Yöntem makalesi

Fare Lenfoma Modellerinde İzleme Tümör ilerleme ve Tedavi Etkileri Biyoparlaklık Tabanlı Tümör Niceleme Yöntemi

22.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53609

⸱

7 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genethon, 2Cordeliers Research Center, INSERM U872, 3Matter and Complex Systems Laboratory, Université Paris Diderot, 4INSERM U951, 5UMR_S951, Université d'Evry Val d'Essonne

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Biyoparlaklık görüntüleme tümörleri ve metastazları lokalize için iyi bilinen bir araçtır, ama bu görüntülerin miktar genellikle karmaşık hesaplamaları ve özellikle araçların gerektirir. Biz hiçbir hesaplamalar gerektiren ve tümör yükü ve tedavi yanıtı fare modellerinde izlenecek sağlayan hassas satın alma koşullarına göre, kolay kullanımlı luminoscore yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Biyolüminesans görüntüleme (BLI), kanserin hayvan modellerinde tümör yükünün izlenmesi için umut vaat etse de, bu analizler çoğunlukla kalitatif kalmaktadır. Burada, tümör yükünün ve tedavi yanıtının yarı kantitatif bir analizini elde etmek için biyolüminesans görüntüleme için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, aynı veya farklı deneylerden iki hayvanın karşılaştırılmasına izin veren bir değer olan luminoscore'un hesaplanmasına dayanmaktadır. Mevcut BLI cihazları, esas olarak edinme koşullarına (arka ve ön alımlar) ve ilgilenilen bölgenin çizimine (farenin etrafındaki manuel işaretleme) dayanan bu luminoscore'un hesaplanmasını sağlar. Hücre aşılamasına dayalı daha önce tanımlanmış iki fare lenfoma modelini kullanarak, luminoscore yönteminin başarılı tümör hücresi aşılamasını doğrulamak, tümör yükünü izlemek ve in situ kanser tedavisinin (CpG-DNA) etkilerini değerlendirmek için invaziv olmayan bir yol olarak hizmet edebileceğini gösteriyoruz. Son olarak, bu yöntemin farklı deneysel tasarımlara uygun olduğunu gösteriyoruz. Bu yöntemin, klinik öncesi küçük hayvan çalışmalarında tedavi yanıtının erken tahminleri için kullanılmasını önermekteyiz.

Giriş

Erken tümör hücre tespiti bir sorun olmaya devam etmektedir ve kanser tedavisi etkinliğini arttırmak için çok önemlidir. In vivo biyoparlaklık görüntüleme (BLI) yaygın küçük hayvanlarda tümörleri izlemek için kullanılan çok hassas, non-invaziv optik bir tekniktir. Ateşböceği lusiferaz sentezleyen hücreler, genel olarak, bu gibi deneylerin 1,2 kullanılmaktadır. Bu oksijenaz D-luciferase moleküler oksijen ile okside olur ancak iki kofaktör gerektirir - Mg 2+ ve adenozin trifosfat 3. Ateş böceği lusiferaz Renilla lusiferaz 4 onun kuantum verimi yüksek olduğu için daha in vivo görüntüleme için daha uygundur.

okside tabaka - oksilusiferin - kendiliğinden onun temel duruma geri dönmek için bir foton yayar ve sonra inaktif hale gelir. fotonların 530 nm civarında maksimum bir dalga boyuna sahiptir. Yüksek hassasiyetli kamera, küçük bir hayvanın içinden Işıklı fotonlar algılar ve poss hale görüntüleri sağlayabilirtümör hücrelerini bulmak için ible.

foton sayıları ile doğru tümör yükünü ölçmek yeteneği tedavi etkinliğini ölçülmesi için güçlü ve hassas bir araç olarak hizmet verebilir. tedavi etkileri erken tespit edilebilir, çünkü bu duyarlılık sayesinde tedavi etkili hale geldiği anı tam olarak belirleyecek yapmak olabilir.

Toplam fotonların mutlak ölçümü çok karmaşıktır. toplanan fotonların sayısı, tümörün derinliği ve fotonlar yoluyla yayılan organlar bağlıdır. Doku emme katsayılarına dayalı düzeltme katsayıları 5 hesaplanabilir, ancak tümör hücre sayıları mutlak miktar, her tümör hücresi tarafından yayılan foton sayısı bilerek gerektirir. Ayrıca, birçok muhabir gen (örn., Flüoresan protein) gibi lusiferaz ekspresyonu, hatta tek bir klon 6 türetilen bir hücre popülasyonunda, homojen değildir. lucifer sayısıhücrelerde ase proteinleri tam hesaplanamaz. standart deney koşullarında kurulması ve böylece güvenilir bir yarı-nicel analiz için çok önemli görünmektedir.

Biz iki farklı fare lenfoma modellerinde 7,8,9 için luminoscore yöntemi uygulanır. Bu modellerde, singeneik tümör hücreleri gözün içine veya sırasıyla, birincil intraoküler (Piol) modeli ve deri altı lenfoma (SCL) modeli elde etmek için deri altına enjekte edilir. Bu ortotopik modeller her birinde, tedavi yedi gün PIOL tümör aşılanmasından sonra, in situ olarak uygulanır ve tümör SCL için büyük çapı 0.5 ila 0.7 cm eriştiğinde.

