Yöntem makalesi

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/53616

⸱

7 Ocak 2016

 , 
1Research Center for Regenerative Medicine, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 2Department of Biology and Biotechnology "L. Spallanzani", University of Pavia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada Nükleolar organizasyon dayalı fare antral oosit karakterizasyonu için bir protokol mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare antral GV (Germinal Vezikül) oositlerini in vitro olgunlaşma (IVM) ve in vitro fertilizasyondan (IVF) sonra blastosist aşamasına gelişebilecek (SN, Etrafı Sarılmış Nükleol) veya gelişemeyen (NSN, Etrafı Sarılmamış Nukleol) olarak izole etmek ve karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntemi tanımlar. NSN oositlerinde olduğu gibi, SN oositlerinde bir halka gösteren veya göstermeyen nükleolusun heterokromatinine bağlanabilen Hoeschst33342 (veya başka herhangi bir DNA birleştirici boya) kullanır. Bu, sonunda IVM veya IVF prosedürleri için kullanılabilecek her iki antral oositi sıralamanın en kolay ve en hızlı yolunu temsil eder.

Kısaca protokol şu adımlardan oluşur: foliküler büyümeyi uyarmak için hormon enjeksiyonu; yumurtalığın steril bir iğne ile delinmesiyle GV evresindeki oositlerin antral bölmeden izolasyonu; oositlerin ağızdan pipetlenmesi için ince cam pipetlerin hazırlanması; oositlerin supravital konsantrasyonda hazırlanan Hoechst33342 ile sınıflandırılması; IVM, IVF veya diğer herhangi bir moleküler / hücresel analiz.

Ne yazık ki, daha az invaziv teknikler kullanarak SN ve NSN oositlerini sıralamak için hala az sayıda kanıt var. Eğer ve bir kez tanımlanacaklarsa, değiştirilmesi gereken çeşitli yönlerle birlikte, potansiyel olarak insan destekli üreme teknolojilerine uygulanabilirler. Bugüne kadar, bu tekniğin hem nesli tükenmekte olan hem de ekonomik çıkarları olan türlerde IVM ve IVF başarılı prosedürlerini önemli ölçüde artırmak için potansiyel etkileri vardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalık antral bölümünden izole antral tam olarak büyümüş oositler (GV, germinal vesicle) rutin gibi farklı amaçlar için kullanılabilir, örneğin, Metafaz II aşamaya kadar in vitro olgunlaşması arkasına moleküler ve hücresel mekanizmalar çalışma.

Onların güzel bir görünüm en antral oosit rağmen ama hepsi değil, mayoz tamamlamak ve blastosist aşamasına ulaşabiliyorlar; döllenme 3-5 oluşursa aslında, insanlar 1,2 dahil olmak üzere birçok memeli türlerinde, içinde, bunların yaklaşık% 30, 2-hücreli aşamada kendi gelişimini tutuklama. Bugüne kadar, birkaç parametre bunu yapamaz olanlardan embriyo gelişimini sürdürmek mümkün oosit ayırt etmek için kullanılır.

Örneğin, kresil mavi boyama (BCB) BCB + veya BCB- boyama ile ilgili olan bu sıralama yöntemi programı olmasına rağmen glikoz-6-fosfat dehidrojenaz aktivitesi göre oosit sıralamak için geçerli bir yöntemdirHala 6-8 bağımlı laboratuvar.

Başka köklü yöntem kendi kromatin organizasyonu bulunur: (Hoechst33342 gibi) herhangi bir DNA interkalasyon boyalarla boyanmış ise, antral oosit% 70 çekirdekçik etrafında bir boya pozitif halka göstermek ve Nukleolus (SN) çevrili denir olan% 30 kalarak Bir daha benekli olumlu sinyaller ve (NSN) 3-5 değil çevrili Nukleolus denir. Son zamanlarda biz gösterdi sitoplazmik örgülerde 9 (CPLS, memeli oosit ve embriyoların hem maternal mRNA ve ribozomlar için önemli depolama siteleri) olmaması 10. ve varlığı ile birlikte (CPLS oluşumu 11 için gerekli) MATER aşağı-regülasyonu, Onların sitoplazmalarında 9,12 lipid damlacıkları, 2-hücre aşamasına ötesine devam etmek NSN oosit yetersizlik ile ilgili diğer nedenler olabilir.

Ne yazık ki, bazı teknikler antral SN ve SDİ oosit ve sıralamak için uygulanabilir,Bu nedenle, (nükleer boyanma, tespit prosedürleri ya da ağız pipetler ile manipülasyon olmadan) daha az invazif yöntem geliştirilmesi hem insan ve hayvan embriyo gelişimi oranlarını artırmak için çok önemli hale gelebilir.

Bu yazıda, detay, basit ve hızlı bir protokol reklam sıralama SN ve dişi farelerden alınan NSN antral oosit izole etmek için kullanılan ve kadın gametogenez, oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimi çalışmasında ilgilenen tüm bilim adamlarına hitap etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Avrupa rehber ilkeler (AB 63/2010) ve bilimsel araştırmalar için kullanılan hayvanların korunması İtalyan (26/2014) yasalara uygun olarak yapılmaktadır. Servikal dislokasyon ötenazi yumurtalıkların izolasyonu için kullanılır ve bu çalışmayı kapsayan onaylanan protokole listelenen kişilerin uzman tarafından gerçekleştirilen ve eğitimli.

1. Hayvanlar

  1. Kontrollü sıcaklık ve nem ile bir odada 6 haftalık dişi farelere yetişkin 3- Bakım (12L evreleri ile: 12D ve beslenmiş ad libitum).
  2. Folikül uyarıcı hormon (FSH) etkisini taklit ederek foliküler büyümesini teşvik etmek için Gebe kısrak serum gonadotropini 2.5 IU (PMSG) intraperitoneal olarak farelere enjekte ile. Daha sonra antral oosit toplama 48 saat için yumurtalıklar izole edin. Senin kurumsal kurallarına göre, daha önce PMSG enjekte dişi fare Euthanize.
  3. Hızla vücut boşluğundan yumurtalıkların kaldırmak ve petri cont içine yerleştirinsonraki oosit izolasyonu için M2 orta Aining (Bölüm 3).
    1. Steril diseksiyon makas kullanarak periton bir kesi ardından karın duvarı kaplayan deride bir kesi yapmak. Mesane başlayarak V-şekli oluşturan, karın ortaya çıkarmak için kesik açıldı steril cımbız kullanarak bir tarafında cesaret taşımak ve uterin tüpleri lokalize.
    2. Böbrekler altında bulunan yumurtalıklar uyun. Steril cımbız ile her tüp tutun ve onları serbest bırakmak için yumurtalıkların dibinde küçük bir kesi yapmak. Önceden dengelenmiş ortamını içeren bir petri kabı altındaki iki yumurtalık aktarın.

2. Hormon Hazırlık

  1. Uygun bir enjeksiyon hacmi için 0.1 ml başına 2,5 IU hormonu çalışma konsantrasyonu elde etmek üzere, steril izotonik tuzlu su çözeltisi ile (başka bir stok çözeltilerinden mevcuttur) PMSG seyreltilir.
    Not: Hormon çözeltiler 0.5 ml tüpler içinde alikotlandı ve saklanmalı -2Kullanım güne kadar 0 ° C. -20 ° C'de üç aydan uzun seyreltilmiş alikotları tutmayın. Çözülmüş kez seri enjeksiyonlar yapılır, eğer 4 ° C'de hormon çözümleri hacimde depolamak ve 4 gün içinde bunları kullanmak.

3. Antral oositler İzolasyonu

Doğru oosit izolasyonu için:

  1. Oositler izolasyon prosedürü başlamadan önce en az 1 saat boyunca% 5 CO2 ve 37 ° C M2 ortamı 13 (M2) dengelenmesi. İki petri kaplarına (35 mm x 10 mm), yumurtalık delme ve ayrıştırıldıktan sonra, oosit transferi için, mineral yağ (yaklaşık 1.5 mi) ile kaplanmış M2 küçük damla ikinci bir (20 ul) için M2 1 ml ile bir hazırlama yumurtalık (3.4-3.6 bakınız). Kullanılmaya hazır kadar% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübatör içinde iki petri kaplarına tutun.
  2. Oosit izolasyon işlemleri sırasında Stereomikroskopta kullanın.
  3. Stretç tarafından oosit toplamak için ince ağız cam pipetler hazırlayınhing cam Pasteur pipetler Bunsen beki gelen dikey bir alev (Şekil 1) üzerinden, (iki elinizle pipet uçlarını tutarak) yatay tuttu.
    1. Cam erimeye başladığında, alev dışarı pipetlemeyin almak ve istenen pipet elde etmek için hızlı bir çekme hareketi gerçekleştirin. Sıkıca uzunluğu ve iç kılcal çapını ayarlamak için tırnaklarıyla pipet dar noktasına yakın aşırı cam kesti. İnce kılcal oositin çapından biraz daha büyük ~ 100 um bir iç çapa sahip olduğundan emin olun (~ 80 mm).
    2. Ağız pipet, uygun ucu kullanılarak çekilen pipet aspiratör tüpün bir ucunu ve diş ile güvence, ağızda diğer ucunu yerleştirin.
  4. Steril cımbız kullanarak yumurtalıkların toplamak ve bir hücre kültürü petri kabı (35 mm x 10 mm) altında bırakılması. M2 1 mi, daha önce 37 ° C 'de dengelenmiş ile örtünve% 5 CO2 (Şekil 2).
  5. Yavaşça M2 (Şekil 3) antral oosit serbest bırakmak için steril bir insülin şırınga iğnesi ile yumurtalıkların antral folikül delinme.
  6. Yavaşça ağız folikül hücreleri ve diğer olası doku artıkları (Şekil 4A) kaldırmak ve daha sonra, daha önce (embriyo kültürü için uygun mineral yağ ile kaplanmış M2 küçük damla (20 ul) altındaki yerleştirilmeleri için dar bir Pasteur pipeti ile oosit Pipeti hazırlanmıştır; Şekil 4B).
    NOT: M2 çeşitli ve farklı damla ile sürekli pipetleme oosit zona pellucida bağlı tüm kümülüs hücreleri çıkarmak için önemlidir. Ortamın pH değişiklikleri önlemek için mümkün olduğunca çabuk bu adımı gerçekleştirin.

