Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi
Bu makalede
Özet
Özet
Bu yazının Enterococcus spp eşzamanlı ölçümü. Ve insan fekal-ilişkili HF183 işaretleyici için bir dubleks dijital PCR testi (EntHF183 dPCR) açıklar. EntHF183 dubleks dPCR (EntHF183 dPCR olarak anılacaktır buradan sonra) deneyi yayınlanmış bireysel kantitatif PCR (qPCR) meslektaşlarıyla aynı primer ve prob dizileri kullanır. Aynı şekilde, önce qPCR uygulandı aynı su filtreleme ve DNA ekstraksiyon prosedürleri dPCR çalıştırmadan önce takip edilmektedir. Ancak, dubleks dPCR tahlil qPCR deneyleri üzerinde birçok avantajı vardır. En önemlisi, dPCR tahlil hedefleri doğrudan ölçümü ile dolayısıyla standart bir eğri çalışan ve ihtiyacını, ilgili önyargı ve değişkenliği, ortadan kaldırır. QPCR (yani eşzamanlı kantifikasyon) enterokokların ve HF183 arkalı önlü ise ek olarak, çoğu kez bir numunede daha az bol hedefin ciddi küçümsenmesi yol açar, dPCR hem hedeflerin tutarlı ölçümü sağlar, uyandırmakona aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak tek başına ya da miktarı. dPCR deneyi de qPCR tolere daha yüksek büyüklükte bir ya da iki emirler PCR inhibitörü konsantrasyonları tolere edebilmektedir. aynı anda iki ayrı qPCR deneyleri çalıştırmak için gerek kalmadan çevre sularda hem genel hem de insan-ilişkili fekal kontaminasyon doğru ve tekrarlanabilir bilgi sağlar, çünkü bu avantajlar EntHF183 dPCR tahlil özellikle çekici olun. qPCR üzerindeki avantajlara rağmen, şu anda mevcut cihaz olan dPCR deneyinde üst miktar sınırı yaklaşık qPCR elde edilebilenden daha düşük bir magnitüd dört işlemlerdir. Sonuç olarak, seyreltme, tipik pis su sızıntıları ardından gözlenen hedef organizmaların yüksek konsantrasyonlarının ölçümü için gereklidir.
Giriş
daha hızlı, daha esnek ve geleneksel kültür temelli yöntemlerle karşılaştırıldığında özel çünkü kantitatif PCR (qPCR) yöntemleri yaygın eğlence su kalitesi izleme ve mikrobiyal kaynak takibi uygulamalarında kullanılmaktadır. Sonuç olarak, qPCR gibi Enterococcus spp gibi genel fekal göstergeler için hızlı su izleme sonuçları elde etmek için tavsiye edilir. Revize USEPA eğlence su kalite kriterleri 1. Birçok qPCR deneyleri de geliştirilmiş ve çevresel sularda 2 fekal kontaminasyon kaynaklarının belirlenmesi için onaylanmıştır. Bunlar arasında, HF183 işaretleyici deneyleri en sık insan ilişkili fekal kontaminasyonu 3 ta....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Deney karışımı hazırlanması
- TE pH 8 tamponu tüm moleküler sınıf su içinde primer ve prob [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12 100 mol / L stok konsantrasyonları olun; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Not: iki hedef için sondalar floresan Malzemeleri / Ekipman Listesinde belirtildiği gibi farklı fluorophores 7 ile etiketlenir. - Planlı reaksiyon başına, karıştırarak 12 ul dijital PCR karışımı master karışımı hazırlayın, 0.216 ul ileriye her (2x stok, Malzeme / Ekipman listesi) ve astar, 0.06 ul her floresan prob ters ve nükleaz içermeyen su ul 5,016 (son konsantrasyon : 900 nM herbir primer, 250 nM her sonda). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İyi bir EntHF183 dupleks dPCR çalıştırma kabul damlacıklar (yaklaşık 10,000-17,000) ve negatif ve pozitif damlacıklar 7 floresans değerleri arasında nispeten daha büyük bir fark (yaklaşık 5.000) nispeten yüksek sayıda neden olmalıdır. damlaların alışılmadık az sayıda büyük olasılıkla damlacık oluşturma sürecinde sorunları gösterir ve 10.000 damlacıkların bir kesim bu makalede kullanılan damlacık dPCR sisteminden ampirik verilere dayalı önerilmektedir. Pozitif.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
