararsızlaştırıldığı süreç, hata düzeltme olarak adlandırılır. Canlı hücrelerde hata düzeltmeyi incelemek için, kinesin-5 motorunun kimyasal inhibisyonu yoluyla kasıtlı olarak yanlış ataşmanlar üretilir, bu da monopolar iğ düzeneğine yol açar ve ilacın yıkanmasını takiben yanlış oryantasyondan çift oryantasyona geçiş gözlenir. Birçok model doku kültürü hücre tipindeki çok sayıda kromozom, bireysel hata düzeltme olaylarının gözlemlenmesinde bir zorluk teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücreleri, en az 4 çift kromozoma sahip oldukları için bu tür çalışmalar için daha iyi deneklerdir. Bununla birlikte, küçük moleküllü kinesin-5 inhibitörleri Drosophila kinesin-5'e (Klp61F) karşı etkisizdir. Burada, hücreleri motorun farmakolojik inhibisyonuna duyarlı hale getiren ve hücre bazlı hata düzeltme testinde kullanıma uygun hale getiren Klp61F'yi insan kinesin-5 ile etkili bir şekilde değiştiren bir Drosophila hücre hattının nasıl oluşturulacağını açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre bölünmesi sırasında genomun Eşit ayrımı çoğaltılmış DNA ve iğ mikrotübüller arasında doğru etkileşimi gerektirir. Mikrotübüller fiziksel kinetokor oluşumunu uyarır 1 olarak bilinen sentromer çeviren proteinlerin bir topluluk sayesinde kromozomlar ile etkileşim. Kromozomların doğru dağıtım kardeş kinetokorlar burada her kardeş zıt kutuplarda iğ kaynaklanan mikrotübül ile ilişkili, iki-yönlenmeli gerektirir. Kinetochore mikrotübül (kt-MT) iki-yönde yönlendirilmiş konformasyonunda olmayan ekler hızlı ve verimli hata düzeltme olarak bilinen bir süreç içinde iki yönde yönlendirilmesi kurmak için fırsat sunmak amacıyla istikrarsızlaştırdı edilir. Daha önce, memeli hücrelerinde kurulmuş bir hata düzeltme deney 5 (kinesin-5) Eg5 karşı döner küçük molekül inhibitörleri kullanılarak tek kutuplu iğ monte gerektirir. Ilaç tedavisi hatalı syntelic ekleri çok sayıda üretir both kardeş kinetokorlar aynı iğ kutbuna bağlayın. Uygulanacak ilacın daha sonraki yıkama hata düzeltme işleminin olarak gösterebilir. Hata düzeltme tahlil hatalı kt-MT ekleri düzelterek aday proteinlerin katkısını incelemek için küçük molekül inhibitörleri veya knockdowns varlığında yapılabilir.

Canlı hücreler hata düzeltme görselleştirmek için yeteneği daha bu karmaşık süreçte yer alan moleküler mekanizmayı anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, çoğu hücre hatlarında bulunan kromozomların çok sayıda bireysel kt-MT ekleri gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Onlar kadar az 4 olarak kromozom 6, fakat küçük molekül inhibitörleri içerdiğinden Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme deneyi uygulamak için ideal olacaktır S-tritil-L-sistein (STLC) halinde kinesin 5 ve 7-9 monastrol Drosophila hücrelerinde mili grubunu ya da kinesin-5 motor fonksiyonu etkilemez. Bu nedenle, cinslerted kinesin-5 inhibitörlerine duyarlıdır bir uyarılabilir promoterin altında insan kinesin-5 eksprese eden bir Drosophila S2 hücre çizgisi. Bu protokol, endojen Drosophila kinesin-5 homologunda, Klp61F demonte ve hücre tabanlı hata düzeltme deneyde bu hücre hattını kullanmayı açıklamaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. transfekte S2 hücreleri