Biz yerinde CpG tedavide etkilerini izlemek için luminoscore yöntemi kullanılır, daha önce 7,10,11 etkili olduğu gösterilmiştir. CpG da birçok CE tarafından ifade edilen bir hücre içi reseptör olan bir oligonükleotid sekansı ve TLR9, bir liganddırdendritik hücreler, B lenfositler, monositler ve doğal öldürücü hücreleri dahil olmak üzere bağışıklık sistemi LLS. CpG DNA, CpG (CG) immünostimülatör motifi ihtiva eden bir 20-mer DNA dizisidir; Kontrol (ODN-kontrol) immünostimülatör CG dizisi (GC) ters çevrilmesi haricinde, aynı 20-mer DNA dizisidir. Biz okuyan kemirgen lenfomada TLR9 nişan, apoptoz 10 indükler bağışıklık sistemini 12 harekete geçirir ve böylece önemli ölçüde tümör yükünü 7,11 azaltır.

Burada tümör yükünü ve bioluminescent görüntüleri aracılığıyla tedavi yanıtını ölçülmesi için bir standart yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem güvenilirliği, tekrarlanabilirliği olmayan kullanıcı bağımlılığı ve istatistiksel anlamlılık optimize etmek, alımından analiz, görüntüleme işlemi farklı yönleri dayanmaktadır. Bir biyolüminesans ölçümü indeksi her fare atfedilir; Biz luminoscore dediğimiz bu değer, sadece hayvanlar değil al arasında mukayese edilebilirdeneyler arasında böylece.

Bu çalışmada, biyolüminesans görüntüleme prosedürü yanı sıra luminoscore yöntemi ile görüntü ölçümü odaklanmak. Biz, enjeksiyon doğrulama tümör yükü, izleme ve in situ kanser tedavisinde etkinliğini değerlendirmek için bu yöntemin etkisini göstermektedir. Bu gelişmelerin her biri luminoscore yönteminin uyum vurgulamak için farklı fare modelleri kullanılarak yapılan deneylerden elde Örnek sonuçlarında gösterilmiştir.

Protokol

fareler içeren tüm işlemler Avrupa Birliği yönergelerine, hayvan deney için Fransız yönetmeliklerine (Tarım Bakanlığı sayılı Kanunun 2001-464, Mayıs 2001), ve Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale (INSERM) Komite yönergelere uyulması hayvan Araştırmaları ve ilgili yerel komite tarafından onaylandı (Charles Darwin Etik Kurulu hayvan Deneyleri, Paris, Fransa için; İzin Numarası: p3 / 2009/004).

1. Hücre Hazırlanması

  1. Fare B büyümek% 10 fetal dana serumu, 100 ug / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM sodyum piruvat, 50 uM 2-merkaptoetanol ve 0.50 ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde Glutamax lenfoma hücre hattı A20.IIA-luc2 mg / ml higromisin B
  2. 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde hücre kültürünün muhafaza etmek ve ortam her iki üç günde bir değiştirin. Hasat orta değiştirdikten sonra bir pipet, bir gün hücre süspansiyonu 5 mi.
  3. 300 spin hücreleri5; 10 dakika boyunca G ve 3 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri askıya. Hücreleri yıkamak için iki kez bu adımı yineleyin.
  4. Bir Malassez sayma odasını yüklemeden önce 30 ul Tripan Mavisi etiketleme ile hücre süspansiyonu 15 ul karıştırın. formülü ile hücre konsantrasyonunu hesaplayın: Konsantrasyon (hücre / ml) = sayma ızgara * 3 * 1000 hücrelerinin sayısı.
  5. 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreler bir kez daha dönerler. Bir pipet ile süpernatantı. C adımında 1.4 hesaplanan konsantrasyon) ile, hücre sayısı N = C * 3'dür.
  6. Aşağıdaki formüle sahip 5 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda, hücre süspansiyonu, elde etmek için gerekli, steril PBS 1X hacmini hesaplayın: PBS hacmi (mi) = N / (5 x 10 7). Bir önceki cümlede hesaplanan steril PBS 1x hacminde) (1.5 adım) hücre pelet askıya. 5 x 10 6 hücre: hücre süspansiyonu, in vivo olarak enjekte hacimde (SCL modeli kullanılmak üzere 100 uls).
  7. Pipet 10 hücre süspansiyonu A ul, ml başına 5 x 10 6 hücre hücre süspansiyonu B 100 ul elde etmek üzere 1.5 ml bir tüp içinde steril PBS 90 ul ekle. Hücre süspansiyonu oda Piol modelinde kullanılmak üzere (1 x 10 4 Hücreler, canlı içinde enjeksiyon hacmi 2 ul).

