Yöntem makalesi

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

DOI:

10.3791/53638

⸱

25 Ocak 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare derisinin besin açısından zengin ortamda enzimatik sindirimini ve ardından lökositleri izole etmek için gradyan ayrımını tanımlar. Bu şekilde türetilen hücreler, çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu, doku ayrışma makinelerine ve daha sert tripsin ve dispas bazlı doku sindirim protokollerine etkili, ekonomik ve gelişmiş bir alternatiftir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin derisinin tek hücreli bir süspansiyona ayrılması, cilt iltihabının kemirgen modellerinde sızan bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonu gibi aşağı akış hücresel analizi için gereklidir. Burada, fare derisinin kollajenaz D ile besin açısından zengin bir çözelti içinde sindirimi için bir protokol açıklıyoruz, ardından süreksiz bir yoğunluk gradyanı kullanılarak hematopoietik hücrelerin ayrılması geliyor. Bu şekilde elde edilen hücreler, in vitro çalışmalar, in vivo transfer ve akış sitometrisi dahil olmak üzere diğer aşağı akış hücresel ve moleküler analizler için kullanılabilir. Bu protokol, fenotipik karakterizasyon veya hücresel fonksiyon ile ilgili yüzey proteinlerinin hücresel canlılığını veya yoğunluğunu tehlikeye atabilen pahalı mekanik ayrıştırıcılara, özel ayırma kolonlarına ve daha sert tripsin ve dispas bazlı sindirim yöntemlerine etkili ve ekonomik bir alternatiftir. Burada temsili verilerimizde gösterildiği gibi, bu protokol yüksek derecede canlı hücreler üretti, spesifik bağışıklık hücresi alt kümeleri içeriyordu ve akış sitometrik analizinde kullanılan ortak yüzey işaretleyici proteinlerin bütünlüğü üzerinde hiçbir etkisi yoktu.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontakt dermatit, egzama, sedef hastalığı, selülit, melanom dışı cilt kanserleri için mantar enfeksiyonları ve apseler arasında değişen cilt koşulları dünya çapında 50 en yaygın hastalıklar arasında olduğu tespit edildi ve 2010 yılında 1 ölümcül olmayan hastalıkların dördüncü önde gelen global neden olur. Buna göre, çeşitli cilt patolojilerin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması araştırma gerekli ve etkin bir alandır. Kemirgen modellerinde, atopik dermatit 2, sedef hastalığı 3 ya da Staphylococcus aureus enfeksiyonu 4 gibi enflamatuar cilt hastalıklarının anlaşılması son derece yararlı olmuştur. Fare deri dokusunun enzimatik sindirimi için, ucuz, etkili ve basit bir protokol daha iyi cilt hastalıklarının patofizyolojisi anlamak için alt çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hücre preparatları sağlayabilir. Burada, basit ve ekonomik bir yöntem, sıçan derisine enzimatik sindirimi için açıklanandoku ve hücre kültürü, in vivo adoptif transfer için kullanılabilecek cilt süzücü lökositlerin izolasyonu, sitometrik analizi ve ayırma ya da gen ifade etüdlerinde akar. Bu prosedürün genel amacı, tipik olarak, özel reajan takımına ve mekanik dissociators ile ilişkili maliyetlerin en aza düşürülmesini yüksek hücre canlılığı cilt nüfuz eden lökositler için tek bir hücre süspansiyonu hazırlamaktır.

Mevcut cilt dokusu ayrılma yöntemleri 5-7 düşük hücre canlılığı ve yüzey işaretleyici bütünlüğü neden veya özel enzim kitleri ve pahalı doku ayrılma makineleri 8-11 gerektirebilir. Fare kulak cilt dokusunun sindirim makul 12-13 yaygın yüksek keratinize deri dokusu sindirim ise (örneğin zayıf) hücresel olmayan kalıntı büyük miktarda kirlenmiş hücre hazırlama neden olabilir. Yeni bir çalışmada, Zeyd ve arkadaşları 2.5 mg 90 dakika fare böğür cildi sindirilmiş / ml dispase, Follo3 mg / ml kollajenaz 7 45 dakika ile evli. Başka bir çalışmada, araştırmacılar, bu tripsin / EDTA, kolajenaz III kullanımı da dahil olmak üzere, 2.5 saat bir araya sindirimi ile birden inkubasyon kullanılan ve 5 dispaz. Farklı üreticilerin tripsin ile tedavi ölçülebilir memeli hücreleri 14-15 hücre yüzey proteinlerinin bütünlüğünü etkilediği gösterilmiştir gibi tripsin kullanımı enzimatik cilt sindirimi için tavsiye edilmez. Buna ek olarak, dispaz, CD4 ve CD8α T hücrelerinin çoğalma yetenekleri üzerinde önemli etkilere sahip olabilir ve örneğin CD62L 16 ortak T lenfosit aktivasyonu da dahil olmak üzere, en az 20 moleküllerinin yüzey bolluk etkiler. Diğer protokoller sindirim ortamında 6 RPMI 1640 kullanır. Bununla birlikte, RPMI Mg + 2 ve Ca + 2 varlığı detaylı yuvar toplanmasını 17 neden olabilir.