  1. Önceden kültürlenmiş 25 cm2 şişeye kaynaktan, onları% 100 konfluansa 2 ml'lik bir nihai hacme GFP-α-tübülin-ifade eden S2 hücreleri 10 ekleyin ve izin 35 mm doku kültürü çanağı içinde alt için yarı bağlı Yaklaşık 1 saat.
  2. Çanak ortamı çıkarın. Eg5-mCherry Transfect 2 ug,% 10 FBS ile takviye edilmiş Schneider ortamı 11 1 ml yapı üreticinin protokolü takip edilerek, (Schneider ortamı diye değinilmektedir) ve Transfeksiyon ReaktifMaddesi. Parafilm ile çanak Seal ve 16-18 saat boyunca 25 ° C'de inkübe hücreleri.
  3. Schneider medya 1 ml ekleyin. 25 ° C inkübatör hücreleri dönün.
  4. 3. gün post-transfeksiyon üzerine bir test indüksiyonu için Schneider ortamı 1,5 ml içeren, yeni bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde transfekte edilmiş hücrelerin 500 ul transfer. CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ekspresyonunu indüklemek 500 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek. Parafilm çanak mühür ve 25 ° CO / N inkübe.
  5. Konkanavalin A ile kaplı lamelleri, kaplamak için bir çözeltisi (0.5 mg / mL kadar H2O içinde çözülmüş) Concanavalin pipet yeterli hacmi oluşturmak için bir asit yıkandı lamel aşırı kaldırmak ve hava ile kurumaya lamel sağlar.
  6. Daha sonra lamel üzerine uyarılan hücrelerin% 100 konfluansa 500 ul, tohum temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde 22 mm x 22 mm konkanavalin A ile kaplı lamel yerleştirin ve hücreler oda sıcaklığında 1 saat yapışmaya izin verir.
  7. , Eg5 mCherry ifade edin bir floresan mikroskop oda sıcaklığında görüntüleme medya ile bir gül haznesine lamel (ya da uygun görüntüleme gemi) bir araya getirmek için. Hücreleri görselleştirmek için uygun ışık kaynakları ve filtre setleri kullanın. Örneğin, bu çalışmada kullanılan mikroskop bir LED beyaz ışık kaynağı ve EGFP (FITC / Cy2) ve DsRed (TRITC / Cy3) filtre küpler vardır. Eg5-MCherry mikrotübüllere lokalize ve nea zenginleştirilmiştirr mili direkleri.
  8. Olduktan sonra hücreler, Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade edilen, Schneider ortamı 4 ml ihtiva eden bir 25 cm'lik 2 doku kültürü şişesine transfekte indüklenmemiş hücrelerin geri kalanı aktarın.
  9. Transfekte edilmiş hücrelerin şişeye 25 ug / ml'lik bir son konsantrasyonda Blastisidin S HCL eklenir ve hücre ölümü periyodik Eg5-mCherry ekspresyonu kontrol etmek için emin olarak sona erene kadar 25 ug / ml Blasticidin S, HCI varlığında, bölme devam etmektedir. 25 ° C inkübatör hücre hatları inkübe edin.
    NOT: Zamanla Eg5 mCherry artışları ifade hücrelerin yüzdesi.
  10. Hücreler stabil olarak transfekte edildikten sonra, ilacın yokluğunda bölünmüş ve gelecekte kullanılmak üzere 12 hücreleri dondurma devam etmektedir.