2. Luciferase

  1. 50 ml bir tüp içinde steril PBS 1X 30 ml D-luciferase potasyum tuzu tozu, 1 g seyreltilir ve agregatlar eritmek için bir kaç saniye için sallayın.
    NOT: luciferase ışığa duyarlı olduğundan, karanlık 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler 500 ul alikotları hazırlamak.
  2. -20 ° C'de alikot saklayın.
    NOT: alikotları birkaç ay boyunca saklanabilir.
    Çözündükten sonra, tam bölünen miktarları ile + 4 ° C 'de en fazla 1 gün için saklanmamalıdır. Donma-çözülme döngüleri 4 ° C'de depolanması tercih edilir.
  3. intraperitonal Her bir görüntüleme Assa D-luciferase potasyum tuzu çözeltisi 100 ul enjekteY.
    NOT: Bu çözelti, 150 mg / kg'lık bir dozu için, fare başına 3.3 mg karşılık gelir.

3. Anestezik Karışımı ve Anesthetization

  1. Steril PBS 1X ketamin 120 mg / kg ve ksilazin 6 mg / kg karıştırılmasıyla anestetik bir çözelti hazırlayın.
  2. intraperitonal 25 G iğne ile her bir görüntüleme deneyi için anestezik karışım 60 ul enjekte edilir. (PIOL veya SCL modeli ile) ameliyat için, daha derin bir anestezi elde etmek için karışımın 80 ul enjekte edilir. kendi kafesine geri fare koyun.
  3. Fare hareketsiz göründüğünde, kafes çıkarın ve yavaşça parmaklar arasında farenin ayağını sıkmak. Fare bir kaçış refleksi ile reaksiyona varsa, birkaç dakika bekleyin. tatmin edici anesthetization teyit Fare tepki vermezse kadar eylem tekrarlayın.
  4. Isınma bir plaka veya bir ısınma ışık altında fare yerleştirin.
  5. görüntüleme deneyi için veya SCL cerrahisi anesthetization sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün. uygulamakPiol modeli için ameliyat sonrası göz merhemi.

4. Cerrahi ve Hücre aşılamadan

NOT: Bir hayvan biyogüvenlik düzeyi 2 tesis tip 1 mikrobiyolojik güvenlik kabini içinde, bir ısınma plaka üzerinde ya da ısınma ışık altında tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirin. Bu bölümde kullanılan Tüm cerrahi aletleri kullanımdan önce otoklavlanmışlardır.

  1. Subkutan Lenfoma Modeli:
    1. 25 G iğne ile 1 ml şırınga içinde aşama 1.6 'de elde edilen hücre süspansiyonu, 100 ul hazırlayın. Yavaşça enjeksiyon yerinde, parmaklar arasında kanadında fare cilt sıkın. tam deri içine kat iğne takın. deri altı enjeksiyon sağlamak için, derin doku içine iğne koymayın.
      1. deri kıvrımı içine hücreleri enjekte edilir. Biraz sıvı top enjeksiyonu doğru olarak yapıldığını teyit etmek için cilt altında görünüp görünmediğini gözlemleyin.
  2. Piol modeli:
    NOT: Bu Procedure operatörü 1 ve operatör 2 olarak anılmaktadır 2 operatörleri gerektirir.
    1. konjonktiva Kaldırma:
      1. Operatör 1 yerde bir mikroskop altında fare var. yavaşça gözün her tarafında parmakları Basın temizlemek için. Bu konumunu korumak.
      2. Mikroskop aracılığıyla Operatör 2 lt ook var. Kavrama bir yandan pense küçük bir çift ile konjonktiva; Öte yandan ile, cerrahi makas küçük bir çifti ile sadece pense altında konjonktiva kesti.
      3. Var Operatör 1 serbest bırakma aşamasında 4.2.1.1 basıldığında fare göz)
    2. Hücre enjeksiyonu:
      1. 10 ul künt hassas şırınga hazırlayın. içinden steril deiyonize su pompalama tarafından yıkayın. şırınga hiçbir baloncuklar olmadığından emin olmak için iki ya da üç kez tekrarlayın. Daha sonra, enjeksiyon için hücre süspansiyonu 2 ul hazırlar.
      2. Üzerinde parmakları ile hafifçe Operatör 2 basın varGözün her tarafında e elini temizlemek için. Bu konumunu korumak.
      3. Operatör 1 Tutma yeri bir yandan pense küçük bir çift gözün kenar ve doku germek için yavaşça geriye doğru çekin.
      4. Mikroskop aracılığıyla Operatör 2 lt ook var. Diğer elinizle, 32 G iğne ile fare alt küresi küçük bir delik yapmak.
      5. Operatör 2 iğne indirdi ve (aynı elle) hassas şırınga pick up ve adım 4.2.2.4 yapılan deliğe iğne takın.
      6. Öte yandan ile şırınga pistonu Operatör 1 itme var.
      7. Şırınga hücre süspansiyonu doğru göz küresi içindeki enjekte edilmiş mikroskop ile Operatör 2 v erify var (sıvı akışı kolaylıkla gözlemlenebilir).
      8. Operatör 2 r aldır hassas şırınga var.
      9. Operatör 1 R kenarına Elease varproksimal göz) aşama 4.2.2.3 kavranır
      10. Operatör 2 r Elease sahip adım 4.2.2.2 basıldığında göz kenarları)
      11. hemen göz merhemi sürün.
        NOT: Tüm adımlar doğru yapıldı ise, fare bu işlem sırasında hiç kanama olmamalıdır.

5. Biyoparlaklık Görüntüleme - Gün 0

NOT: fareye enjekte Tüm ürünler, enjeksiyondan önce oda sıcaklığında olmalıdır. Tümörün sonra hücreler aşılanmış olan ve hayvan hala anestezi ise, görüntüleme için aşağıdaki adımlara devam edin.

  1. kamera açın ve satın alma yazılımını açın. "Initialize" butonuna tıklayarak kamera, aşamaları ve lensleri başlatılamıyor. Başlatma tam olduğu 10 ila 15 dakika sürer.
  2. 25 G iğne ile intraperitonal olarak, D-luciferase potasyum tuzu çözeltisi 100 ul enjekte edilir. intravenöz onu yönetmek etmeyin. intravenou Eğers idaresi herhangi bir nedenle gerekli olan, D-luciferase sodyum tuzu, D-luciferase potasyum tuzu yerine kullanılmalıdır.
    NOT: Luciferase bu konsantrasyonda aşırı reaktandır; Bu nedenle, biyolüminesans sinyali 3 dakika 7'ye sonra bir plato ulaşır ve 30 dakika boyunca devam eder.
  3. 10 dakika D-luciferase enjeksiyon 13 sonra, kamera konu fare yerleştirin. Doğal konumu, mümkün olduğunca düz bir konumda kameraya doğru sırtında, fare yerleştirin. Bu pozisyon, doğal ve kolay tekrarlanabilir.
  4. Otomatik pozlama özelliğini Kene ve otomatik pozlama özelliği ile, hayvanın arka (posterior) görüntü elde etmek Edinme tıklayın.
    NOT: Otomatik pozlama özelliği 1 sn pozlama görüntü hesaplanarak pozlama süresini optimize eder. Farenin biyolüminesans sinyali negatif veya çok düşükse, uygun pozlama süresi olabilirotomatik fazla 20 dakika olarak ayarlanır. Bu durumda, 8 ila 10 dakika arasında bir tutma süresi iyi bir uzlaşma olabilir. Pozlama süresi manuel olarak ayarlanmış olabilir, ancak görüntülerin doymuş piksel içermemelidir.
  5. Kameraya fare ön ortaya çıkarmak için fareyi ters çevirin. onlar göğüs bloke kalmamak için fareyi düzleştirmek ve ön uzuvların yaymak için çalışın.
  6. Hayvan ön görüntü kazanır. Otomatik pozlama onay kutusu hala işaretli olduğundan emin olun ve "Edinme" butonuna tekrar tıklayın.
    NOT: Ön görüntü arka görüntü önce iktisap ve tersi olabilir. ön ve arka görüntü maruz kalma süresi, fare her bir tarafında göreli yoğunluğuna bağlı olarak farklı olabilir. otomatik pozlama özelliği kullanılırken otomatik olarak hesaplanır. Niceleme sadece foton akı (saniyede fotonlar) kullanır ve maruziyet süresine bağlı değildir.
  7. Bir ısınma plat üzerinde fare yerleştirine veya anestezi kurtarır ve daha sonra kendi kafesine geri koyun kadar ısınma ışık altında.

6. Biyoparlaklık Görüntüleme - Gün 0 sonra

  1. ) Adım 5.1 olarak kamera, aşamaları ve lensler başlatmak, kamera açın.
  2. ketamin (120 mg / kg) / ksilazin (6 mg / kg) karışımı, 60 ul (adımlar 3.5'e 3.1 bakınız) intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi.
    NOT: anesthetization Bu yöntem her 5 günde görüntüleme sağlar. Günlük görüntüleme, anestezi ve anestezi ile kullanılmak için müsait bir biyoışıldama görüntüleme gerekli olduğu gibi izofluran kullanan bir yöntemi gerçekleştirmek için.
  3. Adımlar 5.5) ve 5.6) 'de olduğu gibi otomatik pozlama özelliğini kullanarak hayvanın ön ve arka görüntüleri, edinin. Adım 5.7) olarak fareyi tutun.

7. Biyoparlaklık sayısallaştırılması ve Görüntü Analizi

Not: luminoscore yöntemi görüntü analysi dayanırs. Çıkan yukarıdaki adımları göre elde edilmiş sonra, ölçme her zaman gerçekleştirilebilir, her zaman noktasında her bir fare için bir luminoscore ilişkilendirmek (edinme hemen sonra olmak üzere).

  1. "Görünüm" menüsünden tıklayarak "Aracı Paleti" Ekran ve önceden görüntülenen o zaman "Aracı Paleti" üzerine tıklayın. Aracı Palette "ROI Aracı" sekmesine tıklayın. "Kontur" düğmesini seçin ve ardından "Ücretsiz beraberlik" seçeneğini seçin.
  2. El ile ön görünümünde fare kenarlarını takip ederek fare etrafında Önemli (ROI) Bölge işaretleyin. bilgisayar fare üzerinde bir sağ tıklama ile kontur kapatın.
  3. "Görünüm" menüsünden ve sonra "ROI Ölçümleri" linkine tıklayın. "(Fotonlar)" emin olun "ROI Ölçümleri" penceresinin sol alt menüyü kaydırma "Ölçme Türleri" seçilir. Değilse, onu seçin. Sonra foton fl ölçmekux "Toplam Flux [p / s]" kutusundaki değeri kaydederek (ph / s).
    NOT: Parıltısını veya YG yüzey alanına göre herhangi bir başka birim kullanmayınız.
  4. Tekrarlayın arka görünümü için 7.2) ve 7.3) yineleyin.
  5. Ön ve arka görünümü elde edilen iki foton akı değerleri toplamak. Sonuç luminoscore olduğunu.
  6. 14 (örneğin, non-parametrik iki kuyruklu Mann-Whitney testi), uygun istatistik testi kullanılarak her bir grup için değerleri karşılaştırın.

Sonuçlar

Luminoscore Yöntemi Tümör Hücre Enjeksiyon doğrulama için kulluk edebilir

Enjeksiyon bölgesi enjeksiyon görsel doğrulama izin vermediğinde tümör hücrelerinin az sayıda enjeksiyonunu içeren modellerinde veya, enjeksiyon kalitesini sağlamak için çok zor olabilir. luminoscore yöntemi prosedürünün kalitesini doğrulamak ve kolayca ve anında her şeyi doğru gittiğini tespit etmek hızlı ve kolay bir araç olarak hizmet vermektedir. Her iki modelde, tümör enjeksiyonu (Şekil 1A) sonra, 10 dakika kadar erken tespit edilebilir. görüntüleri tek başına tümör hücreleri doğru konumda mevcut doğrulamak için yeterli. Bununla birlikte, görüntüleri miktarının enjeksiyon heterojen bir fikir vermektedir. Nokta arsa (Şekil 1B) açıkça alınan hayvanlar arasında bir fark (siyah nokta) gösterir ve tekrar etmediEğer okumak (kırmızı çizgi) enjeksiyonları. İlginç bir şekilde, SCL modelinde elde edilen sinyal Piol modelinde 100 kat daha fazla olduğu; Bu bulgu, enjekte edilen hücrelerin sayısı (5 x 10 6 ve 1 x 10 4 hücreleri, sırasıyla) ile tutarlıdır.

figure-results-1
Farklı fare lenfoma modellerinde Enjeksiyon Şekil 1. doğrulanması. Luminoscores farklı lenfoma modellerinde tümör hücresi aşılamasından sonraki 10 dakikada bir ölçülür. (A), her iki model Örnek görüntüler. (B) Luminoscore farklı model her bir hayvanın. Kırmızı çizgi tümör hücre aşılamadan önce 10 hayvanlar üzerinde ölçülen ortalama arka plan gürültü karşılık; noktalı çizgiler ortalama +/- standart sapma değerleridir. Her bir model için, bütün hayvanlar arka plandaki gürültüden ayırt edilebilir. Piol modelinde, 1 x 10 4 hücre INOC edildiSağ gözün vitreus olup, bun- ve SCL modelinde, deri altı fare her böğrüne 5 x 10 6 hücre. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tümör Yükü ve Tedavi Tepkisi İzleme

Luminoscore ayrıca tümör büyümesini ve tedavi etkinliğini incelemek için güçlü bir araçtır. 2A kontrolünde tümör büyümesinin izlenmesi temsilcisi görüntüler gösterir ve CpG Piol grupları tedavi Şekil. Farenin 1 x 10 4, tümör hücreleri, her aşılandı ve tedavi resim yeterli bir süre (28 gün) sonra, metastaz, kontrol grubunda ortaya çıkmaya başladı göstermektedir 7. günde yerinde uygulanmıştır. Primer tümör tedavisine duyarlı görünmedi, ancak, daha azmetastaz CpG ile tedavi edilen grupta (Tablo 1) 'de tespit edilmiştir. Her bir grupta (Şekil 2B) tümör yükünün kantitatif analiz CpG tedavi ve 28 gün (non-parametrik iki kuyruklu Mann-Whitney testi, p = 0,0079 sonra kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark üreten, tümör gelişimini yavaşlattığını göstermektedir ). Bununla birlikte, tümör de tedavi edilen farelerde büyümüş ve bunların hiçbiri (veriler gösterilmemiştir) kurtuldu. Bu bulgu önceki çalışmalarla tutarlıdır: CpG Primer oküler tümörler 10 üzerinde önemli etkileri vardır. Biz ODN ve CpG grubu arasında burada sahip önemli bir etkisi metastazı büyüme inhibisyonu geliyor.