Doku ayrışma için ideal bir protokol, yüksek hücre canlılığı, düşük hedeflemelidirHücre toplama ve en az zarar seviyesi hücre yüzeyine. Yüksek kaliteli lenf nodu stromal hücre preparatları kısa enzim inkubasyon, Ca 2 + ve Mg 2 + ücretsiz medya kullanımı protokoller ile gerçekleştirilir ve tripsin önlemek ve 18 dispase oylandı. Bununla birlikte, bu tip protokolleri bütün sıçan derisine ayrışması için tesis edilmemiştir.

Burada, bir protokol, ayrışır izole ve alerjen-fare meydan yan yüz derisinden deri süzücü lökositlerin zenginleştirmek için tarif edilmektedir. Kısaca, deri kesilir sindirimi için doku yumuşatmak ve herhangi bir fazla ölü deri ya da yağlı doku kaldırmak için 1 saat süre ile,% 10 fetal bovin serumu içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde önceden inkübe edilir. Bu 0.7 mg ile 30 dakika enzimatik sindirim aşaması izlemektedir / ml kollajenaz D kollajenaz D yapma, en az hücre yüzeyi markerlerinin yoğunluğu üzerindeki etkileri ve in vitro 16,18 T hücresi çoğalması üzerinde bir etkisi yokturyüzey proteinleri karakterizasyonu içeren uygulamalar için son derece uygundur. Enzimatik sindirim takiben, aralıklı yoğunluk gradyan santrifüj tek hücre süspansiyonu epitel hücreleri ve atıklar giderilmiştir ve hematopoietik hücrelerin zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Önemli olarak, bu prosedür pahalı sütunlara göre manyetik hücre ayrıştırma reaktifler ve doku ayrılma makineleri 8-11 önler ve bir bazik biyomedikal araştırmalar laboratuarında bulunan ekipman ve malzeme ile yapılabilir. Aşağıda, bu protokolü (19 uyarlanmıştır) önceden duyarlılaştırılmış ND4 İsviçre farelerinde hapten oksazolon (Ox) ile yan yüz derisinden meydan üç kez lökositleri izole etmek için kullanılmıştır. Hücreler çok parametrik akış sitometri kullanılarak analiz edildi. Bu teknik, minimum enkaz ve sitometri etkilenen sk fazla miktarda T lenfositleri ve nötrofiller infiltrasyonu ölçmek için çok parametre akış sitometrisi ile analiz edilmiştir izole edilmiş lenfositlerin>% 95 canlılık ile bir hücre süspansiyonu elde edildiiçinde.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: geleneksel gıda ve suya serbest erişim ile yer 8-12 haftalık dişi ND4 Swiss Webster fareleri, bu çalışmalar için kullanılmıştır (B13S1) deneysel protokol kullanılır; Macalester College IACUC tarafından onaylandı..

