Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Darbe Lazer Tahrik olma üzerine Altın Nanopartikül Entegre Fotoğraf duyarlı lipozomlar ve Bunların Mikro-kabarcık Kavitasyon Ölçülmesi Sentezi

7.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53619

⸱

24 Şubat 2016

 ,  ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

Bu makalede

Özet

Bu protokol piyasada mevcut malzemeler ile foto-duyarlı lipozomlar entegre altın nanopartikülüne için basit bir hazırlık yöntem açıklanır. Aynı zamanda darbeli lazer tedavisi üzerine sentezlenen lipozom mikro-kabarcık kavitasyon sürecini ölçmek için nasıl gösterir.

Özet

Işığa duyarlı nanopartiküller (NP'ler), ilaç salınımı üzerinde mekansal, zamansal ve dozaj kontrolü sağlama potansiyelleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, ilgili teknolojilerin çoğu hala geliştirme sürecindedir ve klinikler tarafından temin edilememektedir. Burada, bu ışığa duyarlı NP'lerin ticari olarak temin edilebilen altın NP'ler ve ısıya duyarlı lipozomlarla kolay bir şekilde üretilmesini açıklıyoruz. Kalsein, ısı / ışık stimülasyonu üzerine kapsülleme verimliliğini ve salım kinetik profilini değerlendirmek için bir model ilaç olarak kullanılır. Son olarak, bu foto tetiklemeli salınımın, hidrofon ile ölçülebilen mikro kabarcık kavitasyonunun neden olduğu zar bozulmasından kaynaklandığını gösteriyoruz.

Giriş

olasılık maksimize özgüllük ve minimal yan etkileri ile, spatial- temporal- ve dozaj kontrollü modası uyuşturucu teslim çekici bir şekilde dış uyaranlara kullanılarak ilaç salımını tetiklemek için. Eksojen uyaranlara duyarlı sistemlerin (ışık, manyetik alan, ultrason, mikrodalga radyasyon) geniş bir yelpazede arasında, ışık tetiklenen platformlar kliniklerinde onların non-invaziv, sadelik ve uyum sayesinde, caziptir. Geçtiğimiz on yıl içinde 1 Kapsamlı bir araştırma Ancak bu tür yakın kızılötesi ışık sorumlu altın gibi platform teknolojileri, çeşitli sağlamıştır (Au) nanocages akıllı polimerler ile kaplanmış, uyuşturucu, 3 ve kendini monte porphysome nanovesicles ile konjuge 2 fotoğraf kararsız, polimerik nanopartiküller (NPS). 4 bu teknolojiler geliştirme preklinik aşamalarında hala ve başlatılması ve cont sürecine dahil parametrelerin net bir anlayış ve optimizasyon gerektiririlaç salınımı döndürülmektedir.

Böyle bir sistemin hazırlanması için basit ve kolay erişilebilir yöntemlerden biri piyasada yaygın olarak bulunmaktadır ve yoğun klinik öncesi ve hatta klinik çalışmalarda araştırılmıştır her ikisi de termal duyarlı lipozomlar 5,6, Au NPS entegre etmektir. Küçük hayvanlarda veya insanlarda lokal uygulama için kullanıldığı zaman yakın kızılötesi aktive Au nano-(ör nanocages) göre kendi plasmonik dalgaboyunda Au NPlerin derin doku aktivasyonu sınırlama rağmen, bu sistem hala büyük ümit vaat etmektedir. 7 ışık tetiklenen serbest bırakılması için lipozomlar ile Au NPS birleştiren bazı erken çabalar vardır. 8-11 çoğu malzeme yenilik odaklanırken, erişilebilirlik ve ölçeklenebilirlik sorunları ele alınması gerekmektedir. Ayrıca, bu nanocarriers kullanarak serbest bırakma mekanizmalarına raporlar hala sınırlıdır.

Burada, fabrikasyonu fotoğrafın duyarlıeş zamanlı olarak ilaç ve hidrofilik Au NPS yüklü lipozomlar tarif edilmiştir. Kalsein Kapsülleme verimliliği ve sistemin salınım profilini değerlendirmek için bir model bileşik olarak kullanılır. Buna ek olarak, bu sistemde, Au, NPS tarafından emilen ışık lokal bir sıcaklık artışı ile sonuçlanan ısı şeklinde çevreleyen mikro ortama yayar. Hava mikrokabarcıklar lazer ısıtma esnasında üretilen ve lipozomlar (Şekil 1) mekanik bozulmasına yol açar. mikro-kabarcık kavitasyon mekanizması hidrofon ölçümleri ile teyit edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hazırlık