figure-results-2
Şekil 2. İzleme Tümör Yükü ve Tedavi Tepki. (A) İki grubun Örnek görüntüleri (ODN kontrol ve CpG ile muamele edilmiş) nf farelerde Piol taşıyan. luminoscore (B) İzleme tümör yükünü. nokta arsa üzerinde görüldüğü gibi, luminoscore üzerinde CpG etkisi bu iki grupta da 28. günde önemli olan, bu yöntem sayesinde tümör yükünü izlemek ve CpG- hafif fakat anlamlı (p = 0.0079) etkilerini ölçmek için yapılan yalnız görüntüleri ile tespit edilmemiştir olabilirdi DNA. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Gruplar Fare Metastazların varlığı yer Foton akı (ph / s)
CpG 1 Yok hayır X X
2 Evet Göz drenaj lenf nodu 9.32E + 05
3 Yok hayır X X
4 Yok hayır X X
5 Evet Göz drenaj lenf düğümü 2.21E + 07
ODN 1 Evet Göz drenaj lenf düğümü 1.06E + 07
2 Evet Göz drenaj lenf düğümü 7.25E + 07
3 Evet Göz drenaj lenf düğümü + kontralateral 7.64E + 08
4 Evet Göz drenaj lenf düğümü + kontralateral 1.74E + 09
5 Evet Göz drenaj lenf düğümü + kontralateral 9.76E + 07

Tablo 1. TO Luminoscore Yöntemi Farklı Yaklaşımlar adapte edilebilir

Luminoscore yöntemi fare modeli, tek bir türü ile sınırlı değildir. Bu, farklı fare modelleri için adapte edilebilir 3 göstermektedir. SCL modelinde, iki tümör fare her bir yanı üzerinde aşılı vardır. Tedavi 0. günde tek bir tarafına yerinde tatbik edilmektedir, ve karşı tümör, kontrol (Şekil 3A) olarak görev yapmaktadır. Bu nedenle, iki YG fare başına çizildi: her bir tarafında (Şekil 3C) için bir tane. Tedavi ve kontrol tarafta luminoscore arasındaki oran her tümörün göreli ders açıklanmaktadır. Tedavi verildiğinde bu oran, Gün 0 1 olarak ayarlandı. Biz 13 gün tedavi uygulandıktan sonra bu oranın önemli bir azalma gözlenmiştir (Şekil 3D, non-parametrik iki kuyruklu Mann-Whitney testi, p = 0.004). Bu azalma olduğu tedavi tarafı tümörü açığatemsili biyoparlaklık görüntüleri (Şekil 3B) gösterildiği gibi, rezorbe olmuştur.

figure-results-3
Şekil İki İlköğretim Tümör Siteleri ile bir Model Luminoscore Yöntem 3. Adaptasyon. (A) bir SCL testinin deneysel tasarım. farenin her bir kanat iki primer tümör enjekte edilmiştir. Bir iki tarafında CpG DNA veya ODN kontrolü ve PBS ile diğer tarafta da bir kontrol olarak hizmet etmek için enjekte edilir. (B), 0. günde ve 13. günde tedavi CpG ile tedavi edilen ve kontrol farelerinin Örnek resim uygulanmıştır günde 0. tümör büyüme fare CpG tedavi edilen tarafta engellenmiştir. (C) elle iki primer tümör siteleri için hayvan başına ilgi alanları işaretlenmiş. (D) CpG-muamele ya da luminoscores arasındaki oran ODN-kontrol tarafı ve PBS kontrol tarafı bir dizin olduğunuAynı hayvanda her tümörün nispi büyüme yansıtır. Bu oran, 13. günde 0. günde 1 olarak ayarlandı, CpG ile tedavi edilen grubun oranı önemli ölçüde azalmış (p = 0.004), CpG-DNA'ya in situ yönetiminde ile tümör büyümesinin engellenmesini ortaya çıkarılmıştır. Burada tıklayın görüntülemek Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Tartışma

Bu sınırlama herhangi bir optik görüntüleme yöntemi ile içsel olmasına rağmen organ ve dokuların ışık emme, biyoparlaklık görüntüleme bir sınırlama kalır. Bizim yaklaşımımız çerçevesinde, luminoscore üzerinde anatomik yapıların etkileri çalışmalar daha sonra karşılaştırmalar izin verilen bir modelin (konumu ve fare iplikçik) yapılmaktadır şartıyla düşük değişkenlik olması bekleniyor. Biyoparlaklık uyarma ışık gerekmez ve böylece daha fazla floresan fazla in vivo görüntüleme tüm vücuda adapte edilir.

Uzamsal çözünürlük de biyoparlaklık görüntüleme bir sınırlama ve biyoparlaklık fotonlar yayılan edildiği organın hassas konum zordur. Ancak, modelin iyi bilgi tümör siteleri nitel bir konumda yardımcı olabilir. Bu biyolüminesans tabanlı yöntemde sadece çıkış luminoscore olduğunu. Yer luminoscore etkilemez interes manuel mark-up Region çünküt (YG) tüm fare kapsar. Son olarak, ateşböceği lusiferaz oksijen gerektirir. Buna göre, biyoparlaklık görüntüleme genellikle nekrotik tümörler hafife. Bir kez daha, bu modelin bu yönünün iyi bir bilgi gereklidir.