protokolde birkaç kritik adımlar vardır. Ana Karışım, geleneksel qPCR ana karışımları daha viskoz olduğundan ilk deney karışımları karıştırılması zor olabilir. Basit vorteksleme da deney karışımları ve daha sonra damlacıklar DNA şablonları eşit olmayan dağılımına neden olur yeterli karıştırma, neden olabilir. protokol açıklanan karıştırma-by-pipetleme tekniği doğru dPCR ölçümünü sağlamak için takip edilmelidir. İkinci olarak, damlacıklar tek yapılı bir şekle ve boyuta üretilen sağlamak için önemlidir. Zaman damlacık jen.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarların hiçbir teşekkür hakkı yok.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Düşük Bağlamalı Mikrotüpler | Costar | 3207 | Reaktiflerin depolanması, ana karışımların numuneleri/üretimi için |
| Nükleaz İçermeyen Su | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 tamponu | FisherSci | BP2473-100 | |
| Sert Kabuklu 96 Kuyulu Plaka | BioRad | HSP-9601 | İlk ana karışım ve numune aşılaması için |
| Alüminyum Sızdırmazlık Filmi | BioRad | 359-0133 | Numune plakasını kapatmak için |
| Damlacık Jeneratörü | BioRad | 186-3002 | |
| Damlacık Üretimi Yağı | BioRad | 186-3005 | |
| Kartuş BioRad | 186-4008 | ||
| DG8 Kartuş Tutucu | BioRad | 186-3051 | |
| Conta | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μ l pipet uçları | Rainin | GP-L10F | Numune/ana karışımı 200 μ'ya tansferring yapmak için |
| ; l pipet uçları | Rainin | GP-L200F | Damlacıkları nihai Twin.Tec Plakaya aktarmak için Twin.Tec |
| 96 Kuyulu | Plaka Eppendorf | 951020320 | Son damlacıklar için termal döngü ve okuma |
| Delinebilir Isı Yalıtım Folyosu | BioRad | 181-4040 | Thermalcycling'den önce Twin.Tec plakasını kapatmak için |
| PX1 PCR Plaka Kapatıcı | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Termal Döngüleyici | BioRad | CFX96 ve C1000 | Yalnızca termal döngüleyiciye ihtiyaç vardır, optik yok |
| QX100 Damlacık Okuyucu | BioRad | 186-3001 | |
| Damlacık Okuyucu Yağı | BioRad | 186-3004 | |
| Damlacık PCR Supermix | BioRad | 186-3024< | em>i.e. el yazması QuantaSoft yazılımındaki dijital PCR karışımı |
| (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | ddPCR verilerini görüntülemek, analiz etmek ve dışa aktarmak için |
| Entero İleri Astar (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternatif satıcı kullanılabilir |
| Entero Ters Astar (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternatif satıcı |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA ETİKETİ CTT ETİKETİ GGC TA-[BHQ1] | Alternatif satıcı kullanılabilir, ancak floroforun FAM |
| HF183 İleri Astar ( HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternatif satıcı kullanılabilir |
| HF183 Ters Astar (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternatif satıcı kullanılabilir |
| HF183 Probu (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] | Alternatif satıcı kullanılabilir, ancak florofor HEX olmalıdır (VIC kullanılıyorsa, uygun matris telafisi seçilmelidir. |
| Pozitif kontrol | E. faecalis genomik DNA ve HF183 standart plazmid karışımı (IDT'den sipariş edilir). E. faecalis kültürlemede ayrıntılı yöntemler ve sipariş edilen HF183 plazmidinin dizileri için lütfen Cao et al. 2015'e bakın (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Ticari olarak mevcut Enterococcus< / em> DNA standartları (ATCC 29212Q-FZ), laboratuvarda hazırlanmış E. faecalis< / em> genomik DNA yerine pozitif kontrolde de kullanılabilir. |
Kaynaklar
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