  1. Yuvarlak temiz 100 mi su regia (konsantre nitrik asidin 1 parçası (HNO 3) ve konsantre edilmiş hidroklorik asit (HCI) 3 ölçü) ve DI suyla şişeler yıkama ile taban şişe içine tartılır. şişeler Otoklav ve 15 dakika boyunca 100 ° C'de sıcak hava fırınında kurutun. Sarın ve kullanılıncaya kadar steril şişeler saklayın.
  2. % 70 etanol kullanılarak elle tutulan mini ekstruder kümesi sterilize edin.
  3. Döner buharlaştırıcı açın ve sırasıyla 37 ° C ve 4 ° C'de sıcak su banyosu ve soğutma kulesi sıcaklığını ayarlamak.
  4. 10 ml 0.1 mM, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (pH 7.4) içinde kalseinin 374 mg çözülmesiyle stok solüsyonu kalsein 60 mM hazırlayın. 1 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi kullanılarak pH 7.4 ayarlayın.

Lipozomların 2. sentezi

  1. Lipidler çıkarın (1,2-Dipalmitoyl- sn -glisero-3-fosfokolin (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroksi-sn -glisero-3-phosphochohattı (MPPC) ve 1, 2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanol-amin- N - [karboksi (polietilen glikol) -2000] (amonyum tuzu) (DSPE-PEG2000)) dondurucu (-20 ° C) ve RT onları çözülme.
  2. 15.9 mg DPPC, 1.3 mg MPPC ve 2.8 mg DSPE-PEG2000 tartılır. 2 ml kloroform bunları birbirine eritin.
  3. Steril yuvarlak tabanlı şişeye kloroform çözeltisini ve ince, kuru lipit tabakası oluşturmak için, düşük basınç altında döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılır.
  4. Aşama 1.4 ve 50 ul Au NP (3.36 x 10 ila 16 parçacık / ml) içinde hazırlanır kalsein 1.95 mi 60 mM ihtiva eden 30 dakika boyunca 2 ml sulu çözeltisi, 45 ° C lipid tabakası hidratı.
  5. 45 ° C'ye kadar ısıtma bloğu önceden ısıtın. Filtre destekleri arasında 200 nm polikarbonat membran filtre yerleştirin ve mini ekstruder setini monte. DI su ile potansiyel sızıntı kontrol edin.
  6. Aşama 2.4 ve extru gelen lipozom solüsyonu 1 ml şırınga içinde bir dolgumonte mini ekstrüderin diğer ucunda şırınga geçirilmesiyle örnek de. 11 kez tekrarlayın.
  7. bilgilerini Au NP, üreticinin protokolüne uygun olarak, yıkama sıvısı olarak PBS kullanılarak lipidler ve kalsein kaldırmak için, bir PD-10 tuz giderme kolonu boyunca sentezlenmiştir lipozomlar çalıştırın.
  8. 4 ° C'de steril tüplerde örnekleri saklamak ve 2 gün içinde kullanım.

Ile Isıtma Lipozomlar 3. Calcein Yayın

  1. Adım 2.2 DPPC, MPPC ve DSPE-PEG2000 molariteleri ekleyerek stok solüsyonu lipid molaritesi nedir. 0.1 mM, PBS tampon (pH 7.4) ile 5 mM lipit konsantrasyonuna lipozom stok solüsyonu ile seyreltilir. bir santrifüj tüpüne (2 mi) örnekleri aktarın.
  2. Bir sıcak su banyosu içinde tüp yerleştirin ve 25 ile 70 ° C arasında kademeli sıcaklığını yükseltir. Burada 1 ° C / dk bir oranda sıcaklık artışı.
  3. Farklı sıcaklık noktalarında (27, 32, 37, 39, 41 alikotları (10 ul) toplamak43, 45, 52, 57, 62, 67 ve 70 ° C).
  4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozomları sindirimi ve kalseinin tamamlanmış salımını elde etmek için burada liposomal çözelti% 2 Triton X-100-2 mi kısım 10 ul ekle.
  5. 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her oyuğa liposomal çözelti 200 ul aktarın ve bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak toplanan numunelerin fluoresans şiddetini ölçmek. kalsein eksitasyon ve emisyon dalga boyları sırasıyla 480 ve 515 nm.
  6. % 100 salınımı gibi, Triton X-100 ile muamele edilmiş örneklerde floresans yoğunluğu alarak, aşağıdaki formül kullanılarak, her bir zaman noktasında serbest kalsein yüzdesini hesaplayın:
    figure-protocol-1
    Ft, belirli bir zaman noktasında çözeltinin floresans şiddetidir. F i ve F x sırasıyla çözümün normalize ilk ve son floresan yoğunlukları vardır.

