Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Yumurtalık antral bölümünden izole antral tam olarak büyümüş oositler (GV, germinal vesicle) rutin gibi farklı amaçlar için kullanılabilir, örneğin, Metafaz II aşamaya kadar in vitro olgunlaşması arkasına moleküler ve hücresel mekanizmalar çalışma.

Onların güzel bir görünüm en antral oosit rağmen ama hepsi değil, mayoz tamamlamak ve blastosist aşamasına ulaşabiliyorlar; döllenme ^3-5 oluşursa aslında, insanlar ^1,2 dahil olmak üzere birçok memeli türlerinde, içinde, bunların yaklaşık% 30, 2-hücreli aşamada kendi gelişimini tutuklama. Bugüne kadar, birkaç parametre bunu yapamaz olanlardan embriyo gelişimini sürdürmek mümkün oosit ayırt etmek için kullanılır.

Örneğin, kresil mavi boyama (BCB) BCB + veya BCB- boyama ile ilgili olan bu sıralama yöntemi programı olmasına rağmen glikoz-6-fosfat dehidrojenaz aktivitesi göre oosit sıralamak için geçerli bir yöntemdirHala ^6-8 bağımlı laboratuvar.

Başka köklü yöntem kendi kromatin organizasyonu bulunur: (Hoechst33342 gibi) herhangi bir DNA interkalasyon boyalarla boyanmış ise, antral oosit% 70 çekirdekçik etrafında bir boya pozitif halka göstermek ve Nukleolus (SN) çevrili denir olan% 30 kalarak Bir daha benekli olumlu sinyaller ve (NSN) ^3-5 değil çevrili Nukleolus denir. Son zamanlarda biz gösterdi sitoplazmik örgülerde ⁹ (CPLS, memeli oosit ve embriyoların hem maternal mRNA ve ribozomlar için önemli depolama siteleri) olmaması ^10. ve varlığı ile birlikte (CPLS oluşumu ¹¹ için gerekli) MATER aşağı-regülasyonu, Onların sitoplazmalarında ^9,12 lipid damlacıkları, 2-hücre aşamasına ötesine devam etmek NSN oosit yetersizlik ile ilgili diğer nedenler olabilir.

Ne yazık ki, bazı teknikler antral SN ve SDİ oosit ve sıralamak için uygulanabilir,Bu nedenle, (nükleer boyanma, tespit prosedürleri ya da ağız pipetler ile manipülasyon olmadan) daha az invazif yöntem geliştirilmesi hem insan ve hayvan embriyo gelişimi oranlarını artırmak için çok önemli hale gelebilir.

Bu yazıda, detay, basit ve hızlı bir protokol reklam sıralama SN ve dişi farelerden alınan NSN antral oosit izole etmek için kullanılan ve kadın gametogenez, oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimi çalışmasında ilgilenen tüm bilim adamlarına hitap etmektedir.

Bu protokol Avrupa rehber ilkeler (AB 63/2010) ve bilimsel araştırmalar için kullanılan hayvanların korunması İtalyan (26/2014) yasalara uygun olarak yapılmaktadır. Servikal dislokasyon ötenazi yumurtalıkların izolasyonu için kullanılır ve bu çalışmayı kapsayan onaylanan protokole listelenen kişilerin uzman tarafından gerçekleştirilen ve eğitimli.

1. Hayvanlar

1. Kontrollü sıcaklık ve nem ile bir odada 6 haftalık dişi farelere yetişkin 3- Bakım (12L evreleri ile: 12D ve beslenmiş ad libitum).
2. Folikül uyarıcı hormon (FSH) etkisini taklit ederek foliküler büyümesini teşvik etmek için Gebe kısrak serum gonadotropini 2.5 IU (PMSG) intraperitoneal olarak farelere enjekte ile. Daha sonra antral oosit toplama 48 saat için yumurtalıklar izole edin. Senin kurumsal kurallarına göre, daha önce PMSG enjekte dişi fare Euthanize.
3. Hızla vücut boşluğundan yumurtalıkların kaldırmak ve petri cont içine yerleştirinsonraki oosit izolasyonu için M2 orta Aining (Bölüm 3).
   1. Steril diseksiyon makas kullanarak periton bir kesi ardından karın duvarı kaplayan deride bir kesi yapmak. Mesane başlayarak V-şekli oluşturan, karın ortaya çıkarmak için kesik açıldı steril cımbız kullanarak bir tarafında cesaret taşımak ve uterin tüpleri lokalize.
   2. Böbrekler altında bulunan yumurtalıklar uyun. Steril cımbız ile her tüp tutun ve onları serbest bırakmak için yumurtalıkların dibinde küçük bir kesi yapmak. Önceden dengelenmiş ortamını içeren bir petri kabı altındaki iki yumurtalık aktarın.