Bu yazıda (zaten 7,9,11 gösterilmiştir) ama biyolüminesans veri setlerinin karşılaştırma sağlayan bir yöntem tanımlamak için bir anti-tümör ilaç olarak CpG etkinliğini değerlendirmek yönelik değildir. Biz gerçekten farklı zamanlarda farklı yerlerde farklı deneyleri karşılaştırmak için satın alma protokolü standardize yardımcı olmak için tasarlanmıştır tümör yükünü ölçmek için bir yöntem tarif ve bilgisayar hesaplamaları gerektirmez. tekrarlanabilirlik ve doğru foton akı ölçümü sağlamak için, görüntüleme cihazı ev yapımı cihazlar için hafif bir başvuru ile kalibre veya gereken ticari cihazlar için sağlayıcı tarafından tavsiye edilen.

Bizim protokol pek çok kritik p dikkat gerektiriroints: (i) Birincisi, fare anestezi kalitesi özellikle uzun pozlama süreleri olgularda, net görüntüler elde etmek için çok önemlidir. (Ii) ölçümü birimi her zaman Radiance her farenin yüzey alanına bağlıdır ve farklı fareler karşılaştırmak için alakasız olabilir çünkü foton akısı olmalıdır. Bu önyargı luminoscore olur çünkü (iii) biyolüminesans görüntüleri, doymuş piksel içermemelidir. (iv) Arka ve ön alım tümör sitesinden (yani, ön alım mutlaka tümörün arkasından fotonlar tespit olmayabilir) yayılan tüm fotonları toplamak için gereklidir. Çeşitli farklı YG çizimleri luminoscore yönteminin gelişimi sırasında test edilmiştir. Sadece manuel işaretleme (veriler gösterilmemiştir) istatistiksel olarak anlamlı daha muhtemeldir tatmin edici sonuçlar vermiştir.

Inoue ve diğ. 75 mg luciferin dozunu tavsiye / 13 kg. 150 mg doz kullanılarak / sonra yerine görüntüleme zamanlamasını kgluciferin yönetim değişmeden kalır ve biz yayla uzun pozlama edinimi boyunca sürer emin olun. Luciferase edinme süreci boyunca aşırı reaktan olmalıdır. Biz hayvan başına iki ROI çekti SCL modelinde gösterdi modeline bağlı olarak, faiz bölge, adapte edilebilir. SCL modelinde, tedavi enjekte edilir tümör değişkenliği sınırlamak için onun en büyük çapı 0.5 cm ulaştığında engraftman. fareler bağlı tümör farklı büyümüş olabilir. standardize ve fareler karşılaştırmak için, biz her iki kanat tümörlerin nispi büyüme ortaya muamele ve olmayan işlemden geçirilmiş tarafı arasında bir oran kullanmaya karar verdi.

Sinyal, pozitif olması beklenen enjekte fareden gözlenirse, (i) hücre sayısı çok düşük olduğu ve sinyal algılama eşiğinin altında olduğu; veya (ii) fare oksijen yoksun ve acil bakım gerektirir.

Kantitatif bioluminesc çeşitlience çeşitli yazarlar tarafından açıklanan analizleri yayılan Biyoparlaklık fotonların 5,15 mutlak ölçümü yaklaşım karmaşık hesaplamaları ve araçları (örneğin, 3D biyoparlaklık tomografi) gerektirir. 2B biyolüminesans görüntüleyici ile, özellikle tümör modellerinde, tekrarlanabilir ışıldaması ölçülerek için bir yöntem üzerinde görüş birliği yoktur. Amacımız kullanıcı bağımlılığını sınırlamak için görüntü elde etme protokolünü standardize oldu.

Tümör aşılamasından sonra in situ CpG enjeksiyonu her iki modelde de tümör yükünü azaltmaktadır. luminoscore yöntem, tümör immünoterapilerin diğer modellerde tümör yükünü izlemek için bir araç olarak kullanılabilir. tümör yükünü İzleme tümör mikroçevresinin müdahale etmeden tümör büyümesi ve metastaz mekanizmaları anlayışımız artırabilir noninvaziv bir yöntem sağlar. yapmak ve bu yöntemle tedaviye yanıt vermeyen hayvanların tanımlanması s doğrulama ile takviye edilmiştirDeneyin başında uccessful tümör hücresi enjeksiyonu yapılmıştır.

Burada A20.IIA-luc2 hücreleri kullanılarak SCL modelinde luminoscore yönteminin uyum göstermiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, diğer hücre hatları da lusiferaz eksprese eden veya bu Resim kullanılarak başka tümör modelinde adapte edilebilir T-hücresi çalışmaları (tümöre özgü sitotoksik T hücrelerinin, düzenleyici T-hücrelerin, vs.) bağlamında. Nadir görülen gen terapisi bağlamında in vivo gen transferi izlenmesi de luminoscore yöntemi kullanılarak yapılabilir.