4. Calcein ReDarbeli lazer lipozomlar arasından kira

  1. kuartz küvete 100 ul lipozom çözeltisini ve bir küvet içine tutucuya yerleştirin. ışık kaynağı olarak 532 nm dalga boyunda 6 nsaniye bir darbe süresi ile: YAG lazer bir darbeli Nd kullanın. 1 Hz: Tekrar hızı - Lazer Parametreleri aşağıdaki kullanın Lazer enerji yoğunluğu: 1 mJ / cm2; Işın çapı: 0.5 mm.
  2. Işık lipozom solüsyonu geçer şekilde küvet ile dengesi ayarlanmış lazer ışını kılavuz ve çeşitli darbe sonrası alikotları toplar.
  3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozomları sindirimi ve kalseinin tamamlanmış salımını elde etmek için burada liposomal çözelti% 2 Triton X-100-2 mi kısım 10 ul ekle.
  4. kalsein göz önüne alındığında ışığa karşı duyarlıdır ve lazer deney beyazlatılabilir olabilir, önceden ölçülmesi lipozom serbest verileri normalleştirmek için kalsein çözeltisi üzerinde darbeli lazer ağartma etkisi.
    1. Spesifik olarak, kalsein çözeltisi (60 mM) darbeli lazer wi maruzDarbe numaraları (0, 25, 50 ve 100) değiştirmek için 1 Hz inci frekans. önce ve lazer maruz kaldıktan sonra, sırasıyla, 480 ve 515 nm uyarma ve emisyon dalga boyları ile kalsein floresan yoğunluğu ölçmek.
    2. ağartma miktarını (özgül darbe sayıdan sonra kalsein lazer pozlama / floresan yoğunluğu önce kalsein floresan yoğunluğu) hesaplayın. faktörlü lipozomlar floresans yoğunluğu çarparak lipozom örneklerinden elde edilen değerlerini normalize bu faktör kullanın.
  5. sırasıyla, 480 ve 515 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak toplanan numunenin fluoresans şiddetini ölçmek.
  6. % 100 salınımı gibi, Triton X-100 ile muamele edilmiş örneklerde floresans yoğunluğu alarak, aşağıdaki formül kullanılarak, her bir atım sayısı tahliye kalsein yüzdesini hesaplayın:
    figure-protocol-2
    Ft normalleşme sonra belirli bir darbe sayıda çözümün floresan yoğunluğu. F i ve F x sırasıyla çözümün normalize ilk ve son floresan yoğunlukları vardır.

Basınç Impulses 5. Ölçüm

  1. mikroskobik slayt üzerinde numune 100 ul koyun ve örnek üzerine lazer odağı ayarlayın.
  2. solüsyon içine bir iğne Hidrafon (1 mm çapında ve 450 NV / Pa hassasiyet) daldırın.
    Dikkat: hidrofon zarar görmesini önlemek için, lazer ışığı ile aydınlatılmış edilmemelidir.
  3. değişen darbe numaraları (0-100) ve nabız enerji (20-160 μJ / darbe) ile darbeli lazer ile örnek ışın tedavisi.
  4. Dijital osiloskop kullanarak basınç sinyallerini kaydeder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

10: 4 ya da 7.95: Lipozomlar 86 mol oranında DPPC, MPPC ve DSPE-PEG2000 ile geleneksel bir ince film hidrasyon tekniği kullanılarak hazırlandı 0.65. 1.39 mg / ml 12 Au NPlerin boyutu ışık belirlenmesi önemlidir aşağıdaki lazer ikaz deney sırasında dönüşüm verimi ısı. Au NPS küçük boyutta yüksek 13 Böylece 5 nm Au NPS, satıcıdan küçük numuneler, kapsülleme için seçildi. Nakleden verimliliktir. Sentez sırasında, hidrasyon Au NP içeren ortam ve daha sonra serbest kalse...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İnce film hidratasyon Lipozomların elde edilmesi için geleneksel bir yöntemdir. Organik çözücü (bu durumda kloroform), ilk şişenin üzerine ince bir lipid filmi oluşturmak için 37 ° C'de bir döner buharlaştırıcı içinde lipitleri yok etmek için kullanılan ve daha sonra çıkarıldı. Bu lipid filmi 60 mM Calcein ve 5 nm ve Au NP içeren sulu bir çözelti ile hidre edilmiştir. Hidratlama işlemi sırasında, sıcaklık 50 ° C civarında muhafaza edildi ve şişe sürekli balon döndürülerek çalkalandı. Bu aşamada önemli buharlaştırılm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