2. Hormon Hazırlık

1. Uygun bir enjeksiyon hacmi için 0.1 ml başına 2,5 IU hormonu çalışma konsantrasyonu elde etmek üzere, steril izotonik tuzlu su çözeltisi ile (başka bir stok çözeltilerinden mevcuttur) PMSG seyreltilir.
   Not: Hormon çözeltiler 0.5 ml tüpler içinde alikotlandı ve saklanmalı -2Kullanım güne kadar 0 ° C. -20 ° C'de üç aydan uzun seyreltilmiş alikotları tutmayın. Çözülmüş kez seri enjeksiyonlar yapılır, eğer 4 ° C'de hormon çözümleri hacimde depolamak ve 4 gün içinde bunları kullanmak.

3. Antral oositler İzolasyonu

Doğru oosit izolasyonu için:

1. Oositler izolasyon prosedürü başlamadan önce en az 1 saat boyunca% 5 _CO2 ve 37 ° C M2 ortamı ¹³ (M2) dengelenmesi. İki petri kaplarına (35 mm x 10 mm), yumurtalık delme ve ayrıştırıldıktan sonra, oosit transferi için, mineral yağ (yaklaşık 1.5 mi) ile kaplanmış M2 küçük damla ikinci bir (20 ul) için M2 1 ml ile bir hazırlama yumurtalık (3.4-3.6 bakınız). Kullanılmaya hazır kadar% 5 _CO2 ve 37 ° C'de inkübatör içinde iki petri kaplarına tutun.
2. Oosit izolasyon işlemleri sırasında Stereomikroskopta kullanın.
3. Stretç tarafından oosit toplamak için ince ağız cam pipetler hazırlayınhing cam Pasteur pipetler Bunsen beki gelen dikey bir alev (Şekil 1) üzerinden, (iki elinizle pipet uçlarını tutarak) yatay tuttu.
   1. Cam erimeye başladığında, alev dışarı pipetlemeyin almak ve istenen pipet elde etmek için hızlı bir çekme hareketi gerçekleştirin. Sıkıca uzunluğu ve iç kılcal çapını ayarlamak için tırnaklarıyla pipet dar noktasına yakın aşırı cam kesti. İnce kılcal oositin çapından biraz daha büyük ~ 100 um bir iç çapa sahip olduğundan emin olun (~ 80 mm).
   2. Ağız pipet, uygun ucu kullanılarak çekilen pipet aspiratör tüpün bir ucunu ve diş ile güvence, ağızda diğer ucunu yerleştirin.
4. Steril cımbız kullanarak yumurtalıkların toplamak ve bir hücre kültürü petri kabı (35 mm x 10 mm) altında bırakılması. M2 1 mi, daha önce 37 ° C 'de dengelenmiş ile örtünve% 5 _CO2 (Şekil 2).
5. Yavaşça M2 (Şekil 3) antral oosit serbest bırakmak için steril bir insülin şırınga iğnesi ile yumurtalıkların antral folikül delinme.
6. Yavaşça ağız folikül hücreleri ve diğer olası doku artıkları (Şekil 4A) kaldırmak ve daha sonra, daha önce (embriyo kültürü için uygun mineral yağ ile kaplanmış M2 küçük damla (20 ul) altındaki yerleştirilmeleri için dar bir Pasteur pipeti ile oosit Pipeti hazırlanmıştır; Şekil 4B).
   NOT: M2 çeşitli ve farklı damla ile sürekli pipetleme oosit zona pellucida bağlı tüm kümülüs hücreleri çıkarmak için önemlidir. Ortamın pH değişiklikleri önlemek için mümkün olduğunca çabuk bu adımı gerçekleştirin.

Hoechst33342 4. antral Oositler Boyama

NOT: Antral oositler SN (çevrili Nukleolus), NSN (Çekirdekçik çevrili değil) ya da ayırt edilebilirBaşka ara form olarak, Hoechst33342 ve supravital konsantrasyonu (veya bazlar için özel herhangi bir başka belirteçler AT) ¹⁴ boyandıktan sonra kendi kromatin organizasyonu dayalı. NSN dolayısıyla değil, adını yaparken aslında, SN oositlerin nucleolus etrafında Hoechst-pozitif halka göstermek.