Oksazolon ile 1. Hassasiyet ve Mücadelesi

  1. Gün 0
    1. 4 L kapaklı cam kavanoz dibinde örgü altına yerleştirilen emici havlu 3 ml izofluran ekleyerek anestezi odasına hazırlayın. Denek uyuşturulduktan kadar burada kullanılan ND4 dişi fareler için, odasında süresi 30-60 sn; fare suşu kullanılan anestezik yönetimini optimize edin.
    2. Her anestezi farenin sırtını Tıraş ve bir hayvan saç düzeltici kullanarak kanadını.
  2. 1.gün
    1. Mutlak etanol içinde 4-etoksimetilen-2-fenil-2-oksazolin-5-on (Ox) içindeki bir% 2 solüsyonu yapmak ve bir inkübatör içerisinde dönen bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
    2. Kısaca uyutmak1.1.1 açıklanan ve yaklaşık 20 ul her birkaç seri uygulamalar geri traş% 2 Ox 100 ul uygulamak olarak izofluran anestezi ile fareler. Kuru çözelti seri uygulamalar arasında 5-10 saniye bekle.
    3. Arka dışındaki bölgelerde% 2 Öküz çözümü dökülmesini önlemek ve uygulamalar arasında kurumasını çözüm beklemek için özen gösterin.
  3. Gün 5-7
    1. Mutlak etanol (Ox) bir% 1 çözeltisi olun ve bir inkübatör içerisinde dönen bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
    2. Nazikçe ama sıkı yukarı bakacak şekilde karın boyun ve kuyruk tabanı ense de fare hareketsiz ve boyun hafifçe (intraperitoneal enjeksiyon için bir beklemeye benzer) aşağıya doğru eğik ve birkaç seri uygulamalarda traş kanadını% 1 Ox 100 ul uygulamak Yukarıda tarif edildiği gibi zaman alan daha sonra kuru cilt.
    3. Kontrol fareleri için, traş turta mutlak etanol araç 100 ul geçerlidirk.

2. Kanat Cilt Hasat

  1. Karbon dioksit inhalasyonu ile fareler Euthanize, ve dikkatli bir şekilde 10 cm, cerrahi makas ile cenah derinin (~ cilt 25 mm x 25 mm) istenen alanı tüketim.
  2. Temiz, keskin cerrahi bıçak kullanarak, gögüs cilt aşırı yağ ve bağ dokusu kazınması.
  3. Kalsiyum ya da magnezyum, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), olmadan fenol kırmızısı 10 mi RT HBSS [ihtiva eden bir 50 mL konik tüp içine 3 fareden cenah cilt 3 parçalarını yerleştirin 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1 piperazinetansülfonik asit (HEPES), ve% 10 cenin sığır serumu (FBS)].

3. Ön sindirim Doku Yıkama

  1. 37 ° C 'de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner levha üzerine deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü.
  2. İnkübasyon süresinin sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye vorteksleyin.
  3. 70 um ve tüp içeriğini süzünsüzgeç yıkama tamponu atmak ve doku toplamak. Tek bir süzgeç, bir biyolojik tedavi grubu içinde tüm işlem boyunca yeniden kullanılabilir.
  4. Forseps bir çift kullanılarak, (yukarıda tarif edildiği gibi EDTA, HEPES ve FBS ihtiva eden) taze RT HBSS ortam 10 ml içeren, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp içine süzgeçten cenah deri aktarın.
  5. Doku Ortalama bir alanında yaklaşık 2.2 mm x 2.2 mm olacak şekilde bir tüp içine daldırılmış bir cerrahi kesme makası bir 12.5 cm çifti ile, cenah derinin her parça kıyma.
  6. 37 ° C 'de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner levha üzerine deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü.
  7. İnkübasyonun sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye vorteksleyin

Derinin 4. kollajenaz sindirimi

  1. , 70 mikron süzgecinden tüpün içeriğini süzün toplamak ve yeni bir 50 ml konik içeren tüp 10 ml fre içine gögüs deri parçalarını aktarmaksh, RT HBSS ortam 0,7 mg ile takviye / D kolajenaz ml
  2. 37 ° C 'de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner plaka sindirim orta ve deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü.
  3. İnkübasyonun sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye için tüpün vorteks içeriği.
  4. Yeni 50 ml konik tüp içine 70 mikron süzgecinden tüpün Filtre içeriği; sindirilmiş doku içeren Flow-through tutmak ve süzgeci atmak ve cilt enkaz kanadını.
  5. 350 g'da 5 dakika için HBSS ortamı, santrifüj 50 ml akış yoluyla yıkayın ve süpernatant süzün.