herhangi bir çıkar çatışması beyan edilir.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Milli Eğitim Singapur Bakanlığı (CX için RG 64/12) ve Nanotıp NTU-Northwestern Enstitüsü tarafından Tier-1 Akademik Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-Dipalmitoil-sn< / em>-glisero-3-fosfokolin (DPPC) Avanti Polar Lipidler (Alabama, ABD)850355PTozu, -20 ° C'de saklayın; C
1-palmitoil-2-hidroksi- sn< / em>-glisero-3-fosfokolin (MPPC)Avanti Polar Lipidler (Alabama, ABD)855675PTozu, -20 ° C'de saklayın; C
1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanol-amin-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipidler (Alabama, ABD)880120PTozu, -20 °C'de saklayın; C
Altın NanopartiküllerSigma Aldrich752568-100mL5   nm parçacıkları, 0.1&1 ° C'de stabilize edilmiştir; mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60  mM, pH 7.4 (NaOH kullanılarak ayarlanır)
fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
Çift damıtılmış suMillipore Milli-DI su arıtma sistemi
Triton X100   Sigma, Yaşam BilimleriX-100Toplam kapsüllemeyi hesaplamak için lipozomları bozmak için
Rotavapor   Buchi (İsviçre)R 210Liposome hazırlama için kullanılır
Isıtma banyosuBuchi (İsviçre)B 491Liposome hazırlama için kullanılır
Vakum Kontrol Cihazı   Buchi (İsviçre)V-850Liposome hazırlama için kullanılır
Vakum PompasıBuchi (İsviçre)V-700Liposome hazırlama için kullanılır
Sıcaklık kontrollü devridaim banyosuPolyscienceLiposome hazırlama için kullanılır
Isıtma bloklu mini ekstruder tertibatı Avanti Polar Lipids (Alabama, ABD)610000Lipozomların ekstrüzyonu için kullanılan
Şırıngalar, 1.000 &# 956; lAvanti Polar Lipids (Alabama, ABD)610017Lipozomların ekstrüzyonu için kullanılır
Polikarbonat filtre membranı, 200  nmWhatmann800281Lipozomların ekstrüzyonu için kullanılır
Filtre DesteğiAvanti Polar Lipids (Alabama, ABD)610014Lipozomların ekstrüzyonu için kullanılır
PD 10 Tuz giderme kapları, Sephadex G-25 ortaGE Sağlık, Yaşam bilimleri17-0851-01Lipozomları saflaştırmak için kullanılır
Santrifüj   Sigma Laboratuvar Santrifüjleri3K30Lipozomal çözeltiyi konsantre etmek için kullanılır 
RotorSigma19777-HLipozomal çözeltiyi konsantre etmek için kullanılır 
Zetasizer   Nano ZS MalvernLipozom boyutu ve zetapotansiyel tayini için kullanılır
UV-Görünür SpektrofotometreShimadzuUV-2450Numunelerin absorbansını ölçmek için kullanılır
Floresan Spektroflorometre ve nbsp;  Moleküler CihazlarSpectraMax M5Numunelerin floresan emisyonunu ölçmek için kullanılır
Nd:YAG LazerNewWave Research532 nm; Maksimum güç: 17  mJ; Genişlik: 406  Nsec; Numune ışınlaması için kullanılır
HNR HidrofonONDAHNR-10001 mm çap ve 450 nV/Pa hassasiyet, Uygun çalışma frekansı aralığı: 0.25-10  Mhz; Kalibrasyon: 50  mV/Çubuk; Akustik sinyalleri ölçmek için kullanılır
Dijital OsiloskopLECORY - Dalga Koşucusu 64Xi-AFrekans: 600 MHz; Maksimum örnekleme hızı: 10  Gs/sn (iki kanalda); Ölçülen akustik sinyalleri kaydetmek için kullanılır

Kaynaklar

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796(2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipozom SenteziFoto yan tl Nanopartik llerKalsein Sal n mFloresan l mHidrofon Alg lamasLipozom Ekstr zyonuS cakl k Stim lasyonu
Darbe Lazer Tahrik olma üzerine Altın Nanopartikül Entegre Fotoğraf duyarlı lipozomlar ve Bunların Mikro-kabarcık Kavitasyon Ölçülmesi Sentezi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.