2. RNA Girişim

  1. PCR olduğu (Malzeme Listesi verilen sekans) ilave T7 promotör sekansı ile primer kullanılarak cDNA'nın (LD15641) için Klp61F bir ~ 500 bp'lik bir bölge amplifiyedsRNA sentezi için bir şablon olarak kullanıldı.
    1. Şablon DNA 100 ng, her bir primer, uygun bir tampon ve polimeraz 25 uM içeren dört PCR reaksiyonları, 50 ul, her biri ayarlayın. Polimerazın üreticinin protokolüne göre PCR PCR protokolünü ayarlayın.
    2. Havuz ve PCR üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak temiz dört PCR reaksiyonları. -20 ° C de, temiz bir şablon saklayın.
  2. Bir T7 RNA transkripsiyon kiti kullanılarak üreticinin talimatlarına şablon çift sarmallı RNA (dsRNA) hazırlayın. DsRNA'nın ~ 5-15 mg / ml konsantrasyon bekliyoruz. -20 ° C'de dsRNA saklayın.
  3. DsRNA ile Klp61F demonte etmek için,% 25 birbirine karıştığında Eg5-mCherry ifade eden S2 hücreleri 1 saat boyunca 35 mm doku kültürü çanağı alt yarı uygun sağlar.
  4. Yemekler ortamı çıkarın ve Klp61F karşı dsRNA'nın 5 ug ekleyin (Drosophila kinesin-5) serum serbest Schneider 1 ml seyreltilmiş 's medya.
  5. Daha sonra% 10 FBS ile Schneider ortamı 1 ml ilave 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 25 ° C'de inkübe hücreleri.
  6. 24 saat dsRNA tedaviden sonra 500 uM nihai konsantrasyona kadar CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ifadesini teşvik eder. Başka bir 24 saat daha 25 ° C'de inkübe hücreleri.

3. Canlı Hücre Görüntüleme

  1. Temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde bir kaplanmış lamel konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin.
  2. Tohum dsRNA ile muamele edilmiş ve uyarılan O / N konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine ve bunları, yaklaşık 1 saat yapışmaya izin olan hücrelerin 500 ul.
  3. Görüntüleme için bir gül odasına lamel (veya uygun damarı) birleştirin.
  4. Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade mitotik hücrelerin bulun.
    NOT: mili iki kutupluluğun için gerekli olan Klp61F beri monopolar iğ olmalıdır sadece GFP-α-tubulin ifade Mitotik hücreleri, 10,13 düşürülürse.
  5. Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem ifade eden hücrelerde bipolar miller (dakika başına, örneğin, 1 kare) zaman atlamalı görüntüleri toplayın.
  6. Görüntüleme sırasında, gül odasından ortamı çıkarın ve Schneider medya mili çöküşü görselleştirmek için odasına 3 ardışık medya alışverişi (~ 5 ml toplam) üzerinde 1 mcM STLC içeren değiştirin.
  7. Dikkatlice gül odasından STLC içeren ortamı çıkartın ve taze medya ile gül bölmesini son bir kez yeniden doldurmadan önce Schneider medya 4x (6-8 ml toplam) yıkayın, ilaç yıkanmaya ve mil çöküşü tersine çevirmek için. Görüntüleme devam edin.