5. Yoğunluk Gradient Santrifüj

  1. Serolojik bir pipet kullanarak, her bir örnek için, yeni bir 15 ml'lik konik bir tüp içine 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 3 mi% 67 RT yoğunluk gradyan santrifüj ortamı eklenir.
  2. Fenol kırmızısı ile HBSS 5 ml RT% 44 yoğunluk gradyan santrifüj medya hücre pelletini.
  3. Centilmenly tabakası serolojik bir pipet kullanarak 67% yoğunluk gradyan santrifüj ortam numunesi üzerine hücreleri ihtiva eden% 44 yoğunluk gradyan santrifüj ortamı 5 mi. Yavaş hıza pipet ayarlayın ve konik tüp duvar boyunca pipet yerleştirmek için emin olun. , Sallamak için dikkatli olun bozabilir veya degrade ters çevirin.
  4. En düşük ayara hızlanma, santrifüj dengeli olduğundan emin olduktan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 931 xg'de degrade frenini boşa ve santrifüj.
  5. Santrifüj işleminden sonra, dikkatlice santrifüj degrade kaldırmak ve yavaşça dik tüp tutan laboratuar tezgah ulaşım. Bir 5 ml'lik plastik transfer pipeti kullanarak, yeni bir 15 ml'lik konik tüpe 44 ve% 67,% yoğunluk gradyan santrifüj ortam transfer arayüzünde hücre tabakasını çıkarın. Arabirim görünmüyorsa, sadece% 67 -44% sınırında sıvının yaklaşık 2 ml kaldırın.
  6. Entegrasyon hücreleri içeren konik tüp doldurun% 2 1X buz soğukluğunda PBS FBS, 350 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri ve süpernatant süzün ile rface.
    Not: sindirim adım 37 ° C 'de ve yoğunluk gradyan santrifüj ortam adım oda sıcaklığında olduğundan bu hücreler soğutulabilir ilk defa / soğuk tutulur. Hücreler 1 içinde yeniden süspanse edilebilir: 1 tripan mavisi seyreltme ve sayısı ve canlılığı bilgileri bu noktada elde edilebilir.

6. Engelleme ve Boyama Akış Sitometrik Analizi

  1. Blok FcyRII / non-spesifik antikor lekelenmesini önlemek için hücreleri III reseptörleri. Konjuge olmayan bağlanma CD16 / 32 (2.4G2) karşı antikor ve bir blok FcyRII / III reseptörlerinin 100 seyreltme: Burada tarif edilen deneyler için, 1 ihtiva eden% 2 FBS içeren PBS antikor ana karışımları yapmak.
  2. CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (karşı antikorların uygun ana karışımları ile bloke hücreleri inkübe 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) ve Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), hem de parlak mor 510 ölü / canlı leke ölü hücreleri tanımlamak için. Seyreltme üreticileri tarafından tavsiye edilen veya daha önce araştırmacılar tarafından optimize bütün antikorları kullanın. 100 seyreltme: Burada tarif edilen deneyler için, 1 tüm antikorlar kullanılır.
  3. % 2 FBS ile 50 ul 1X PBS tampon boyama hücreleri ve tekrar süspansiyon yıkayın. Floresan verileri bir akış sitometresinde elde edilebilir kadar buz üzerinde tutun.
    Not: dengeleme parametreleri floresans veri edinimi önce lemfoid doku ve (CD4 ya da CD8'e gibi), ortak bir hücre yüzey antijeni ile önceden iyileştirilmiş olması önemlidir.
  4. , Sitometri analizi alt akış hücre sayısını arttırmak boyanmış hücrelerin tüm numunelerden veri elde etmek için.