Hoechst33342 4. antral Oositler Boyama

NOT: Antral oositler SN (çevrili Nukleolus), NSN (Çekirdekçik çevrili değil) ya da ayırt edilebilirBaşka ara form olarak, Hoechst33342 ve supravital konsantrasyonu (veya bazlar için özel herhangi bir başka belirteçler AT) 14 boyandıktan sonra kendi kromatin organizasyonu dayalı. NSN dolayısıyla değil, adını yaparken aslında, SN oositlerin nucleolus etrafında Hoechst-pozitif halka göstermek.

Doğru oosit boyama için:

  1. Karanlıkta 10 dakika boyunca 50 ng / ul supravital konsantrasyonda Hoechst33342 (20 ul) M2 seyreltildi damla bir ağız pipet kullanarak oosit aktarın.
  2. Hoechst33342 ile inkübasyondan sonra, kromatin organizasyonu (SN ya SDİ) göre ayrılması için, mineral yağ ile kaplanmış M2 küçük damla (5 ul), alt kısmında bir ağız pipetle her bir oositin aktarın. Oosit kromatin yapılandırmasını görselleştirmek için Hoechst33342 filtresi (emisyon dalga boyu 486 nm) ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskop kullanın.
    Not: kullanılan floresan mikroskop türüne bağlı olarak, it görüntü elde etmek için cam alt petri kullanmak zorunlu hale gelebilir. 35 mm çanak için numune tutucu ile donatılmış konfokal mikroskopi Olympus Fluoview Fv10i bir 0.17 mm standart kalınlıkta ve kabul edilebilir 0.13 0.21 mm aralığında olan görüntü elde etmek için tek cam alt-yemekler gerektirir.
  3. Olasılıkla, daha uzun 5-10 saniye varlığı veya çekirdekçik etrafında bir halka yokluğu (Şekil 5) görselleştirmek için yeterli zaman oosit Heyecanlandırırmı.
  4. In vitro olgunlaşmayı teşvik veya moleküler veya hücresel analizler için uygun tamponlar tutmak için% 5 CO 2 ve 37 ° C'de M2, kültür antral SN ve NSN oosit sıralama sonra.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki resimler Hoechst33342 aracılığıyla Oositler 'sıralamaya pipetler hazırlanması başlayarak fare yumurtalıkların antral oosit izole etmek için kullanılan yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, oldukça basit ve bir CO2 kuluçka makinesi, bir stereomikroskop ile Hoechst33342 gözlenmesi için doğru bir filtre ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu ile donatılmış herhangi bir laboratuvar gerçekleştirilebilir Şekil 1 pipet hazırlanması oluşan bir başlangıç ​​bas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol yalıtmak ve fare antral GV oosit sınıflandırmak için kullanılan yöntem açıklanır. Birkaç istisna dışında, altını çizmek için özel bir kritik adımlar vardır. A) oosit canlılığını korumak ve b) kullanılan ortamda pH değişiklikleri önlemek: Birincisi: Bu prosedür mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. İkincisi: oosit IVM ve IVF Aşağıdaki adımlar, özellikle kromatin hasar ve oosit sonraki ölümünü önlemek için Hoechst33342 (5-10 sn) kısaca heyecanlı olmalıdır. Bugüne kadar, bu SN ve NSN fare antral oosit sıralamak ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.M. ve C.A.R., Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia'nın (I) Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009'un mali desteğini kabul eder. M.M ve C.A.R., görüntülerin hazırlanmasına yardımcı olduğu için Marianna Longo'ya teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PMSGSigmaG4527
EmbrioMax M2KırlangıçMR-015-PD
Hoechst33342Thermo Scientific62249
Mineral YağSigmaM8410
Hücre Kültürü Kabı 35mmx10mmCorning430165
µ-Dish 35mm, yüksek cam tabanlıIbidi81158
Pipet Pasteur BorosilikatCorning7095D-9
Kalibre edilmiş mikropiller pipetler için aspiratör borusu tertibatlarıSigmaA5177

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
  2. Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
  3. Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
  4. Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
  5. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
  6. Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
  7. Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
  8. Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
  9. Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
  10. Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
  11. Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
  12. Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
  13. Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
  14. Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
  15. Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hoechst 33342 StainingMouth Pipette PreparationOocyte IsolationIn Vitro MaturationIn Vitro FertilizationSurrounded NucleolusNot Surrounded NucleolusFollicle Puncture

İlgili makaleler