Sonunda veri biyolüminesans tabanlı luminoscore yöntemi, deneyler arasında karşılaştırma sağlayan spesifik deneysel ihtiyaçlarına esneklik ve uyum sunar ve invaziv olmayan uzunlamasına preklinik çalışmalar için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Biz Cordelier Araştırma Merkezi (CEF, Paris, Fransa), Genethon (Évry, Fransa) ve Genopole (CERFE, Evry, Fransa) hayvan tesisleri teşekkür ederim. Biz yazının ona dikkatli okumak için Jo Ann Cahn teşekkür ederim. Bu araştırma Enstitüsü National de la Sante Et de la Rechercher MEDICALE, Paris Descartes Üniversitesi, Pierre & Marie Curie Üniversitesi, Dernek la Recherche contre le Kanser, Tunus Yön Générale de la Recherche Scientifique dökmek, Fransız-Tunus CMCU tarafından desteklenen proje ve Incitatives de Genopole (ATIGE) fonları Thématiques Eylemler. JC Yaşam Bilimleri doktora okulda Frontiers tarafından ve INCA (Institut National du Kanser) bir burs ile desteklenmiştir. RBA DGRS-INSERM ve CMCU hibe bir alıcı oldu. SD Institut National du Kanser bir hibe aldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CpG 1826İnvivojenDizisi: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT
Katalog numarası: tlrl-1826
ODN 1826 kontrolüInvivogenDizisi: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT
Katalog numarası: tlrl-1826c
D-lusiferin potasyum tuzuInterchimKatalog numarası: FP-M1224D
KetaminVirbac, Fransa
XylazinBayer SağlıkRompun% 2
A20. IIA-luc2 hücre hattıA20. IIA, pGL4.50 [luc2 / CMV / higro] ile transfekte edildi 7< / sup>
(Promega E1310)
FarelerBalb/cByjaltı haftalık dişiler
Perkin Elmer
Living Image yazılımıPerkin ElmerGörüntülerdeki foton akısını ölçmek ve ROI'leri
R yazılımı (açık kaynak)İstatistik testleri
Hamilton Precision Serynge 10 & mikro; l HamiltonÜrün numarası: 7642-01100
Göz merhemiLacrinorm
Diseksiyon mikroskobuZEISSStemi 305
Charles River IVIS lumina Biolumienscence görüntüleyiciden çizmek için kullanılıriçin kullanılan R-projesi

Kaynaklar

  1. Rehemtulla, A., et al. Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging. Neoplasia. 2 (6), New York, N.Y. 491-495 (2000).
  2. Edinger, M., et al. Advancing animal models of neoplasia through in vivo bioluminescence imaging. European Journal of Cancer. 38 (16), Oxford, England. 2128-2136 (2002).
  3. Hastings, J. W., Gibson, Q. H. The Role of Oxygen in the Photoexcited Luminescence of Bacterial Luciferase. Journal of Biological Chemistry. 242 (4), 720-726 (1967).
  4. Inouye, S., Shimomura, O. The Use of Renilla Luciferase, Oplophorus Luciferase, and Apoaequorin as Bioluminescent Reporter Protein in the Presence of Coelenterazine Analogues as Substrate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (2), 349-353 (1997).
  5. Pesnel, S., et al. Quantitation in Bioluminescence Imaging by Correction of Tissue Absorption for Experimental Oncology. Molecular Imaging and Biology. 13 (4), 646-652 (2010).
  6. Corre, G., et al. Stochastic Fluctuations and Distributed Control of Gene Expression Impact Cellular Memory. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
  7. Ben Abdelwahed, R., et al. Lymphoma B-cell responsiveness to CpG-DNA depends on the tumor microenvironment. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research CR. 32 (1), 18(2013).
  8. Abdelwahed, R. B., et al. Preclinical Study of Ublituximab, a Glycoengineered Anti-Human CD20 Antibody, in Murine Models of Primary Cerebral and Intraocular B-Cell Lymphomas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3657-3665 (2013).
  9. Donnou, S., Galand, C., Touitou, V., Sautès-Fridman, C., Fabry, Z., Fisson, S. Murine Models of B-Cell Lymphomas: Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances in Hematology. 2012, (2012).
  10. Qi, X. -F., et al. CpG oligodeoxynucleotide induces apoptosis and cell cycle arrest in A20 lymphoma cells via TLR9-mediated pathways. Molecular Immunology. 54 (3-4), 327-337 (2013).
  11. Houot, R., Levy, R. T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy. Blood. 113 (15), 3546-3552 (2009).
  12. Krieg, A. M. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer. Oncogene. 27 (2), 161-167 (2008).
  13. Inoue, Y., Kiryu, S., Watanabe, M., Tojo, A., Ohtomo, K. Timing of Imaging after D-Luciferin Injection Affects the Longitudinal Assessment of Tumor Growth Using In Vivo Bioluminescence Imaging. International Journal of Biomedical Imaging. 2010, (2010).
  14. Mann, H. B., Whitney, D. R. On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other. Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
  15. Darne, C., Lu, Y., Sevick-Muraca, E. M. Small animal fluorescence and bioluminescence tomography: a review of approaches, algorithms and technology update. Physics in Medicine and Biology. 59 (1), 1(2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyol minesans G r nt lemeLuminoscore Y ntemiD Lusiferin Enjeksiyonulgi Alan AnaliziT m r Y k zlemeTedavi Yan t De erlendirmesiCpG DNA TedavisiPreklinik K k Hayvan

İlgili makaleler