4. Hata Düzeltme Testi

  1. Temiz 35 mm doku kültürü kaplarına bir kaplanmış lamelleri konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin.
  2. Tohum konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine Klp61F dsRNA ile işlemden geçirildi ve bunları uygun izin olan hücrelerin 500 ul.
  3. Sonra hücreler adher olaned, 2 ml kadar son hacim getirmek için her yemeğin Schneider medya 1,5 ml ekleyin.
  4. Mitoz hücreleri yakalama tabağın her birine 10 uM'lik bir son konsantrasyona değin MG132 ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın için.
  5. 1 uM STLC ekleyin ve tek kutup oluşturulması için izin vermek için 1 saat süre ile inkübe edilir.
  6. Lamelleri taze Schneider medya 2 ml her seferinde 3x durulama STLC yıkayın.
  7. Bir kontrol olarak herhangi bir farmakolojik ajanlar (örneğin Aurora kinaz inhibitörleri) veya DMSO ilave olarak Schneider ortamı ile lamelleri inkübe edin.
    Not: İnhibitör konsantrasyonları, değişebilir ve uygun son konsantrasyonları deneyi ile tespit edilmelidir. Ortama: 1,000 stok çözeltileri, tipik olarak inhibitör 1 seyreltilmiştir şekilde yapılır. Bu durumda, bir 1: DMSO (veya uygun bir çözücü) içinde 1000 seyreltme araç kontrolü olarak görev yapar. Bu 40 uM'lik bir son konsantrasyonda Aurora B inhibitörü Binucleine 2 kullanır.
  8. Farklı zaman noktaları t hücreleri saptamako Bipolar iğ oluşumunun ilerlemesini gözlemek ve kinetochore eki durumlarını değerlendirmek için. Düzeltmek:
    1. Çabuk 1x BRB-80 2 ml lamelleri yıkayın.
    2. 10 dakika boyunca 1 x BRB-80 içinde seyreltilmiş,% 10 paraformaldehit 2 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Bir kimyasal kaputu dikkatle Pipet paraformaldehit.
    3. 8 dakika boyunca 1 x PBS +% 1 Triton-X 2 ml hücreleri geçirgenliği.
    4. Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 2 ml ile 3 kez kayar.
    5. Aktarım hücre tarafı 150 mm Petri kabındaki (Parafilm etiketlemek için bir işaretleyici kullanmak uygun slaytlar izlemek için) Parafilm bir levha üzerine yukarı bakacak şekilde lamelleri.
    6. 150 ul kaynatıldı eşek serumu (BDS) ile lamelleri kaplayın ve spesifik olmayan bağlanma antikorun bloke etmek 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
      Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C'de bir nem odasında saklanır. Nem odasına yapmak için, 150 mm çanak kenarını hattııslak laboratuvar ile siliniz ve Petri kabı kapağı ile kaplayın.
    7. Sırasıyla ug / ml, 1 (üreticinin tavsiyelerine göre ya da) bloğunu ve birincil antikor 150 ul 2 ug / ml nihai konsantrasyonları kinetokorlar ile mikro için leke BDS uygun şekilde seyreltilmiş olan, oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri inkübe .
      Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C'de bir nem odasında saklanır.
    8. Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri.
    9. BDS içinde seyreltilmiş uygun bir florofor konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca lamelleri inkübe edin.
    10. Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri.
    11. 5 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI nihai konsantrasyon içeren BDS 150 ul lamelleri inkübe edin.
    12. Lameller 2x 1x PBS +% 0.1 Triton-X yıkayın ve c monteoverslips aşağı medyayı montaj 8 ul bir 3x1 "slayt hücre tarafı. Slaytlarınıza lamelleri hareketsiz için oje ile köşeleri boyayın.
  9. Eg5-mCherry ifade bipolar iğ Görüntü hücreleri. Bir 100X objektif kullanan tüm kanallarda 0,2 mikron aralıklarla 30 uçaklarının oluşan Z serisi atın. Dikkatle eki (iki-yönlenmeli veya syntelic ekleri) durumlarını belirlemek için kinetokorlar ve mikrotübülleri analiz.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klp61F bipolar iğ oluşturmak için gereklidir. İnsan kinesin-5, Eg5, Drosophila S2 hücrelerinde (Şekil 1 A ve D) Klp61F işlevini kurtarmak. Kinesin-5 inhibitörünün (STLC) eklenmesi üzerine, başarılı bir RNAi üzerine endogen Klp61F olmayan hücrelere bir monopol (Şekil 1C ve F) 'de elde edilen, motor damla (Şekil 1B ve E) ve iğ kaymalarının mikrotübüle bağlı seviyeleri (Ek film 1). Bu kinesin-5 etkisi insana ait hücrelerde mili çift kutuplu korumak için gerekli değildir, çünkü, bipolar iğ insanlaştırılmış S2 hücrelerinde STLC ilave edilmesi üzerine çökmeye olması dikkat çekicidir. Bu ilginç bir farklılık, iki model sistemlerinde 14 interpolar mikrotübül üst üste ve / veya stabilite farklılıkların bir sonucu olabilir. Kinesin-5 inhibisyonu (Şekil 2A ve E) Reve edilebilir iki kutuplu bir milin ilaç ve geri kazanım yıkanarak rsed zaman içerisinde takip edilebilir. Inhibitörünün (Şekil 2B ve F) çıkarılması üzerine, Eg5-MCherry iki kutuplu bir mili kurullarının (Şekil 2C ve G) olarak mikrotubul-ortakları tekrar ve hücreler, iki kutuplu anafaz (Şekil 2D ve H, Ek film 2 içine ilerleyebilir ).

figure-results-1
1. Toplama 1 mcM STLC Şekil Drosophila S2 hücrelerinde monopolar miller yol açar. Temsili görüntüleri Eg5-mCherry (AC) ve GFP-α-tubulin (DF) ifade eden bir Drosophila S2 hücresi time-lapse görüntüleme 1 mcM eklenmesi sırasında STLC. Eg5 önleyicisi 3 dakika ilave edildi. Ölçek çubuğu = 5 um. Zaman Damgası = dk: sn. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2. STLC uzaklaştırılması üzerine bir bipolar mili reformları. Bir STLC yıkama deney sırasında Eg5-mCherry (AD) ve GFP-α-tubulin (EH) ifade eden bir Drosophila 2 hücre time-lapse görüntüleme Temsilcisi görüntüler. STLC 5 dakikada yıkandı. STLC kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Ölçek çubuğu = 5 um. Timestamp: dk:. Sn bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Ek Film 1. (sağ indirmek için tıklayın). Widefield floresan görüntüleme Eg5-mCherry ifade eden Drosophila S2 hücresinin bir temsilcisi örnek ( sol) ve GFP-α-tubulin (sağ) 1 uM STLC 2 dakikada ilave edildi ve mili formları inhibitörün ilave edildikten sonra 10 dakika içinde, bir tek kutuplu. Görüntüler her 1 dakika satın almış ve 10 kare bir oranda oynamıştır. saniyede. Ölçek çubuğu = 5 mikron.

figure-results-4
Ek Film 2. (Sağ indirmek için tıklayın). Eg5-mCherry (solda) ve GFP-α-tubulin (sağda) ifade eden bir Drosophila S2 hücre temsili örnek Widefield floresan görüntüleme. 1 uM STLC ihtiva Ortam çıkarıldı ve5 dk çalkalandı. Inhibitörü kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Görüntüler her 1 dk edinilen ve saniyede 10 kare hızında çalındı. Ölçek çubuğu = 5 um.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hata düzeltme görselleştirme bu önemli ve kompleks hücresel süreçte yer alan adımları incelemek için değerli bir tekniktir. Bunu yapmak için, hatalı ek parça döner inhibitörleri kullanılarak oluşturulur ve hata düzeltme ilacın yıkanması sırasında gözlenir. Bu deney, ilk olarak, memeli doku kültürü hücreleri 5 kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak birçok model, memeli hücre tiplerinde kinetokorlar çok sayıda varlığı, bireysel hata düzeltme olayları gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme gözlemlemek için onlara daha fazla tercih hücre hattı yapım kinetokorlar olarak az 4 olarak çift sahiptirler. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, birçok inhibitörleri, Drosophila S2 hücrelerinde etkili olmasıdır. Bu nedenle, insan kinesin-5 eksprese eden bir insanlaştırılmış Drosophila S2 hücre çizgisi oluşturma yeteneği hata düzeltme incelemek için değerli bir araç sağlar.

Drosophila S2 hücreleri olabilir, ancak, birhata düzeltme incelemek için daha iyi hücre hattı, hücre hattını elde etmek ve gerekli genleri aşağı vurma katılan çok sayıda adım bu tekniğin bazı zorluklar yaratıyor. Örneğin, transfeksiyon verimi oldukça düşük olabilir. Hücrelerin% 20'den az Eg5-mCherry ifade ediyorsanız seçim süreci uzun sürer olarak, transfeksiyon tekrarlanmalıdır. Ayrıca, her iki floresan proteinleri eksprese eden hücrelerin yüzdesi zamanla azalabilir. Bu, sırasıyla, Eg5-mCherry eksprese eden hücreler ve GFP-α-tubulin seçilmesi için Blastisidin S HCI ve Higromisin B varlığında hücrelerin bölünmesi ile aşılabilir. Bu Drosophila S2 hücrelerinin birçok insan proteinleri ve ortologlara sahip olduğunu not etmek de önemlidir; bu nedenle, endojen proteinler için demonte koşulları optimize etmek için kritiktir. Optimal demonte koşulları dsRNA'nın miktarı ve tedavinin uzunluğu değişebilir. Ortaya çıkışı ve hızla iyileşme dikkate alındığında CRISPR-Cas9 TECHNOLOGI15-17 es, insan Eg5 yerini Klp61F geni ile bir Drosophila hücre hattı nesil transfeksiyonu ve demonte yaklaşımın sınırlamaları aşmak olacağını güçlü bir alternatif sunuyor. Çalışmalarımız gerekli reaktifler halen geliştirilmekte olan Drosophila S2 hücrelerinde bunu her ne kadar sinek-insana gen değişimi bu durumda geçerli bir seçenek olması gerektiğini göstermektedir.

Bu prosedür, Eg5 ile sınırlı değildir, ancak ilgi duyulan diğer proteinlerin fonksiyonu çalışma uygulanabilir. Daha önce Drosophila S2 hücrelerinde etkisiz olduğu kurulmuştur inhibitörleri kullanıyorsanız, bu protokol dışı hedef etkileri hakkında endişeler olmadan canlı hücrelerde inhibitörlerinin direkt etkisini araştırmak için modifiye edilebilir. Bu protokol kullanılarak üretilen hücre çizgisi, aynı zamanda, yüksek verimli tarama kullanılabilecek hata düzeltme katılan proteinleri hedef potansiyel ilaçlar tespit etmek analiz eder.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kinesin-5 yapının hediye için Patricia Wadsworth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Charles H. Hood Vakfı, ınc TJM ve Araştırma Bursu sayılı TJM için Dimes Vakfı Mart ayından itibaren 5 FY13-205 yanı sıra desteğiyle bir NIH hibe (5 R01 GM107026) tarafından desteklenmiştir Boston, MA. TJM için

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Effectine Transfeksiyon ReaktifiQiagen301425
Klp61F cDNADrosophila Genomik Kaynak Merkezi13690Gen Adı LD15641
Schneider ' s MediaInvitrogen21720-024
Fetal Sığır Serumu, sertifikalıInvitrogen10082-147Isı ile Etkisizleştirilmiş, ABD menşeili
Bakır(II) Sülfat (CuSO4)SigmaC8027-500G500  mM stok
S-tritil-L-sisteinSigma164739-5G1   DMSO
Blasticidin HClInvitrogenR21001'de5  1x PBS
Higromisin Bİnvitrojen10687010
Büyük ölçekli RNA Üretim SistemiPromegaP1320Her reaksiyondan yaklaşık dsRNA konsantrasyonu yaklaşık 5-15 & nbsp'dir; &mikro; g/&mikro; l
Klp61F RNAi F primerInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R primerInvitrogenTAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR temizleme kitiMo Bio Laboratories, Inc1250
Concanavalin ASigmaC52750.5  1x PBS'de çözülerek yapılan mg / ml çözeltisi.
Haşlanmış Eşek SerumuJackson ImmunoResearch Labs017-000-1211x PHEM tamponunda% 5 stok çözeltisi, çözeltiyi kaynatın. 4 'de saklanır; °C.
Montaj Ortamı20  mM Tris pH 8.0,  % 0.5 < > N < / em>-propil gallat,% 90 Gliserol. 4 'de saklanır; °C.
1x BRB-8080 mM BORULAR pH 6.9; 1  mM EGTA; 1 mM MgCl2
Beyaz Işık KaynağıLumencor Inc
ET EGFP Filtre KüpüChroma49002
DSRed Filtre KüpüChroma49005
anti-NDC80 antikoru Maresca Lab
DM1 & alpha tarafından özel olarak üretilmiştir; (anti-&alfa; -tübülin)SigmaT6199
anti-CID antikoruAbCamab10887
mM stoğu T7'de mg / ml stoğu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheeseman, I. M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).
  2. Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
  4. Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
  5. Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
  6. Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
  7. Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
  8. Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
  9. Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2(2006).
  10. Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
  11. Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187(2013).
  12. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
  13. Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
  14. Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
  15. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  16. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  17. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila S2 H creleriKinezin 5 nhibisyonuHata D zeltme AnaliziHumanize Edilmi H cre HattKLP61F KnockdownEg5 mCherry EkspresyonuSTLC la UygulamasCanl H cre G r nt lemeFloresan Mikroskobuplik ikleri kmesi

İlgili makaleler