7. Aşağıda belirtilen adımları Tamamladılar standart metodlar kullanılarak Sitometrisi Verileri Analiz

  1. Ileri dağılım lenfosit bölgeye Birincisi, kapıyan dağılım (bölge) arsa göre (bölge).
  2. Ardından, çiftleri analiz önlemek için yan dağılım (genişlik) ileri dağılım (genişlik) kullanarak tek hücre seçin. Bu aynı zamanda, yana saçılım yüksekliği noktalaması ile ileri saçılma yüksekliği ile gerçekleştirilebilir.
  3. Daha sonra, soyu üzerindeki kapısı (CD11b, CD11c, CD45R ve / B220) artı ve CD3-pozitif olaylar, dışlamak için makrofajlar, dendritik hücreler ve B hücreleri, sırasıyla, ve hedef ise, confine, T hücre bölmesine analizleri, Burada olduğu gibi, T hücrelerinin infiltre değerlendirmek.
  4. Sonraki canlı / ölü leke hariç, canlı hücreler üzerinde kapısı.
  5. Son olarak, ilgi hücre popülasyonu üzerinde kapısı (temsilcisi sonuçları bölümüne bakınız).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kollajenaz D ortam ile muamele edilmiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında splenositler T hücreleri üzerindeki CD4 ve CD8 a benzer seviyelerde göstermektedir tedavi
İlk olarak, T hücre alt üzerinde soy ve aktivasyon belirteçlerinin sıklığı ve yüzey bolluk kollajenaz D olası etkileri kontrol olarak ikincil lenfoid doku kullanılarak değerlendirildi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopik dermatit veya sedef hastalığı gibi deri hastalıklarının, kemirgen modellerinde deri lökositlerin değişiklikleri karakterize enflamatuar hücre influksu ve hastalık patolojisi arasında mekanik bağlantılar anlamak için önemlidir. Burada en biyomedikal araştırma laboratuvarlarında bulunan temel donanımları ile cilt dokusundan lökosit izole etmek için ekonomik bir tekniği açıklar. Bu nispeten hızlı bir tekniktir laboratuarlarında zamanında eller en aza indirerek kaynaklarını korumak için yardımcı pahalı doku ayrılma m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa etmek mali ya da diğer çıkarları hiçbir var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH DC R15 NS067536-01A1), Ulusal Vulvodini Derneği (DC ödül) ve Macalester College bu işi destekledi. CB Arnold ve Mabel Beckman Vakfı tarafından finanse Macalester College Beckman Scholars Programı, bir burs aldı. BTF ve TM JDRF 2-2011-662 tarafından desteklenmektedir. Biz teknik danışmanlık Dr. Jason Schenkel ve Dr. Juliana Lewis teşekkür ve onların yardım ve destek için Chatterjea laboratuar tüm mevcut ve eski üyeleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fenol kırmızısı içeren, kalsiyum içermeyen, magnezyum içermeyen, sıvı SigmaAldrich55021CHBSS Kullanım gününe kadar steril tutunuz.
HEPES, ≥ %99,5 (titrasyon)Sigma AldrichH3375
EDTA disodyum tuzu çözeltisiSigma AldrichE7889Kullanım gününe kadar steril tutun.
Fetal Sığır Serumu, USDA, Isı İnaktive Edilmiş, Premium SelectMidSciS01520HIKullanım gününe kadar steril tutun.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25 derece; C)Sigma AldrichP1644Steril tutun. Percoll'un kullanımdan önce steril 10X PBS ile izotonik hale getirilmesi gerekir.
Düzeltici Combo KitiKent ScientificCL9990-1201 Böğrü ve sırtı tıraş etmek için daha büyük düzelticiyi kullanın.
4-Etoksimetilen-2-fenil-2-oksazolin-5-onSigma AldrichE0753-10G50 ° C'de% 100 EtOH içinde çözülür; Dönen bir plaka üzerinde 15 dakika C.
Saflaştırılmış anti-fare CD16 / CD32 (2.4G2)Tonbo Biosciences70-0161için antikor boyama sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını bloke etmek için kullanılan antikor
;-BV650 (145-2C11)Becton Dickinson564378Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)eBioscience47-0042-80Akış için hücreleri boyamak için kullanılan antikor sitometri
anti-CD8&alfa;-BV785 (53-6.7)BioLegend100749Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)eBioscience48-0112-80Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-CD11c-eFluor450 (N418)eBioscience48-0114-80Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
, anti-CD44-BV711 (IM7)Becton Dickinson563971Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-CD45-FITC (30-F11)Tonbo Biosciences35-0451-U025Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)eBioscience48-0452-80Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)BioLegend104431Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
anti-Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) -PE (RB6-8C5)BioLegend108407Akış sitometrisi için hücreleri boyamak için kullanılan antikor
Hayalet Boya-BV510Tonbo Biosciences13-0870-T100Akış sitometrisi için canlılık boyası
LSR FortessaBecton DickinsonN/AHücre analizörü (18 parametre)
Clostridium'dan Kollajenaz D histolyticumRoche Applied Science,HBSS'de fenol kırmızısı, kalsiyumsuz ve magnezyumsuz olarak 5 mg / ml'de aliquot liyofilize enzimi 1 mL alikotlara 11088858001. Hemen -20 ° C'de saklayın; Altı aya kadar C.
ND4 İsviçre dişi fareleriHarlan0-328-12 haftalık; geleneksel olarak yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile barındırılır ve Macalester College'ın IACUC yönergelerine göre kullanılır.
Akış sitometrisi anti-CD3 ve epsilon , , , , ,,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673(2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cilde nfiltre Olan L kositlerEnzimatik SindirimYo unluk Gradyan ile Ay rmaKollagenaz D SindirimiAk Sitometrisi AnaliziMurin Cilt DisosiasyonuHematopoetik H cre zolasyonuKesikli Yo unluk GradyanTrypan Blue Ekskl zyonuCD45 Pozitif H creler

İlgili makaleler