Doğru oosit boyama için:

1. Karanlıkta 10 dakika boyunca 50 ng / ul supravital konsantrasyonda Hoechst33342 (20 ul) M2 seyreltildi damla bir ağız pipet kullanarak oosit aktarın.
2. Hoechst33342 ile inkübasyondan sonra, kromatin organizasyonu (SN ya SDİ) göre ayrılması için, mineral yağ ile kaplanmış M2 küçük damla (5 ul), alt kısmında bir ağız pipetle her bir oositin aktarın. Oosit kromatin yapılandırmasını görselleştirmek için Hoechst33342 filtresi (emisyon dalga boyu 486 nm) ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskop kullanın.
   Not: kullanılan floresan mikroskop türüne bağlı olarak, it görüntü elde etmek için cam alt petri kullanmak zorunlu hale gelebilir. 35 mm çanak için numune tutucu ile donatılmış konfokal mikroskopi Olympus Fluoview Fv10i bir 0.17 mm standart kalınlıkta ve kabul edilebilir 0.13 0.21 mm aralığında olan görüntü elde etmek için tek cam alt-yemekler gerektirir.
3. Olasılıkla, daha uzun 5-10 saniye varlığı veya çekirdekçik etrafında bir halka yokluğu (Şekil 5) görselleştirmek için yeterli zaman oosit Heyecanlandırırmı.
4. In vitro olgunlaşmayı teşvik veya moleküler veya hücresel analizler için uygun tamponlar tutmak _için% 5 CO 2 ve 37 ° C'de M2, kültür antral SN ve NSN oosit sıralama sonra.

Aşağıdaki resimler Hoechst33342 aracılığıyla Oositler 'sıralamaya pipetler hazırlanması başlayarak fare yumurtalıkların antral oosit izole etmek için kullanılan yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, oldukça basit ve bir CO2 kuluçka makinesi, bir stereomikroskop ile Hoechst33342 gözlenmesi için doğru bir filtre ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu ile donatılmış herhangi bir laboratuvar gerçekleştirilebilir Şekil 1 pipet hazırlanması oluşan bir başlangıç ​​basamağını gösterir. Cam olarak erime ve yumuşak olmaya başlar, pipet her iki ucu aynı zamanda, pipet alev üzerinden alınmalıdır, ayrılabilen ve gerekmektedir. Düzgün kalibre Alternatif olarak, eğer cam kapiller, aynı şekilde veya mikropipet çektirmenin kullanarak çekilebilir. Çok ince ise, oosit küçük kap içinde parçalanmış olabilir: doğru kılcal çapı doğru ağız pipet olması çok önemlidir, çünkü bu çok önemli bir adımdırIllary ve örneğin, oosit taşırken oosit içeren ortama uygun bir emiş kaybetmiş olabilir, çok büyük ise 2 Şekil. başka bir damlasından, birkaç dakika içinde ölür ve 3 antral oosit mekanik izolasyonu göstermek steril bir insülin iğne kullanılarak antral folikül gelen. Bunların bir sıvı ihtiva eden bir kavite veya antrum ile karakterize edilir, çünkü bu köklerinin tanımak oldukça kolaydır, bu granüloza hücreleri, ve oosit bulunur ve bu yolla farklı moleküllerdir ve dış ortamdan değiş tokuş edilebileceği ortamıdır. Bir kez izole, antral oosit Şekil 4A ve B'de gösterildiği gibi bir kez., Oosit çevreleyen somatik hücreleri çıkarmak için M2 orta başka bir damla transfer "soyulmuş" antral oosit sınıflandırma için hazırız. Şekil 5 son adımı gösterir olmalı Bu protokolün, o Hoechst33342 f izole antral oositlerin boyama olduğunuveya hızlı sıralama onların kromatin organizasyonu dayalı. Bu işaretleyici, örneğin, çok daha hızlı DAPI daha canlı hücrelerin lekeleri ve hücre yaşayabilirliğini korumak için supravital konsantrasyonunun (50 ng / | il) de kullanılmalıdır. Kromatin organizasyonu için hücre boyama muhtemelen bu protokolün en kritik adım: oosit çok uzun onlar zarar ve gelecek denemeler için kullanılamaz hale olabilir heyecanlı iseniz. Fare oosit uygulanan, genel olarak, bu (yöntem bölümünde belirtilenler hariç) özel önlemler gerekmez, basit bir yöntemdir. Bütün aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.

Cam Pasteur pipetler ve Bunsen beki kullanarak bir ağız pipet Şekil 1. hazırlanması. Thi büyük halini görmek için tıklayınızs rakam.

Şekil önceden ısıtılmış ve dengelenir M2 ortamı ile dolu petri 2. Bozulmamış yumurtalıkların. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Steril bir iğne vasıtasıyla antral folikül gelen antral oosit 3. İlk izolasyonunu Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Taze izole oosit Şekil 4. TransferiM2medium (B) önceden ısıtılmış küçük damla içeren farklı bir petri petri (A) ağız pipet ile ve dengelenir bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Oositler lekeli ve Hoechst33342 ile sıralanır. Konfokal mikroskop Olympus Fluoview Fv10i alınan NSN ve SN oosit Tek görüntüleri (büyütme 60X; bar: 10 um; PhC: faz kontrast). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur